K-604 HCl   中文名称: K-604 dihydrochloride

ACAT-1/acyl-CoA:cholesterol acyltransferase 1 (IC50 = 0.45 μM)

研究了K-604针对人类 ACAT-1 和 ACAT-2 的有效性和选择性。 K-604 对 ACAT-1 的选择性比 ACAT-2 高 229 倍，其对人 ACAT-1 的 IC50 值为 0.45 μM，对人 ACAT-2 的 IC50 值为 102.85 μM。 Ki 值为 0.378 μM，动力学研究表明该抑制作用与油酰辅酶 A 具有竞争性。 K-604的IC50值为68 nM，可有效抑制人巨噬细胞中胆固醇的酯化[1]。在无细胞生化实验中，0.5 µM 的 K604 显着降低 ACAT1 酶活性，但不降低 ACAT2 酶活性。用 K604 处理 N2a 细胞，看看抑制 ACAT1 是否会促进神经元细胞的自噬。在 0.1 至 1 µM 剂量下，K604 可抑制 ACAT 活性 60-80%。将K604以0.1至1μM的剂量添加至N2a细胞24小时后，使用蛋白质印迹法测量LC3的水平。研究结果表明，K604 以剂量依赖性方式增强 LC3-II/LC3-I 比率，这是自噬体产生的一个可靠指标。用 K604 处理后，N2a 细胞的荧光 LC3 斑点数量显着增加。通过蛋白质印迹分析，K604 显着降低了 N2a 细胞中 p62 的含量 [2]。

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K-604对ACAT-1的竞争性抑制作用 免疫印迹分析显示，从CHO-ACAT-1和CHO-ACAT-2细胞中获得的微粒体组分分别含有人ACAT-1蛋白和ACAT-2蛋白（图2A）。动力学分析表明，[14C]油酰辅酶A对人ACAT-1和人ACAT-2的Vmax值分别为21.8和4.0 nmol/min/mg蛋白质。[14C]油酰辅酶A对ACAT-1和ACAT-2的Km值分别为4.62和9.99μmol/L。接下来，我们描述了K-604对ACAT-1的酶抑制作用。双倒数图清楚地表明，K-604对ACAT-1的抑制是竞争性的，而不是非竞争性的（图3A）。K-604与油酰辅酶a竞争性抑制酶活性，Ki值为0.378μmol/L（图3B）。

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K-6044对ACAT-1的选择性 我们检测了K-604对人ACAT-1和ACAT-2的效力和选择性。与CI-1011相比，K-604对ACAT-1活性的抑制更有效（图4A），而CI-1011对ACAT-2活性的抑制比K-604更有效（见图4B）。K-604对ACAT-1和ACAT-2的IC50值分别为0.45μmol/L和102.85μmol/L，表明K-604对ACAT-1的选择性比ACAT-2高229倍。与K-604相比，CI-1011对ACAT-2和ACAT-1的IC50值无法区分（表1）。因此，K-604被认为是一种有效且高度选择性的ACAT-1抑制剂。

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K-604抑制人单核细胞来源巨噬细胞中的胆固醇酯化[1]
我们研究了K-604对培养的人单核细胞衍生巨噬细胞中胆固醇酯化（外源添加的[14C]油酸酯代谢掺入ACAT反应产生的细胞内胆固醇[14C]烯酸酯）的影响。用AcLDL孵育人巨噬细胞22小时，然后在[14C]油酸盐存在下用K-604再孵育2小时。图5显示，K-604有效地抑制了人巨噬细胞中的胆固醇酯化，IC50值为68 nmol/L。

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K-604增强THP-1细胞的胆固醇流出[1]
我们研究了K-604对THP-1细胞衍生巨噬细胞胆固醇流出的影响。THP-1巨噬细胞用[3H]胆固醇标记的AcLDL预处理48小时，以诱导胆固醇酯积聚。随后，在不同浓度的K-604存在下，将细胞与200μg/mL HDL3一起孵育24小时。如图6所示，K-604以剂量依赖的方式增强HDL3介导的细胞[3H]胆固醇外流。在0.1μmol/L时，K-604对胆固醇流出的增强作用变得显著。还研究了K-604对载脂蛋白A-I介导的胆固醇流出的影响。图7显示，在0.1μmol/L或更高的浓度下，K-604显著增强了apo-A-I介导的细胞[3H]胆固醇外流。

