Hinokiflavone   中文名称: 扁柏双黄酮

Natural biflavonoid; matrix metalloproteinases (MMPs); pre-mRNA splicing
SENP1 (Sentrin-specific protease 1) – Hinokiflavone inhibits SENP1 catalytic activity in vitro (no IC50/Ki reported; tested at 500 μM shows clear inhibition). [1]

桧木黄酮调节细胞内的剪接过程。桧木黄酮抑制剪接体B复合物的组装。桧木黄酮阻断细胞周期进程。桧木黄酮改变部分剪接因子的核内结构。桧木黄酮促进SUMO的核内重定位。[1]

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体外实验表明，桧木黄酮可降低结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并促进其凋亡。[2]

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桧木黄酮抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）USA300菌株的ClpP活性，IC50值为34.36 μg/mL。进一步的实验表明，桧木黄酮通过抑制多种毒力因子的表达来降低金黄色葡萄球菌的毒力。细胞热转移实验 (CETSA)、热位移实验 (TSA)、局部表面等离子共振 (LSPR) 和分子对接 (MD) 实验的结果表明，桧木黄酮可直接与 ClpP 结合，并已确定其对接位点，包括 SER-22、LYS-26 和 ARG-28。[3] 桧木黄酮可提高 SUMO 化蛋白的水平。桧木黄酮可抑制 SENP1 的活性。在用桧木黄酮处理的细胞提取物中，SUMO 化剪接因子在不溶性组分中积累。

