Hydroxysafflor yellow A   中文名称: 羟基红花黄色素 A

Natural flavonoid from safflower

血管平滑肌细胞（VSMCs）的异常增殖和迁移与早期血管增生性病变密切相关。Toll样受体（TLR）-4是一种在VSMCs上表达的病原体模式识别受体，可被脂多糖激活。活化的TLR-4通过下游信号通路（包括Rac1/Akt）在VSMCs增殖和迁移中起着促进作用。羟基红花黄色素A（HSYA）是红花黄色素的主要成分，在中医中长期用于治疗心血管疾病。然而，HSYA/Hydroxysafflor yellow A对VSMC增殖和迁移的影响尚不清楚。在本研究中，我们发现HYSA可以抑制LPS诱导的VSMCs增殖和迁移，同时下调几种关键的促炎细胞因子的水平，包括TNF-α、IL-6和IL-8。我们进一步表明，HYSA抑制了LPS诱导的TLR-4表达上调以及Rac1/Akt通路的激活，表明HSYA至少部分通过抑制TLR-4/Rac1/Akt通路抑制了LPS引导的VSMCs增殖和迁移。因此，HSYA可作为预防和治疗血管增生性疾病的有前景的药物。[1]

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羟基红花黄色素A（HSYA）是红花黄色素的主要成分，已被证明可以通过抑制类固醇诱导的原代骨髓间充质基质细胞成脂分化来预防类固醇诱导的股骨头缺血性坏死。在这项研究中，我们研究了Hydroxysafflor yellow A//HSYA对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖和脂肪生成的影响。通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）2,5-二苯基溴化四唑分光光度法、油红O染色、细胞内甘油三酯测定、实时定量RT-PCR、瞬时转染和双荧光素酶报告基因方法研究了HSYA对3T3-L1细胞增殖和分化的影响及其可能机制。HSYA抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖，细胞活力以剂量和时间依赖的方式大大降低。HSYA（1 mg/l）在分化后第8天分别显著降低了脂肪细胞内脂质和甘油三酯含量21.3%（2.13±0.36 vs 2.71±0.40，P<0.01）和22.6%（1.33±0.07 vs 1.72±0.07，P<0.01。在分化的3T3-L1脂肪细胞中，HSYA（1mg/l）显著增加了激素敏感脂肪酶（HSL）mRNA表达和启动子活性，分别增加了2.4倍和1.55倍（P<0.01）。HSYA抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖和脂肪生成。HYSA对脂肪生成的抑制作用可能是由于通过增加HSL启动子活性来促进脂肪分解特异性酶HSL的表达。[2]

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HSYA/羟基红花黄色素A保护EC活力免受LPS诱导的损伤（P<0.05）。HSYA/Hydroxysafflor yellow A可抑制LPS诱导的NF-κB p65亚基DNA结合（P<0.01）和B细胞抑制剂α（IκBα）磷酸化中κ轻多肽核因子基因增强子。HSYA减弱了LPS引发的ICAM-1和E-选择素mRNA水平升高以及p38 MAPK或c-Jun N-末端激酶MAPK的磷酸化。HSYA还抑制LPS诱导的细胞表面ICAM-1蛋白表达（P<0.01）和白细胞与EC的粘附（P<0.05）。 结论：HSYA能有效保护LPS诱导的内皮粘附分子的高表达和炎症信号转导[4]。

羟基红花黄色素A/Hydroxysafflor yellow A（HSYA）是从红花中提取的主要活性天然成分，已被广泛用于治疗脑血管和心血管疾病。本研究旨在探讨HSYA对酒精性肝损伤的影响及其潜在机制。采用雄性Sprague-Dawley大鼠建立酒精诱导的肝损伤模型。HSYA治疗通过降低大鼠丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）和III型前胶原（III-C）的水平来改善血清生化指标。与模型组相比，Hydroxysafflor yellow A/羟基红花黄色素A/HSYA有效地增加了大鼠肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性和信使RNA（mRNA），而酒精则明显降低了这一活性。与模型组相比，HSYA还明显降低了大鼠肝组织中的活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平，而酒精则明显增强了这一水平。组织学研究表明，HSYA显著减少了大泡和小泡脂肪变性的数量，抑制了肝纤维化，缩小了气球样变性区域，减轻了长期饮酒引起的肝损伤的严重程度，最终改善了肝脏结构。此外，免疫组织化学研究表明，HSYA显著阻断了酒精刺激的大鼠肝组织中转化生长因子β1（TGF-β1）的激活。总的来说，这些数据表明，HSYA可以有效保护大鼠肝脏免受长期酒精损伤，这与肝组织抗氧化能力的增强和TGF-β1表达的抑制有关[3]。