使用 F1B 仓鼠（一种易患饮食引起的高脂血症和动脉粥样硬化的动物模型）研究了 K-604对主动脉病变区域和血浆胆固醇水平的影响。 K-604 的给药不会影响体重或食物消耗。脂肪喂养的仓鼠的血浆胆固醇水平比食物喂养的仓鼠高约 12 倍，并且 K-604 仅在最高测试剂量 (30 mg/kg) 下才显着降低血浆胆固醇水平，但在较低剂量 (1 - 10 毫克/千克）。油红O染色的脂肪条纹病变在很大程度上是由高脂肪饮食引起的，并且在K-604治疗后显着减少。此外，还进行了动脉粥样硬化病变的组织学研究。对照中的脂肪条纹病变是通过内皮下空间中泡沫状巨噬细胞的存在来定义的。相比之下，注射 K-604 后，泡沫巨噬细胞占据的区域显着减少[1]。

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K-604抑制动脉粥样硬化病变，而不影响高脂肪喂养的F1B仓鼠的血浆胆固醇水平[1]
我们使用易受饮食诱导的高脂血症和动脉粥样硬化影响的动物模型F1B仓鼠，评估了K-604对主动脉病变面积和血浆胆固醇水平的影响。服用K-604不会影响体重或食物摄入量。如图7所示，脂肪喂养的仓鼠的血浆胆固醇水平比食物喂养的仓鼠高出约12倍，K-604仅在最高测试剂量（30mg/kg）下显著降低，但在较低剂量（1-10mg/kg）下没有显著降低（图7）。
油红O染色的脂肪条纹病变明显是由高脂肪饮食引起的（图8a），服用K-604后显著减少（图8b）。此外，我们对动脉粥样硬化病变进行了组织学分析。对照组的脂肪条纹病变的特征是泡沫状巨噬细胞在内皮下空间积聚（图8c）。相比之下，服用K-604后，泡沫巨噬细胞所占的面积显著减少（图8d）。

ACAT活性测定[1]
如前所述，通过测量胆固醇[14C]油酸酯的产生来测定ACAT活性。来源于CHO-ACAT-1或CHO-ACAT-2细胞的微粒体组分用2.5%3-[（3-氨基丙基）二甲基铵]-1-丙磺酸酯（CHAPS）在0.5 mol/L KCl、0.5 mmol/L EDTA和25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.8）（缓冲液A）中稀释至最终蛋白质浓度为1.0 mg/mL。在10μL缓冲液A中含有9.2μg ACAT-1蛋白质或4.9μg ACAT-2蛋白质的微粒体组分与不同浓度的K-604或CI-1011在5μL二甲亚砜（DMSO）中混合，并用152.5μL在25、0.5 mmol/L EDTA和Tris-HCl（pH 7.8）中含有1.6 mmol/L胆固醇、11.2 mmol/L磷脂酰胆碱和9.3 mmol/L牛磺胆酸盐的混合胶束。通过加入10μL 0.45μmol/L[14C]油酰辅酶A、10 nmol/L无脂肪酸牛血清白蛋白（无脂肪酸BSA）和25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.8）开始反应。反应混合物在37°C下孵育25分钟，并通过加入150μL氯仿/甲醇（2:1）终止。在氮气流下干燥有机相。脂质用150μL氯仿/甲醇（2:1）重新悬浮，并使用己烷/乙醚/乙酸（75:25:1）通过薄层色谱法（TLC）展开。使用BAS 2500图像分析仪测定胆固醇[14C]油酸酯的放射性。