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桧木黄酮 在基于非放射性 RT-PCR 的体外剪接实验中，以 500 μM 的浓度抑制 HeLa 细胞核提取物中 Ad1 和 HPV18 E6 前体 mRNA 的剪接（具有强抑制作用）。体外抑制剪接的最低浓度为 50 μM。 [1]
桧木黄酮抑制剪接体组装：在用Ad1前体mRNA进行的放射性体外剪接反应中，用500 μM桧木黄酮处理可阻断B和C剪接体复合物的形成；在天然琼脂糖凝胶上仅检测到H/E和A复合物，表明A复合物向B复合物的转变失败。[1]
桧木黄酮在体外增加蛋白质SUMO化水平：在剪接条件下，将HeLa细胞核提取物与100、300或500 μM桧木黄酮于30°C孵育90分钟，结果显示，与DMSO对照组相比，高分子量SUMO1和SUMO2/3修饰蛋白的含量呈浓度依赖性增加（通过免疫印迹法检测）。 [1]
桧木黄酮抑制纯化的重组SENP1（氨基酸415-643）活性：在以SUMO化YFP-RANGAP-ECFP-SUMO2为底物的凝胶活性测定中，与DMSO对照组相比，500 μM的桧木黄酮显著抑制SENP1异肽酶活性。其他双黄酮类化合物（阿魏酸黄酮、柏木黄酮、异银杏黄酮、松香素）在相同浓度下表现出不同程度的抑制作用，其中阿魏酸黄酮也表现出强烈的抑制作用。 [1] DARTS（药物亲和力响应靶点稳定性）实验表明，桧木黄酮与 SENP1 结合：将重组 SENP1 片段与 500 μM 桧木黄酮或 DMSO 孵育，然后用蛋白酶（16–200 μg/ml）消化。在桧木黄酮存在下，SENP1 对蛋白酶消化的敏感性增加，表明二者存在直接相互作用。[1] CETSA（细胞热迁移实验）实验表明，桧木黄酮与 SENP1 结合：将 HeLa 细胞核提取物用 500 μM 桧木黄酮或 DMSO 处理，加热至 30°C 至 50°C，然后进行超速离心。在 DMSO 对照组中，SENP1 在 43°C 以下仍保持溶解状态；在桧木黄酮存在的情况下，在所有测试温度下均未检测到可溶性SENP1，表明其热稳定性降低。[1]
桧木黄酮可改变人细胞系（HeLa、HEK293、NB4）中的选择性剪接：用10、20或30 μM的桧木黄酮处理24小时（NB4细胞还测试了0.5、1、2.5、5 μM的桧木黄酮）会导致MCL1、NOP56、EIF4A2、FAS、HSP40、RIOK3、ACTR1b和DXO前体mRNA发生变化，这些变化可通过半定量RT-PCR检测到。其影响包括外显子跳跃、内含子保留和选择性剪接位点的使用。在HeLa和HEK293细胞中，桧木黄酮促进MCL1外显子2跳跃（促凋亡异构体）；在NB4细胞中，出现了多种异常的MCL1亚型。[1]
桧木黄酮可阻断细胞周期进程并诱导细胞凋亡：用10、20或30 μM的桧木黄酮处理HeLa、HEK293和NB4细胞24小时（NB4细胞也可用0.5–5 μM处理），碘化丙啶染色和流式细胞术结果显示，细胞周期阻滞和/或细胞死亡呈浓度依赖性。NB4细胞在暴露于10 μM的桧木黄酮 24小时后，大部分细胞发生凋亡。 [1]
桧木黄酮改变剪接因子的核内结构：用20 μM桧木黄酮处理HeLa细胞24小时后，早期剪接体因子（SRSF2、U1A、DDX46、U2AF65、SF3B1、SR蛋白）重新定位到增大的“巨型斑点”（大小为0.5–4 μm，每个细胞10–30个），而晚期组装因子（CDC5L、PLRG1、BCAS2、PRP19、CTNNBL1、snRNP200）则保持弥散状态。Cajal小体被破坏；coilin、SMN、TMG-cap、Y12、SNRPA1重新定位到巨型斑点；CDK和fibrillarin仍留在核仁中。 [1]
桧木黄酮导致胞质多聚腺苷酸化RNA的丢失和在核巨核斑中的积累：用10–30 μM的桧木黄酮处理HeLa细胞4–24小时后，通过Cy3-Oligo dT荧光原位杂交(FISH)显示多聚腺苷酸化RNA在巨核斑中聚集；在30 μM浓度下处理24小时后，多聚腺苷酸化RNA出现在巨核斑边缘的小斑点中。[1]
桧木黄酮促进SUMO1和SUMO2/3向巨核斑的重新定位：用20 μM的桧木黄酮处理HeLa细胞2小时或24小时后，通过免疫荧光显示SUMO1和SUMO2/3与SRSF2在扩大的核巨核斑中共定位。 [1]
桧木黄酮可增加细胞内SUMO化：用10、20或30 μM的桧木黄酮处理HEK293细胞24小时后，免疫印迹分析显示高分子量SUMO1和SUMO2/3修饰蛋白增加，而泛素和NEDD8的结合水平略有下降。在HeLa和NB4细胞中也观察到类似的增加。[1]
桧木黄酮可增加定量SILAC蛋白质组学鉴定的特定赖氨酸残基的SUMO2修饰：用20 μM的桧木黄酮处理HEK293 SUMO2 T90K细胞8小时后，在543个蛋白质中检测到924个SUMO2修饰的赖氨酸；其中22个赖氨酸的修饰水平增加超过5倍。增加最多的位点位于 U2 snRNP 成分中：PRPF40A（K241：145.8 倍，K375：45.5 倍，K517：47.5 倍，K707：7.8 倍），SF3B2（K680：94.4 倍，K563：56.5 倍），SF3A2（K10：22.6 倍），SNRPD2（K8：16.2 倍），U2SURP（K822：10.0 倍），SF3B1（K413：5.0 倍）。 [1]
桧木黄酮导致 SUMO 化 PRPF40A 的积累：用 20 μM 桧木黄酮处理稳定表达 YFP-SUMO2 的 HeLa 细胞 8 小时后，免疫沉淀显示超过 15% 的总 PRPF40A 被 SUMO2 修饰。免疫荧光显示 PRPF40A 重新定位到巨型斑点中。[1]
桧木黄酮对 RNA 聚合酶 II 转录的抑制作用不显著：用 10–30 μM 桧木黄酮处理 HeLa 细胞 4 或 8 小时后，与 DRB 对照组相比，EU 标记的新合成 RNA 几乎没有变化。[1]

在耐受安全剂量（50 mg/kg）下，桧木黄酮治疗可显著抑制荷瘤小鼠（CT26）的肿瘤生长，其机制是通过减少肿瘤增殖和转移，并诱导细胞凋亡。机制上，桧木黄酮通过线粒体跨膜电位丧失和活性氧（ROS）生成增加诱导细胞凋亡。结论：桧木黄酮抑制结直肠癌细胞增殖，通过ROS-线粒体介导的凋亡途径诱导细胞凋亡，并抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。此外，在小鼠模型中也验证了桧木黄酮的抗肿瘤活性，且未观察到毒性。我们的研究结果表明，植物来源的桧木黄酮可作为抗结直肠癌的肿瘤药物[2]。体内抗感染活性评价显示，桧木黄酮与万古霉素联合使用可有效保护小鼠免受耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的致命性肺炎，其疗效优于单独使用万古霉素。如上所述，桧木黄酮作为ClpP抑制剂，有望进一步开发成为一种有前景的抗金黄色葡萄球菌感染的佐剂[3]。