MTT法[1]
VSMCs在96孔板中培养至70%融合，血清饥饿24小时。LPS组VSMCs用LPS（20μg/ml）处理24小时。在LPS+羟基红花黄色素A/HSYA组中，VSMCs分别用LPS（2 0μg/ml）和HSYA（0.1μM、1μM、10μM和100μM）处理24 h。培养24小时后，将MTT（0.5μg/mL）加入培养基中，然后孵育2小时。取出培养基后，加入100µL DMSO以溶解沉淀。使用酶标仪测定570nm处的吸光度。

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细胞迁移试验[1]
使用含有聚碳酸酯膜的24孔改良Boyden室来检测单独用LPS（20μg/ml）或LPS（20µg/ml）和HYSA（10μM）处理48小时的VSMCs中的细胞迁移。简而言之，在存在或不存在羟基红花黄色A/HSYA（10μM）的情况下，每组的下孔都填充了含或不含LPS（20微克/毫升）的DMEM。在37°C和5%CO2下孵育24小时后，去除膜上侧的VSMCs。下侧的VSMCs用Hoechst 33342染色，并在每个孔中随机选择五个方格进行计数。

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蛋白质印迹分析[1]
进行蛋白质印迹分析，以检测在存在或不存在羟基红花黄色素A/HSYA（10μM）的情况下，用LPS（20μg/ml）处理的VSMCs中的蛋白质表达。根据制造商的说明，裂解每组中的VSMCs，并使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。之后，用12%SDS-PAGE分离蛋白质，并将其转移到PVDF膜上，然后将其在PBS中的5%脱脂奶粉中封闭4小时。之后，将PVDF膜与第一抗体一起孵育2小时，然后用PBS洗涤三次后，与适当的第二抗体一起温育。

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通过细胞计数和MTT法测定3T3-L1前脂肪细胞的增殖[2]
细胞计数和3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）2,5-二苯基溴化四唑（MTT）法用于评估细胞增殖。对于细胞计数测定，将细胞接种在24孔板中，密度为2×104/ml，在添加了10%FBS的DMEM中。24小时后，用磷酸缓冲盐水洗涤细胞，然后暴露于不同浓度的Hydroxysafflor yellow A/羟基红花黄色素A/HSYA。4、8、24、48、72、96小时后，使用台盼蓝染料和血细胞计数器计算细胞数量和存活率。对于MTT测定，将3T3-L1前脂肪细胞铺在96孔板上，并使用与细胞计数类似的过程进行处理。通过MTT法测定细胞生长速率，将终浓度为1mg/ml的MTT溶液加入每个孔中4小时。然后加入100μl三重溶液（SDS 10 g、异丁醇5 ml和10 N HCL 0.1 ml溶解在双蒸馏水中至100 ml），将细胞孵育过夜。最后，通过使用ELISA阅读器在620nm波长下获得光密度（OD）值。

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3T3-L1细胞油红O染色和甘油三酯含量测定[2]
3T3-L1前脂肪细胞被放置在24孔板中。通过在10%FBS DMEM/F12培养基中用10μg/ml胰岛素、10μM地塞米松和0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）处理融合的前脂肪细胞来诱导分化（第0天）。3天后，用含有10μg/ml胰岛素的10%FBS DMEM-F12替换培养基2天。然后将培养基换成10%FBS DMEM-F12（第5天），每1-2天刷新一次。在分化过程中，这些细胞分别用0、0.01和1mg/l羟基红花黄色素A/HSYA处理4、8、12天。如前所述进行油红O染色（Zhu等人，20062013）。简而言之，细胞在室温下用4%新鲜甲醛固定1小时，然后用0.6%（w/v）过滤的油红O溶液染色2小时。通过倒置显微镜观察细胞质中染色的脂滴，然后拍照。然后加入600μl异丙醇提取油红O染料，然后去除150μl提取液，使用ELISA阅读器在490 nm波长下检测OD值。为了测定脂肪细胞中甘油三酯的含量，将细胞用0、0.01、1和100mg/l HSYA处理8天，然后根据商用甘油三酯GPO-POD酶测定试剂盒（中国北京SinoPCR）的说明裂解，并通过ELISA阅读器获得OD值。根据制造商的说明，用BCA蛋白测定试剂盒估算总细胞蛋白浓度。细胞内脂质含量与蛋白质含量标准化。实验被重复了至少三次。