人单核细胞来源巨噬细胞中的胆固醇酯化反应[1]
胆固醇酯化率采用Wilde等人的方法测定。将健康志愿者的外周血单核细胞（4.0×105个细胞）悬浮在0.4 mL含有10%人血清的RPMI1640中，并接种到48孔板的每个孔上。将细胞孵育7天以分化为巨噬细胞。将培养基替换为0.2 mL含有10%人血清和100μg/mL乙酰化低密度脂蛋白（AcLDL）的RPMI1640，然后孵育22小时。在2μL DMSO和2μL含有12%BSA、10 mmol/L油酸钠和41.7μCi/mL[14C]油酸的盐水中加入不同浓度的K-604后，将细胞再孵育2小时。用0.2 mL己烷/异丙醇（3:2）提取细胞脂质两次，并按照ACAT活性测定中所述测定胆固醇[14C]油酸酯的放射性。

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THP-1巨噬细胞胆固醇外流[1]
用含有10%胎牛血清、100μg/mL链霉素和50μmol/L 2-巯基乙醇（培养基A）的0.5 mL RPMI1640维持人单核细胞THP-1细胞（ATCC TIB202；Dainippon Pharmaceutical Co.Ltd，Osaka，Japan）。在实验中，将THP-1细胞（5×105）接种到24孔板上，在含有0.1μg/mL佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯的培养基A中培养3天，以诱导分化为巨噬细胞。细胞用含有40μg/mL用[3H]胆固醇标记的AcLDL的培养基A进一步孵育48小时。为了分析HDL3介导的胆固醇流出，用0.5 mL培养基A洗涤细胞，并在存在或不存在不同浓度的K-604的情况下，在含有HDL3（200μg/mL）的0.5 mL培养基A中进一步孵育24小时。为了分析载脂蛋白A-I（apoA-I）介导的胆固醇流出，在相同条件下用10μg/mL的载脂蛋白AI代替HDL3。通过计算细胞释放的[3H]胆固醇来确定胆固醇流出。最后，将细胞溶解在0.5 mL含有0.5%Triton X-100的1.0 mmol/L HEPES中，以测定细胞相关放射性。

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将小鼠神经母细胞瘤细胞系N2a在37°C、5%CO2的加湿培养箱中，在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/Opti-MEM（50:50）中培养。细胞与浓度如所示的ACAT1特异性抑制剂K-604或同种型非特异性ACAT抑制剂CI-1011一起孵育24小时。将K-604和CI-1011溶解在100%乙醇中，分别制成5 mM和10 mM的储备，并在-20°C下储存直至使用。在出生后第0-3天，使用所述程序从小鼠大脑中分离出初级皮质神经元（Brewer，1997；Bryleva等人，2010）。皮质神经元以350000个细胞/孔的密度铺在6孔板上，并在含有1xB27、0.5 mM L-谷氨酰胺和5 ng/mL成纤维细胞生长因子的2 mL/孔Neurobase A中生长。每7天用新鲜培养基更换一半的培养基。在培养14-21天后，如图5和图6的图例[2]所述，将细胞用于单独的实验。

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N2a细胞中人类tau水平的分析[2]
使用先前描述的编码WT tau（pRK5-EGFP-tau）和P301L tau（pKK5-EGFPTau P301L）的质粒DNA。N2a细胞在6孔板中生长至约50%融合，并如Lipofectamine 3000所示用质粒转染。转染后24小时，在存在或不存在5 mM 3-甲基腺嘌呤（3MA）的情况下，将细胞在含有10%FBS的新鲜DMEM/Opti MEM（50:50）中指示的浓度下与或不与K-604一起孵育24小时。然后用蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物在RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.6，1%Triton X，1%SDS，0.5%脱氧胆酸钠）中裂解细胞，并通过蛋白质印迹分析tau水平。

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流式细胞术分析细胞酸性区室[2]
实验如前所述进行（Shibuya等人，2014）。简而言之，如0.5µMK-604所示，对初级皮质神经元进行预处理一段时间。对照细胞仅接受溶剂载体。然后用50nM LysoTracker孵育细胞30分钟，并用PBS洗涤两次。使用BD FACSCanto通过流式细胞术分析LysoTracker阳性（细胞酸性）区室。通过碘化丙啶染色将死细胞排除在分析之外。使用FlowJo软件对数据进行分析。