细胞热位移分析[1]
向 1 ml HeLa NE 中加入 50 µl DMSO 或 50 µl 10 mM 桧木黄酮，并在室温下孵育 20 分钟。然后将 DMSO 处理组和桧木黄酮处理组的 NE 样品分成七份，每份 100 µl。每份样品在特定温度（30°C、33°C、37°C、40°C、43°C、47°C 或 50°C）下孵育 3 分钟，随后在室温下孵育 3 分钟。使用Optima MAX超速离心机和TLA 120.2转子，在4°C下以35,000 rpm超速离心20分钟后，将上清液转移至含有25 µl 4× LDS缓冲液的新离心管中，并在95°C下煮沸10分钟。使用指定的一抗对样品进行Western blot分析。

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桧木黄酮对ClpP蛋白酶活性的影响。[3]
采用基于荧光共振能量转移（FRET）的检测方法筛选ClpP抑制剂，该方法基于ClpP特异性切割荧光肽底物Suc-LY-AMC的能力。通过RFU差异来定义ClpP的酶活性，并计算相对抑制活性。当抑制活性大于60%时，该化合物被认为是潜在的抑制剂。将包含 1 μM ClpP 蛋白、不同浓度桧木黄酮（0.5 至 256 μg/mL）和 ClpP 缓冲液（100 mM HEPES，100 mM NaCl，pH = 7.0）的 100 μL 反应体系加入 96 孔板中，孵育 30 分钟，然后加入荧光底物 Suc-LY-AMC。继续孵育 20 分钟后，使用酶标仪分别在 360 nm 激发波长和 465 nm 发射波长处测定 ClpP 的活性，并计算桧木黄酮的 IC50 值。以等体积的 DMSO 作为阴性对照。

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热位移分析 (TSA)[3]
为了确定桧木黄酮与 ClpP 之间的相互作用，进行了 TSA 分析。将 ClpP 蛋白（终浓度 2 μM）、SYPRO Orange、桧木黄酮和 TSA 缓冲液（150 mM NaCl、10 mM HEPES，pH = 7.5）加入 96 孔光学 PCR 板中。使用实时 PCR 仪以 1°C/min 的速率将混合物从 25°C 加热至 90°C。通过观察药物处理后的 Tm 值变化来验证该相互作用。Tm 值被定义为蛋白质变性 50% 时的温度。

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细胞热位移分析 (CETSA)[3]
将含有 pET28a-ClpP 质粒的大肠杆菌 BL21(DE3) 培养至 OD600 达到 0.8，然后加入 0.5 mM IPTG 以诱导 ClpP 蛋白表达。将上清液与桧木黄酮和等体积的DMSO在37℃下孵育1小时，然后在4℃下以18,000 g离心20分钟。反应混合物分别在25.0、45.0、51.2、56.2、61.4和65.0℃的温度梯度下加热5分钟。值得注意的是，混合物应立即置于冰水中3分钟。然后以18,000 g轻轻离心20分钟，取上清液进行SDS-PAGE分析。样品用考马斯亮蓝G-250染色，并使用ImageJ软件可视化指定蛋白质的相对强度。

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局部表面等离子体共振（LSPR）。 [3]
桧木黄酮与ClpP的相互作用采用OpenSPR仪器进行检测。在达到稳定的基线后，首先用含1% DMSO的PBS缓冲液（pH = 7.4）活化芯片表面。随后，将ClpP蛋白作为分析物施加到传感器芯片上。待反应信号稳定后，依次注入不同浓度的桧木黄酮，结合和解离时间均为240秒。最终结果采用Trace Drawer和One To One软件进行分析。