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脂解试验[2]
细胞在24孔板中培养，并用不同浓度的Hydroxysafflor yellow A/羟基红花黄色素a/HSYA处理，如上述甘油三酯测定实验所述。收集培养基，在70°C下孵育10分钟，以灭活残留的脂肪酶。通过甘油测定试剂盒在490nm下测定释放到培养基中的甘油。通过BCA法估算总蛋白浓度。实验被重复了至少三次。脂解数据表示为μmol甘油/mg总蛋白。

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实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）分析[2]
使用如前所述的ABI7500 PCR系统，用SYBR绿色荧光染料进行定量实时RT-PCR（qRT-PCR）（Gong等人，2009）。简而言之，3T3-L1前脂肪细胞被放置在密度为2×104/ml的24孔板中，然后分化并如上所述用羟基红花黄色a/HSYA处理。然后使用E.Z.N.A总RNA试剂盒I分离总细胞RNA。使用包括Omniscript RT试剂盒、Oligo（dT）引物和RNA酶抑制剂的RT-PCR系统，使用0.5μg总RNA生产cDNA。靶基因mHSL和内控基因m18S（NR_003278）的引物序列如表1所示。96孔板上每个孔的总反应体积为20μl，每个基因重复两次。PCR的反应条件为在95℃下初始变性10分钟，（95℃下变性15秒，60℃下变性1分钟）×40个循环，解离曲线的反应条件分别为95℃下15秒、60℃下反应1分钟和95℃下反应15秒。每个基因的解离曲线都显示出特异性扩增。通过公式2-ΔΔCt（Ct=感兴趣的Ct基因-Ctm18S），使用比较Ct法从RT-PCR的阈值周期（Ct）值中获得任意单位的HSL mRNA表达水平，该阈值周期与m18S的阈值周期相关（Livak和Schmittgen 2001）。使用管家基因m18S作为内部对照，使靶基因的表达正常化。18S在不同培养条件下的表达变化相对稳定。实验被重复了至少三次。

40只体重200～250 g的雄性Sprague-Dawley大鼠被随机分为以下五组：对照组（生理盐水，8 mL/kg）、模型组、羟基红花黄A/HSYA组（2.5或10 mg/kg）和阳性对照组（秋水仙碱，1 mg/kg）。除灌胃等量生理盐水的对照组外，所有大鼠均灌胃56%酒精（8 mL/kg/天），持续6周，首次剂量加倍。羟基红花黄A/HSYA组大鼠分别腹腔注射HSYA 2.5或10 mg/kg/天，持续6周，并在酒精灌胃开始时同时进行腹腔注射HSYA。秋水仙碱组的大鼠接受腹腔注射秋水仙碱治疗，剂量为1 mg/kg/天。6周后，所有大鼠用水合氯醛短暂麻醉，然后通过腹主动脉放血处死。采集血液样本和肝组织，并立即置于液氮中冷冻，以备后续检查。[3]

[1].Hydroxysafflor yellow A inhibits lipopolysaccharide-induced proliferation and migration of vascular smooth muscle cells via Toll-like receptor-4 pathway. Int J Clin Exp Med. 2015 Apr 15;8(4):5295-302.

[2].Hydroxysafflor yellow A (HYSA) inhibited the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. Cytotechnology. 2015 Mar 7.

[3].Protective effects of hydroxysafflor yellow A (HSYA) on alcohol-induced liver injury in rats. J Physiol Biochem. 2015 Mar;71(1):69-78.

[4].Hydroxysafflor yellow A attenuate lipopolysaccharide-induced endothelium inflammatory injury. Chin J Integr Med. 2015 May 27.

