Incyclinide   中文名称: 茵克林

matrix metalloproteinase (MMP)

实验证明，incyclinide 可以阻止培养细胞中黑色素瘤、膀胱腺癌和恶性肿瘤的生长。最终剂量为 5–20 μM 的 incyclinide 可抑制明胶下游和酪蛋白阻断的作用，抑制 MT1-MMP，防止 MT1-MMP 激活 pro-MMP-2，并减轻 HT-1080 纤维肉瘤细胞的低毒性 [1] 。霉菌和丝状真菌对辛环宁的生长具有很强的抵抗力。大多数 CMT-3 对丝状真菌的最低抑制浓度 (MIC) 范围为 0.25 至 8 μg/mL，环环素通常可将这些真菌的活性抑制至 90% [2]。

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CMT-3 对多种真菌菌株表现出抗真菌活性。测定了其对47株真菌的最低抑菌浓度，范围通常在0.25至8.00 µg/ml之间。[2]
CMT-3 对丝状真菌特别有效。例如，对絮状表皮癣菌、尖端赛多孢菌和一种单端孢菌的MIC为0.5 µg/ml，对波氏假阿利什菌的MIC为0.25 µg/ml，对石膏样小孢子菌和红色毛癣菌的MIC为1.0 µg/ml。部分丝状真菌如一种小克银汉霉的MIC为8.0 µg/ml。[2]
对酵母菌，CMT-3 的效力有差异。白色念珠菌菌株的MIC范围从0.25到 >8 µg/ml。部分克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌菌株在浓度高达8 µg/ml时未被抑制。[2]
在使用土豆葡萄糖肉汤对白色念珠菌（分离株2730）进行的浊度测定中，CMT-3 的MIC为2 µg/ml，50%抑制浓度约为1 µg/ml。[2]
对39株菌进行了真菌活力测定（测量药物去除后真菌细胞的生长能力）。在10 µg/ml浓度下，CMT-3 使39株中的33株（85%）活力降低超过50%。它对丝状真菌表现出强杀菌活性，84%（19株中的16株）受试丝状真菌的活力抑制超过90%。相比之下，CMT-3 对酵母的杀菌作用弱于两性霉素B。[2]
一项时间进程研究表明，需要分别暴露于CMT-3（10 µg/ml）4小时和12小时才能杀死90%的烟曲霉分生孢子和白色念珠菌细胞。[2]
共聚焦激光扫描显微镜显示，与CMT-3 孵育后，在白色念珠菌和一种青霉菌的细胞内均能清晰地观察到药物的荧光，表明其广泛的细胞内分布，部分荧光也见于细胞壁区域。[2]

受拉侧破骨细胞的减少可能是英环宁混悬剂导致牙齿移动的机制。这可能是由于破骨细胞迁移减少或破骨细胞荧光刺激引起的。 incyclinide引起的MMP活性降低也可能直接阻止机会性骨基质破坏[3]。

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在大鼠正畸牙齿移动模型中，每日口服 CMT-3 在14天内以剂量依赖方式显著抑制牙齿位移。磨牙移动距离分别为：0 mg/kg 组 1.72 ± 0.53 mm，6 mg/kg 组 1.45 ± 0.18 mm，30 mg/kg 组 1.13 ± 0.13 mm。统计分析显示抑制作用显著 (p = 0.03)。[1]
与对照组（0 mg/kg）和低剂量组（6 mg/kg）相比，CMT-3 (30 mg/kg) 显著减少了实验侧牙齿压力侧（近中侧）的破骨细胞数量 (p < 0.05)。[1]
免疫组织化学染色提示，30 mg/kg CMT-3 组破骨细胞内的 MMP-9 含量似乎低于 0 mg/kg 组，但未进行量化。[1]