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基于凝胶的SENP活性测定：使用在大肠杆菌中表达的重组SENP1片段（氨基酸415-643）。检测反应体系（20 μl）包含 2 μl 10× 反应缓冲液（200 mM Hepes、500 mM NaCl、30 mM MgCl₂，pH 7.5）、186 nM SENP1 片段、5 μM SUMO 化底物（YFP-RANGAP aa 418-587-ECFP-SUMO2）以及 1 μl DMSO（对照）或 1 μl 溶于 DMSO 的化合物（终浓度 500 μM）。反应在 37°C 孵育 15 分钟，加入 5 μl 4× LDS 上样缓冲液终止反应，70°C 加热 10 分钟，然后进行 4-12% Tris-Bis PAGE 凝胶电泳分离，并用考马斯亮蓝染色显色。 [1]
DARTS（药物亲和力响应靶标稳定性）检测：将重组 SENP1 片段 (186 nM) 溶于 20 μl SENP 缓冲液（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl）中，分别加入 1 μl DMSO 或 1 μl 化合物 (500 μM)，于 4°C 孵育 1 小时。然后，将样品与不同浓度的蛋白酶 (16–200 μg/ml) 于室温处理 30 分钟。加入 5 μl 4× LDS 上样缓冲液终止反应，于 70°C 加热 10 分钟，进行 SDS-PAGE 电泳分离，并用考马斯亮蓝染色显色。 [1]
CETSA（细胞热迁移分析）：将 1 ml HeLa 细胞核提取物与 50 μl DMSO 或 50 μl 10 mM 桧木黄酮（终浓度 500 μM）混合，室温孵育 20 分钟。将样品分成七份 100 μl 的等分试样，分别在特定温度（30、33、37、40、43、47 或 50°C）下孵育 3 分钟，然后在室温下孵育 3 分钟。在 4°C 下以 35,000 rpm 超速离心 20 分钟后，转移上清液，与 25 μl 4× LDS 缓冲液混合，95°C 煮沸 10 分钟，然后用指定的一抗进行蛋白质印迹分析。[1]

细胞活力和细胞克隆形成实验[2]
MTT 实验中，将细胞接种于 96 孔培养板中，用桧木黄酮处理，然后加入 MTT 溶液孵育。溶解甲臜晶体后，使用 Spectra MAX M5 微孔板分光光度计在 570 nm 波长处测量吸光度。细胞克隆形成实验中，将细胞接种于 6 孔板中，并用桧木黄酮继续孵育 12 天。对克隆进行染色，并在显微镜下计数。

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Hoechst 染色和流式细胞术[2]
Hoechst 33258 染色实验中，将细胞接种于 6 孔板中，并用桧木黄酮孵育 24 小时，然后固定并用 Hoechst 33258 溶液染色。通过荧光显微镜观察和成像细胞核形态。对于流式细胞术 (FCM)，将细胞与桧木黄酮孵育 24 小时后收集，用 Annexin V-FITC/PI 检测试剂盒染色，然后用流式细胞仪进行检测。

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线粒体膜电位 (ΔΨm) 测定和活性氧检测[2]
使用 Rh123 通过 FCM 测定线粒体跨膜电位的变化。24 将细胞与桧木黄酮孵育 24 小时后收集，与 Rh123 溶液孵育，然后用 FCM 进行测量。为了检测ROS水平，将细胞接种后，用不同浓度的桧木黄酮孵育24小时，再用DCFH-DA孵育，然后用FCM进行检测。²⁵ Boyden小室迁移和侵袭实验[2]
改良的Boyden小室迁移和侵袭实验按先前描述的方法进行。^{26, 27} 迁移实验中，将含有桧木黄酮的无血清培养基中的细胞加入上室，下室加入含有10% FBS和桧木黄酮的培养基。侵袭实验中，用Matrigel稀释的无血清培养基包被Transwell膜的上表面，然后将含有桧木黄酮的无血清培养基中的细胞加入上室，下室加入含有10% FBS的培养基。在光学显微镜下计数并拍摄迁移和侵袭的细胞。^[2]

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生长曲线的测定。 [3]
菌株保存在−20°C环境中。实验前，挑取USA300和USA300 ΔclpP的单菌落，经过夜培养后进行复苏。随后进行实验以确保菌株活性。将培养物分别以1:100的比例加入2 mL TSB培养基中。同时加入桧木黄酮（64 μg/mL）或DMSO。取100 μL培养物在不同时间点测定吸光度值（OD600）。

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最小抑菌浓度（MIC）的测定。[3]
根据临床和实验室标准协会（CLSI）指南测定桧木黄酮对金黄色葡萄球菌USA300的MIC。简而言之，将含有不同浓度桧木黄酮（0 至 512 μg/mL）和金黄色葡萄球菌 USA300（1 × 10⁵ CFU）的 100 μL 新鲜 CAMHB 培养基置于 96 孔板中，于 37°C 孵育 16 至 20 小时。最小抑菌浓度 (MIC) 为肉眼观察未发现细菌的最低浓度。