Animal experiments [1]
Male F1B hamsters (n = 30) at 8 weeks old were used for animal experiments. The animal room was controlled at 23 ± 3 °C and relative humidity of 50 ± 20%. Animals were fed a CE-2 chow diet, followed by supplementation with CE-2 containing 0.3% cholesterol and 10% coconut oil for 10 weeks. During fat loading, K-604 was administered orally at 1, 3, 10, or 30 mg/kg/day (n = 6 for each dose group). The control group (n = 6) received an aqueous solution of 0.5% methylcellulose instead of K-604. Tap water was given ad libitum. Body weight was measured at the time of drug administration. Blood was sampled for determination of plasma cholesterol levels using a commercially available kit.

[1]. A selective ACAT-1 inhibitor, K-604, suppresses fatty streak lesions in fat-fed hamsters without affecting plasma cholesterol levels. Atherosclerosis. 2007 Apr;191(2):290-7.

[2]. Acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase 1 blockage enhances autophagy in the neurons of triple transgenic Alzheimer's disease mouse and reduces human P301L-tau content at the presymptomatic stage. Neurobiol Aging. 2015 Jul;36(7):2248-2259.

Background: Acyl-coenzyme A:cholesterol O-acyltransferase-1 (ACAT-1), a major ACAT isozyme in macrophages, plays an essential role in foam cell formation in atherosclerotic lesions. However, whether pharmacological inhibition of macrophage ACAT-1 causes exacerbation or suppression of atherosclerosis is controversial.
Methods and results: We developed and characterized a novel ACAT inhibitor, K-604. The IC(50) values of K-604 for human ACAT-1 and ACAT-2 were 0.45 and 102.85 micromol/L, respectively, indicating that K-604 is 229-fold more selective for ACAT-1. Kinetic analysis indicated that the inhibition was competitive with respect to oleoyl-coenzyme A with a K(i) value of 0.378 micromol/L. Exposure of human monocyte-derived macrophages to K-604 inhibited cholesterol esterification with IC(50) of 68.0 nmol/L. Furthermore, cholesterol efflux from THP-1 macrophages to HDL(3) or apolipoprotein A-I was enhanced by K-604. Interestingly, administration of K-604 to F1B hamsters on a high-fat diet at a dose of >or=1mg/kg suppressed fatty streak lesions without affecting plasma cholesterol levels.
Conclusions: K-604, a potent and selective inhibitor of ACAT-1, suppressed the development of atherosclerosis in an animal model without affecting plasma cholesterol levels, providing direct evidence that pharmacological inhibition of ACAT-1 in the arterial walls leads to suppression of atherosclerosis. [1]

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In summary, we developed and characterized a novel ACAT inhibitor, K-604, which is highly selective for ACAT-1, and observed that this compound suppressed the formation of the macrophage enriched-fatty streak in fat-fed hamsters without affecting plasma cholesterol levels. Our results indicate that pharmacological inhibition of macrophage ACAT-1 in vascular walls leads to suppression of experimental atherosclerosis. The therapeutic potential of K-604 for the progression of atherosclerosis in human should be examined in the future clinical studies. [1]

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The “ACAT inhibitor” CI-1011 fed to animals or fed to humens decreased the plasma concentrations of total triglyceride content (Llaverías et al., 2003), presumably because CI 1011 also inhibits the enzyme activity of diacyl glycerol acyltransferase 1 (DGAT1), a different MBOAT member. At present K-604 is the only small molecule ACAT1 inhibitor available. In cell free biochemical assays, K604 at 0.5 µM inhibited ACAT1 enzymatic activity by 70% without significantly inhibiting the ACAT2 enzyme activity (Ikenoya et al., 2007). In cultured neurons and cultured microglial cells, our results show that the effects of K604 at 0.5 µM corroborate the effects of Acat1 KO. However, these results do not exclude the possibility that at higher concentration, K-604 may inhibit other member(s) of the MBOAT family. A second concern for using the currently available ACAT inhibitors to treat neurodegenerative diseases is that many ACAT inhibitors are very hydrophobic compounds and possess membrane active property (Homan and Hamelehle, 2001). The membrane active compounds can be sequestered within the lipid bilayer and reach high local concentration to affect membrane properties non-specifically. The short term and long term effects of these compounds in the CNS are unknown. To treat AD and other related neurodegenerative diseases, we encourage the development of new small molecule ACAT1-specific inhibitors that are blood brain barrier permeable while devoid of various off-target side effect(s) described above.[2]