CMTs作为抗真菌药物的筛选。将四种真菌（通常作为临床分离株）的菌株，即青霉属、烟曲霉属（ATCC 1022）、根霉属和白色念珠菌，在PDA斜面上在35°C下有氧培养48小时。用0.9%无菌盐水润湿无菌棉头涂抹器，并将其滚到真菌的每个PDA斜面表面，证明其具有丰富的分生孢子。将分生孢子悬浮在0.9%的盐水中，并将浊度调整为符合0.5麦克法兰标准，相当于约1.5×108个细胞/ml。将白色念珠菌悬浮在盐水中，以类似的方式调整为0.5麦克法兰的标准。将这些悬浮液在无菌0.9%生理盐水中以1:100稀释。 在100 ml等分试样中制备pH 7.0的SABHI琼脂，并在121°C下灭菌15分钟。将无菌SABHI琼脂冷却至50°C，此时加入10 ml每种测试的CMT（在浓度为250μg/ml的10%二甲基亚砜[DMSO]中制备），以产生25μg CMT/ml的最终浓度，并将其加入琼脂基质中。混合后，将20ml含有或不含有CMT的SABHI琼脂溶液倒入培养皿中并使其固化。用含有1%DMSO的平板作为对照。将10微升的分生孢子悬浮液和10微升白色念珠菌悬浮液分别接种到琼脂板上，然后在35°C下有氧培养过夜。将含有不同CMT的平板上的真菌生长与对照（单独含有1%DMSO）进行如下比较：在对照培养物中观察到的真菌生长水平被评分为+4；没有可检测的真菌生长被评分为0；+3、+2和+1分别代表在对照培养物中观察到的真菌生长的75%、50%和25%[2]。

CMT-3和AMB对真菌细胞活力的抑制作用
（i） 时间进程研究。在本研究中，真菌细胞活力被描述为真菌细胞在实验的体外条件下生长的能力。我们测量了真菌细胞与药物孵育后的生存能力，然后将药物去除或稀释至无效水平。真菌细胞活力的抑制反映了真菌细胞不可逆的生长抑制，即杀真菌活性。为了确定CMT-3和AMB抑制真菌细胞活力所需的时间，使用新鲜收集的烟曲霉和白色念珠菌细胞的分生孢子。将真菌细胞和分生孢子分别悬浮在浓度为5×105和2×106 CFU/ml的Tris-NaCl缓冲液（75 mM Tris，140 mM NaCl，11 mM KCl[pH 7.0]）中。将CMT-3和AMB以其在DMSO中的最终浓度的100倍添加到悬浮液中，以产生10μg/ml的最终药物浓度。通过将DMSO添加到真菌悬浮液中以产生1%（vol/vol）的最终浓度来制备对照。将对照和药物处理的真菌悬浮液在35°C下孵育0、1、4、8、12和24小时。孵育结束时，用相同的缓冲液以1:1000稀释每种真菌悬浮液，以产生无效药物浓度（0.01μg/ml）和5×102和2×103 CFU/ml之间的真菌浓度。将每种稀释的真菌悬液100微升均匀接种到灭菌培养皿（100×15 mm）中的PDA上，然后在35°C下孵育48小时或直到对照菌落清晰可见以进行计数。 （ii）生存能力测定。39株真菌菌株在35°C的PDA斜面上生长2天或直到分生孢子发生阶段。收集每种真菌的分生孢子或细胞并将其悬浮在Tris-NaCl缓冲液中，与10μg CMT-3或AMB/ml在35°C下预培养12小时，然后稀释并接种到PDA培养皿上，如上所述。每种真菌菌株在暴露于CMT-3或AMB后的生存能力被计算为对照培养物上菌落计数的百分比。对每种真菌菌株进行三次平行测定，以获得真菌活力百分比的平均值
CMT-3对白色念珠菌生长的抑制作用。
用改良浊度法测定CMT-3对白色念珠菌生长的抑制作用。将含有PDB（5 ml）和不同浓度CMT-3（0、0.125、0.25、0.5、1.0和2.0μg/ml）的一系列试管在对数后期分别接种100μl白色念珠菌悬浮液（分离物2730），以产生106/ml的最终细胞浓度。将试管在35°C下进行有氧孵育，在每个时间点（0、1、2、4、6、12和24 h），用分光光度法（Spectronic 70；Bausch&Lomb）在600 nm下测定每个试管中的浊度。[2]