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细胞毒性实验。[3]
将 HEK293T 细胞以 5 × 10⁴ 个细胞/mL 的密度接种于 96 孔板中，每孔 100 μL，培养 16 小时。待细胞贴壁后，向 96 孔板中加入不同浓度的桧木黄酮（0 至 256 μg/mL）。继续在 37°C、5% CO₂ 培养箱中培养 24 小时。随后，将 MTT 溶液以 10 μL/孔的量加入培养基中，并在 37°C 下孵育 4 小时。弃去培养基，然后加入 100 μL DMSO。使用酶标仪测定 490 nm 处的吸光度。

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细胞培养和处理：HeLa、HEK293 和 NB4 细胞培养于添加了 10% 胎牛血清、2 mM 谷氨酰胺和 100 μg/ml 链霉素的 DMEM 培养基中。细胞用浓度为 10、20、30 μM 的桧木黄酮（NB4 细胞还用 0.5、1、2.5、5 μM 处理）或 DMSO（对照）处理 24 小时（或根据指示缩短处理时间）。[1]
RNA 分离和 RT-PCR：使用 NucleoSpin RNA II 试剂盒提取总 RNA。取 200 ng 总 RNA，使用 One Step RT-PCR 试剂盒和针对 ACTR1b、DXO、EIF4A2、HSP40、MCL1、NOP56、FAS 和 RIOK3 的引物对进行逆转录和扩增。PCR 产物在含有 SYBR Safe DNA 凝胶染料的 1% 琼脂糖凝胶上进行分离。[1]
体外剪接实验（非放射性）：标准剪接反应体系包含 30% HeLa 细胞核提取物、DMSO 或化合物，以及体外转录的 Ad1 或 HPV18 E6 前体 mRNA，于 30°C 孵育 90 分钟。反应体系在 95°C 下加热 5 分钟灭活，然后在 55°C 下用蛋白酶 K 消化 30 分钟，再次加热灭活。使用 One Step RT-PCR 试剂盒扩增剪接和未剪接的 RNA，产物在琼脂糖凝胶上进行分离。 [1]放射性体外剪接和非变性凝胶电泳：使用 32P 标记的 pBsAd1 前体 mRNA。在 1.5% 低熔点琼脂糖凝胶上分析剪接复合物，并通过磷成像进行可视化。 [1]
免疫荧光：将生长在盖玻片上的细胞用化合物或DMSO处理，用4%多聚甲醛PHEM缓冲液在室温下固定10分钟，用0.5% Triton X100 PBS透化，与一抗（抗SRSF2、U1A、DDX46、U2AF65、SF3B1、SR蛋白、CDC5L、PLRG1、BCAS2、PRP19、CTNNBL1、snRNP200、coilin、SMN、TMG-cap、Y12、SNRPA1、CDK、fibrillarin、PML、CSTF2、SUMO1、SUMO2/3、PRPF40A）在室温下孵育1小时，然后与染料标记的二抗孵育30分钟，用DAPI染色，用Vectashield封片剂封片，并通过荧光显微镜观察。 [1]
荧光原位杂交 (FISH) 用于检测 poly(A) RNA：用化合物或 DMSO 处理细胞，用 4% 多聚甲醛固定，在冰冷的甲醇中孵育 10 分钟，然后在 70% 乙醇中孵育 15 分钟，用 pH 8.0 的 Tris-HCl 洗涤，在 37°C 下与 Cy3 标记的 Oligo-dT(30) (1 ng/μl) 在杂交缓冲液（1 mg/ml 酵母 tRNA、0.005% BSA、10% 硫酸葡聚糖、25% 去离子甲酰胺）中杂交过夜，用 4× SSC 和 2× SSC 洗涤，用 DAPI 染色，封片，并观察。 [1]
流式细胞术用于细胞周期分析：将细胞接种于12孔板中，处理24小时后收集，用PBS洗涤，重悬于冰冷的70%乙醇中，室温固定30分钟，用PBS洗涤两次，重悬于PI染色液（50 μg/ml碘化丙啶和100 mg/ml核糖核酸酶A溶于PBS）中，孵育30分钟，然后使用BD FACScalibur流式细胞仪和FlowJo软件进行分析。[1]
用EU脉冲标记新合成的RNA：用化合物或DMSO处理HeLa细胞4或8小时后，用5-乙炔基尿苷（EU）脉冲标记20分钟，固定，并根据制造商的说明使用Click-iT RNA成像试剂盒进行检测。 [1]
蛋白质印迹：收集处理后的细胞，用PBS洗涤，在1×LDS缓冲液中裂解，在4-12% NuPAGE Bis-Tris凝胶上分离蛋白质，转移至硝酸纤维素膜，并使用化学发光试剂盒和一抗（抗SUMO1、SUMO2/3、泛素、NEDD8、SRSF1、PRPF40A等）进行检测。[1]
稳定细胞系和免疫沉淀：通过转染pEGFP-C3-PRPF40A并用G418（0.5 mg/ml）筛选，构建稳定表达GFP-PRPF40A的HEK293细胞。用 20 μM 桧木黄酮或 DMSO 处理 8 小时后，将细胞在含有蛋白酶抑制剂的 Co-IP 缓冲液（1 mM EDTA、100 μM Na3VO4、0.5% Triton X-100、20 mM β-甘油磷酸酯）中裂解，离心后，与 GFP-Trap 磁珠在 4°C 下孵育过夜，洗涤后用 1× LDS 缓冲液洗脱，煮沸后进行蛋白质印迹分析。对于 YFP-SUMO2 免疫沉淀，将 HeLa 稳定细胞在 RIPA 缓冲液中裂解，匀浆，澄清，与 GFP-Trap 磁珠孵育，并进行类似处理。 [1]
利用SILAC蛋白质组学分析SUMO2修饰位点：将HEK293 6His-SUMO2-T90K细胞培养于不含L-赖氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酰胺的DMEM培养基中，并加入10%透析胎牛血清、1 mg/ml嘌呤霉素以及天然或重稳定同位素标记的赖氨酸/精氨酸。重标记的细胞用20 μM桧木黄酮处理8小时，然后用DMSO进行轻标记。收集细胞，混合，用 6 M 盐酸胍缓冲液裂解，超声处理，澄清，然后用 Ni2+-NTA 琼脂糖纯化 His 标签的 SUMO2 缀合物，用咪唑洗脱，用 Lys-C 和 Glu-C 酶消化，最后用偶联到蛋白 A 琼脂糖上的 K-ε-GG 特异性抗体进行免疫亲和纯化，得到含 diGly-Lys 的肽段。肽段用 Q Exactive Orbitrap 质谱仪进行 LC-MS/MS 分析，数据用 MaxQuant 软件处理。[1]