羟基红花黄A是一种C-糖苷化合物，其化学名为3,4,5-三羟基环己-2,5-二烯-1-酮，在2位和4位被β-D-葡萄糖基取代，在6位被对羟基肉桂酰基取代。它是从红花（Carthamus tinctorius）中提取的一种传统中药的主要生物活性成分。它具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、抗肿瘤、清除自由基、抑制EC 3.2.1.48（蔗糖α-葡萄糖苷酶）活性、神经保护和植物代谢等多种作用。它是一种C-糖苷化合物，属于酚类、烯酮类和烯醇类化合物。已有文献报道红花（Carthamus tinctorius）中含有羟基红花黄A。总之，我们的研究结果表明，羟基红花黄A（HSYA）通过抑制TLR-4表达以及TLR-4/Rac1/Akt通路，抑制LPS诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和迁移。因此，HSYA可能成为预防和治疗血管增生性疾病的新型药物。然而，本研究存在一些局限性。例如，我们尚未研究HYSA在体内对LPS诱导的VSMC增殖和迁移的影响。此外，HYSA是否对LPS刺激的VSMC中其他TLR4介导的通路（包括MyD88或TRIF）产生影响也尚未探讨。总之，HYSA对血管平滑肌细胞（VSMC）中TLR信号通路网络的具体影响仍需进一步研究。[1]

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HSYA/羟基红花黄A是红花中黄酮类化合物的主要成分，其结构为查尔酮。Hsu和Yen（2007）的研究表明，包括黄酮类化合物和酚酸在内的抗氧化剂能够显著抑制脂肪细胞中甘油三酯的生成以及甘油-3-磷酸脱氢酶（脂肪生成的关键酶）的活性。同样，Liu等人（2007）报道，黄酮类化合物柚皮苷可通过降低PPARγ和C/EBPα的表达来抑制3T3-L1前脂肪细胞的脂肪生成。Hsieh等人（2012）也发现查尔酮衍生物具有潜在的抗糖尿病活性。黄腐酚（啤酒花中的查尔酮）能显著抑制前脂肪细胞的分化（Yang et al. 2007）。这些结果，结合近期发现羟基红花黄A（HSYA）可能通过其抗氧化作用保护心脏和大脑免受缺血性损伤（Liu et al. 2008; Wei et al. 2005），提示HSYA可能克服与肥胖状态相关的某些代谢紊乱，并有望成为抗肥胖和抗心血管缺血性疾病治疗的靶点。总之，羟基红花黄A/HSYA抑制了3T3-L1前脂肪细胞的增殖和脂肪生成。 HSYA对脂肪生成的抑制作用可能是由于其通过增加HSL启动子活性促进脂肪分解特异性酶HSL的表达所致。[2]

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总之，数据表明羟基红花黄A/HSYA可通过抑制TGF-β1表达和提高抗氧化能力来预防酒精性肝损伤。在后续研究中，我们将充分阐明HSYA的抗纤维化作用及其潜在机制，这将为其临床应用提供理论基础。[3]

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总之，给予羟基红花黄A/HSYA可显著降低LPS诱导的内皮细胞炎症损伤。HSYA的作用包括抑制p38 MAPK磷酸化、NF-κB激活、炎症因子高表达以及白细胞黏附于内皮细胞。[4]

C27H32O16

612.5334

612.169

C, 52.94; H, 5.27; O, 41.79

78281-02-4

49798103

Yellow to orange solid powder

1.9±0.1 g/cm3

1015.8±65.0 °C at 760 mmHg

334.0±27.8 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.797

2.98

295.36

12

16

6

43

1160

10

C1=CC(=CC=C1/C=C/C(=C/2\C(=C(C(=O)C(C2=O)([C@H]3[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O3)CO)O)O)O)O)[C@H]4[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O4)CO)O)O)O)O)/O)O

IAVUBSCVWHLRGE-HMGSBZAVSA-N

InChI=1S/C27H32O16/c28-7-12-16(32)19(35)21(37)23(42-12)15-18(34)14(11(31)6-3-9-1-4-10(30)5-2-9)24(39)27(41,25(15)40)26-22(38)20(36)17(33)13(8-29)43-26/h1-6,12-13,16-17,19-23,26,28-38,41H,7-8H2/b6-3+,14-11-/t12-,13-,16-,17-,19+,20+,21-,22-,23+,26-,27?/m1/s1

(6Z)-2,5-dihydroxy-6-[(E)-1-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enylidene]-2,4-bis[(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]cyclohex-4-ene-1,3-dione

Hydroxysafflor Yellow A; Safflomin A; 78281-02-4; HSYA; HI7O919OYZ; 146087-19-6; (6E)-2,5-dihydroxy-6-[(E)-1-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enylidene]-2,4-bis[(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]cyclohex-4-ene-1,3-dione; Hydroxy safflor yellow A;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~408.14 mM)
H2O : ~33.33 mg/mL (~54.41 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.40 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.40 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。