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抗真菌活性初步筛选： 将四种真菌物种（一种青霉菌、烟曲霉、一种根霉和白色念珠菌）培养在琼脂斜面上。将分生孢子或酵母细胞悬浮于盐水中至0.5麦氏浊度标准并稀释。将不同的CMT-3溶液（在琼脂中的终浓度为25 µg/ml）掺入SABHI琼脂平板中。将真菌悬浮液点种到平板上，在35°C有氧条件下孵育过夜，并与DMSO对照进行视觉比较评分。[2]
MIC测定（PDA法）： 培养丝状真菌和酵母并制备悬浮液。将土豆葡萄糖琼脂灭菌、冷却，并与CMT-3溶液混合，使琼脂中达到最终浓度（例如0, 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 µg/ml）。将琼脂-药物混合物倒入多孔板中。凝固后，将真菌悬浮液接种到每个孔中。将平板在35°C有氧条件下孵育48小时或直至对照生长明显。MIC定义为完全抑制真菌肉眼生长的最低药物浓度。[2]
真菌活力测定： 培养真菌菌株，收集分生孢子/细胞并悬浮于Tris-NaCl缓冲液中。将悬浮液与CMT-3（10 µg/ml）在35°C预孵育12小时。孵育后，将悬浮液稀释至药物浓度无效的水平，然后涂布到土豆葡萄糖琼脂平板上。将平板在35°C孵育48小时，计数菌落，活力计算为经DMSO处理的对照培养物菌落数的百分比。[2]
时间进程活力研究： 将烟曲霉分生孢子和白色念珠菌细胞悬浮于缓冲液中。加入CMT-3至终浓度10 µg/ml。对照加入DMSO。将悬浮液在35°C下孵育0、4、8、12和24小时。在每个时间点，将悬浮液稀释1:1000并涂布到琼脂平板上。孵育后，计数菌落以确定随时间变化的杀菌效果。[2]
生长抑制（浊度）测定： 准备一系列含有土豆葡萄糖肉汤和不同浓度CMT-3（0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 µg/ml）的试管，接种处于对数后期的白色念珠菌悬浮液。将试管在35°C有氧条件下孵育。在0、1、2、4、6、12和24小时的时间点，使用分光光度计在600 nm处测量浊度以监测生长抑制。[2]
共聚焦激光扫描显微镜（细胞内定位）： 培养白色念珠菌和一种青霉菌，收集细胞/分生孢子，洗涤并重悬于缓冲液中。取等分试样与不同浓度的CMT-3（0.5, 5, 10 µg/ml）在35°C孵育不同时间（0, 1, 6, 12小时）。孵育后，洗涤细胞以去除细胞外药物，重悬，置于带有抗淬灭剂的载玻片上。使用共聚焦激光扫描显微镜在激发光380 nm和发射光520 nm下检测CMT-3的固有荧光。[2]

大鼠：18只Wistar大鼠在上颌一侧接受标准化正畸矫治器。在14天内，将大鼠分为三组，每组6只，分别每日给予0、6或30 mg/kg的incyclinide，并测量牙齿移位情况。之后，使用ED-1染色法对组织切片上的破骨细胞进行计数。同时计数牙周膜中的多核和单核ED-1阳性细胞。此外，切片还进行了MMP-9染色。[3]

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本研究使用了18只年轻成年雄性Wistar大鼠（290-330 g）。在全身麻醉下，将施加10 cN恒定近中力的标准化正畸矫治器置于右侧上颌磨牙上。[1]
大鼠被分为三组（n=6）。第一组大鼠每日通过灌胃给予1 mL赋形剂（2%羧甲基纤维素生理盐水），持续14天。第2组和第3组分别接受相同体积的载体，其中分别含有6 mg/kg或30 mg/kg体重的CMT-3。[1]
在第0、3、7、10和14天，于全身麻醉下使用数字游标卡尺测量正畸牙齿的位移。测量点为上颌磨牙单元上的固定点与同侧切牙牙龈水平的牙骨质-牙釉质交界处之间的距离，实验侧（矫治器侧）和对照侧（对侧）均进行测量。净位移由两侧测量值的差值计算得出，以校正生理生长和漂移。[1]
第14天，用4%多聚甲醛灌注大鼠。解剖上颌骨，固定，用EDTA脱钙，石蜡包埋，并切片（7 μm）。切片经苏木精-伊红染色后进行一般观察。[1]
免疫组织化学染色中，脱蜡切片经抗原修复和内源性过氧化物酶灭活处理。使用ED-1单克隆抗体进行一抗鉴定破骨细胞和单核吞噬细胞谱系细胞，随后使用生物素标记的二抗，并用DAB进行ABC-过氧化物酶显色。MMP-9的检测采用特异性单克隆抗体，并进行类似的免疫组织化学步骤。[1]
每颗牙齿选取三个切片进行细胞计数。破骨细胞定义为位于骨表面或附近的多核ED-1阳性细胞。牙周膜（PDL）内但不与骨/牙根表面接触的单核和多核ED-1阳性细胞也单独计数。[1]