小鼠模型及毒性评价[2]
雌性BALB/c小鼠（6-8周龄）饲养于特定病原体清除（SPF）级动物房。所有适用的国际、国家和/或机构动物饲养和使用指南均得到遵守。将CT26细胞（0.5 × 10⁶）注射到小鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到约60mm³时，将小鼠随机分组，分别腹腔注射25 mg/kg和50 mg/kg的桧木黄酮或溶剂，每日一次。肿瘤体积按公式0.5² × 长 × 宽²计算。肿瘤抑制率（TI）按公式TI = (V_对照组 − V_实验组)/V_对照组计算。末次治疗后采集内脏器官和血液样本，并收集肿瘤组织称重（肿瘤细胞接种后第24天）。毒性评价方面，持续监测体重、腹泻、厌食等相关指标及其他临床症状。组织样本（肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏）经苏木精-伊红 (HE) 染色后进行检查，血液样本进行生化和血常规分析。肺炎模型实验。[3]
采用小鼠肺炎感染模型对桧木黄酮进行体内评价。辽宁长生生物制品有限公司提供6周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体重18～22 g。金黄色葡萄球菌肺炎小鼠模型的构建方法如前所述。[3]
为评估存活率，将小鼠随机分为7组，每组10只。每组小鼠感染2 × 10⁸ CFU/30 μL金黄色葡萄球菌。接种1小时后，每12小时皮下注射桧木黄酮（100 mg/kg/d），以评估96小时的存活率。感染2小时后，分别给予特定剂量的桧木黄酮（100 mg/kg·d−1）、万古霉素（100 mg/kg·d−1）或桧木黄酮（100 mg/kg·d−1）联合万古霉素（100 mg/kg·d−1）治疗，桧木黄酮采用皮下注射途径，万古霉素采用腹腔注射途径。

桧木黄酮以浓度依赖的方式诱导人类细胞系发生细胞周期阻滞和凋亡。在 HeLa 和 HEK293 细胞中，用 10-30 μM 的桧木黄酮处理 24 小时即可导致细胞周期阻滞；NB4 细胞最为敏感，暴露于 10 μM 的桧木黄酮 24 小时后，大部分细胞发生凋亡。[1]

[1]. Characterisation of the biflavonoid hinokiflavone as a pre-mRNA splicing modulator that inhibits SENP. Elife. 2017 Sep 8;6. pii: e27402.