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Patients with Alzheimer's disease (AD) display amyloidopathy and tauopathy. In mouse models of AD, pharmacological inhibition using small molecule enzyme inhibitors or genetic inactivation of acyl-coenzyme A (Acyl-CoA):cholesterol acyltransferase 1 (ACAT1) diminished amyloidopathy and restored cognitive deficits. In microglia, ACAT1 blockage increases autophagosome formation and stimulates amyloid β peptide1-42 degradation. Here, we hypothesize that in neurons ACAT1 blockage augments autophagy and increases autophagy-mediated degradation of P301L-tau protein. We tested this possibility in murine neuroblastoma cells ectopically expressing human tau and in primary neurons isolated from triple transgenic AD mice that express mutant forms of amyloid precursor protein, presenilin-1, and human tau. The results show that ACAT1 blockage increases autophagosome formation and decreases P301L-tau protein content without affecting endogenous mouse tau protein content. In vivo, lacking Acat1 decreases P301L-tau protein content in the brains of young triple transgenic AD mice but not in those of old mice, where extensive hyperphosphorylations and aggregation of P301L-tau take place. These results suggest that, in addition to ameliorating amyloidopathy in both young and old AD mice, ACAT1 blockage may benefit AD by reducing tauopathy at early stage.[2]

C23H31CLN6OS3

539.179839372635

574.117

C, 47.99; H, 5.60; Cl, 12.32; N, 14.60; O, 2.78; S, 16.71

217094-32-1

217094-32-1 (HCl);561023-90-3;

22272715

White to light yellow solid powder

153

4

8

9

35

623

0

N(C1=C(N=C(C)C=C1SC)SC)C(=O)CN1CCN(CCSC2NC3C=CC=CC=3N=2)CC1.Cl

DEKWEGUBUYKTAV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H30N6OS3.2ClH/c1-16-14-19(31-2)21(22(24-16)32-3)27-20(30)15-29-10-8-28(9-11-29)12-13-33-23-25-17-6-4-5-7-18(17)26-23;;/h4-7,14H,8-13,15H2,1-3H3,(H,25,26)(H,27,30);2*1H

2-[4-[2-(1H-benzimidazol-2-ylsulfanyl)ethyl]piperazin-1-yl]-N-[6-methyl-2,4-bis(methylsulfanyl)pyridin-3-yl]acetamide;dihydrochloride

K-604 HCl; K-604 Hydrochloride; K-604 dihydrochloride; 217094-32-1; 2-(4-(2-((1H-Benzo[d]imidazol-2-yl)thio)ethyl)piperazin-1-yl)-N-(6-methyl-2,4-bis(methylthio)pyridin-3-yl)acetamide dihydrochloride; 2-[4-[2-(1H-benzimidazol-2-ylsulfanyl)ethyl]piperazin-1-yl]-N-[6-methyl-2,4-bis(methylsulfanyl)pyridin-3-yl]acetamide;dihydrochloride; 2-[4-[2-(BENZIMIDAZOL-2-YLTHIO)ETHYL]PIPERAZIN-1YL]-N-[2,4-BIS(METHYLTHIO)-6-METHYL-3-PYRIDYL]ACETAMIDE DIHYDROCHLORIDE; 2-{4-[2-(1H-1,3-benzodiazol-2-ylsulfanyl)ethyl]piperazin-1-yl}-N-[6-methyl-2,4-bis(methylsulfanyl)pyridin-3-yl]acetamide dihydrochloride; SCHEMBL6283825; SIA09432; K-604; K604; K 604;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~100 mg/mL (~173.72 mM)
DMSO : ~62.5 mg/mL (~108.57 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.25 mg/mL (3.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 22.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.25 mg/mL (3.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 22.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.25 mg/mL (3.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 22.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 100 mg/mL (173.72 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。