CMT-3 被描述为缺乏抗菌活性，这是对传统四环素类药物的一种改良。[1]
三个实验组（0、6 和 30 mg/kg CMT-3）的体重增加情况相似，表明在所测试的剂量和疗程下未观察到明显的全身毒性。[1]

[1]. CMT-3, a non-antimicrobial tetracycline (TC), inhibits MT1-MMPactivity: relevance to cancer. Curr Med Chem. 2001 Feb;8(3):257-60.

[2]. Liu Y, A chemically modified tetracycline (CMT-3) is a new antifungal agent. Antimicrob Agents Chemother. 2002 May;46(5):1447-54.

[3]. CMT-3 inhibits orthodontic tooth displacement in the rat. Arch Oral Biol. 2007 Jun;52(6):571-8.

因环利奈德已用于研究治疗 HIV 感染、艾滋病相关卡波西肉瘤、脑和中枢神经系统肿瘤以及特定方案下未明确类型的成人实体瘤的临床试验。
因环利奈德是一种化学修饰的四环素类药物，具有潜在的抗肿瘤活性。因环利奈德可抑制基质金属蛋白酶 (MMPs)，从而诱导细胞外基质降解，并抑制血管生成、肿瘤生长、侵袭和转移。该药物还会导致肿瘤细胞线粒体去极化，并诱导细胞凋亡和组织坏死。

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CMT-3是一种化学修饰的四环素，其开发目的是为了抑制基质金属蛋白酶（MMPs），而不具有抗生素活性。[1]
抑制正畸牙齿移动的机制包括直接抑制MMP活性（可能损害骨有机基质的降解）以及减少受压侧的破骨细胞数量。[1]
破骨细胞数量减少的可能机制包括：特异性地诱导活化破骨细胞凋亡、破骨细胞与骨的粘附受损导致脱落、抑制破骨细胞迁移（可能通过减少MMP-9）或单核前体细胞分化受损。各组间牙周膜中ED-1阳性细胞数量未发生改变，表明其募集可能不受影响，从而有利于对活性破骨细胞的作用。[1]
该研究提示，由于正畸复发涉及类似的组织重塑过程，CMT-3可能有助于预防正畸治疗后的复发。[1]

C19H17NO7

371.34

371.101

C, 61.45; H, 4.61; N, 3.77; O, 30.16

15866-90-7

54678924

Light yellow to yellow solid powder

1.28

158.15

5

7

1

27

813

3

O=C(C(C1=O)=C(O)C[C@]2([H])C[C@]3([H])CC4=C(C(C3=C(O)[C@@]21O)=O)C(O)=CC=C4)N

ZXFCRFYULUUSDW-OWXODZSWSA-N

InChI=1S/C19H17NO7/c20-18(26)14-11(22)6-9-5-8-4-7-2-1-3-10(21)12(7)15(23)13(8)16(24)19(9,27)17(14)25/h1-3,8-9,21-22,24,27H,4-6H2,(H2,20,26)/t8-,9-,19-/m0/s1

(4aS,5aR,12aS)-3,10,12,12a-tetrahydroxy-1,11-dioxo-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydrotetracene-2-carboxamide

COL3; COL-3; COL 3; CMT-3; CMT 3; CMT3; Incyclinide; 4-dedimethylamino sancycline; Chemically modified tetracycline-3. Trade name: Metastat.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.73 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。