杜松类黄酮是一类双黄酮化合物，其结构中芹菜素的6位被4-(5,7-二羟基-4-氧代-4H-色烯-2-基)苯氧基取代。它是一种从盐肤木（Rhus succedanea）中分离得到的双黄酮醚，已被发现具有显著的细胞毒性。它具有神经保护、抗肿瘤和代谢等功能。它是一种双黄酮化合物、芳香醚和羟基黄酮。其功能与芹菜素相关。据报道，在多花藤黄（Garcinia multiflora）、旁遮普盐肤木（Rhus punjabensis）和其他一些生物体中也发现了杜松类黄酮，并有相关数据。

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桧木黄酮 是一种双黄酮（双芹菜素），存在于许多植物科中。先前的计算机模拟筛选表明，该化合物可能靶向前列腺素D2合成酶和基质金属蛋白酶-9，但本研究表明其抑制SUMO蛋白酶SENP1。桧木黄酮对体外测试的120种不同的纯化激酶均无显著抑制作用（仅有微弱的非特异性作用）。该化合物特异性地增加SUMO化修饰（而非泛素或NEDD8修饰）。化学合成的桧木黄酮在光谱学上与天然分离物完全相同，并表现出相同的剪接调节活性，证实其为活性分子。桧木黄酮处理可改变MCL1的选择性剪接，使其倾向于促凋亡亚型MCL1-S，类似于SF3B1抑制剂的作用。 NB4细胞系（表达PML-RARα融合蛋白的急性早幼粒细胞白血病）对桧木黄酮诱导的细胞凋亡表现出极高的敏感性，这可能是由于PML SUMO化水平升高所致。该研究表明，桧木黄酮或其衍生物有望开发为新型抗癌药物。[1]

C30H18O10

538.4579

538.09

C, 66.92; H, 3.37; O, 29.71

19202-36-9

5281627

Light yellow to yellow solid

1.6±0.1 g/cm3

841.5±65.0 °C at 760 mmHg

353-355ºC

284.8±27.8 °C

0.0±3.2 mmHg at 25°C

1.771

4.33

170.8

5

10

4

40

1020

0

O1C(C2C([H])=C([H])C(=C([H])C=2[H])O[H])=C([H])C(C2C(=C(C(=C([H])C1=2)O[H])OC1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])C1=C([H])C(C2=C(C([H])=C(C([H])=C2O1)O[H])O[H])=O)O[H])=O

WTDHMFBJQJSTMH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C30H18O10/c31-16-5-1-14(2-6-16)24-12-21(35)28-26(40-24)13-22(36)30(29(28)37)38-18-7-3-15(4-8-18)23-11-20(34)27-19(33)9-17(32)10-25(27)39-23/h1-13,31-33,36-37H

6-[4-(5,7-dihydroxy-4-oxochromen-2-yl)phenoxy]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromen-4-one

4',6''-O-Biapigenin; Hinokiflavone; 19202-36-9; 4',6''-O-Biapigenin; GFF5VYC4NB; 4H-1-benzopyran-4-one, 6-[4-(5,7-dihydroxy-4-oxo-4H-1-benzopyran-2-yl)phenoxy]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-; 6-[4-(5,7-dihydroxy-4-oxochromen-2-yl)phenoxy]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromen-4-one; CHEBI:5721; 4H-1-Benzopyran-4-one, 6-(4-(5,7-dihydroxy-4-oxo-4H-1-benzopyran-2-yl)phenoxy)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-; Hinokiflavone

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~92.86 mM)
Ethanol : ~2 mg/mL (~3.71 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.83 mg/mL (1.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 8.3 mg/mL澄清的DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；再将50 μL Tween-80+加入到上述溶液中，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 10 mg/mL (18.57 mM) in 50% PEG300 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。