KAN0438757

KAN0438757 (72 h) reduces the cell viability of Miapaca-2, PANC1, SW620, U-266, and AMO-1 (IC50: 2.75, 3.83, 7.50, 5.08, 11.53 μM, respectively) [1]. KAN0438757 (10 μM, 6 KAN0438757 (50 μM, 12 hours) lowers homologous recombination (HR) activity and increases ionizing radiation (IR)-induced γH2AX foci levels in U2OS cells [1]. KAN0438757 (50 μM, 12 hours ) can reduce HCT-116, SW-1463 and HUVEC KAN0438757 (0-50 μM, 24 hours) can reduce HCT-116 carbohydrates and glycolysis in HUVEC [2].

KAN0438757 (72 h) 降低 Miapaca-2、PANC1、SW620、U-266 和 AMO-1 的细胞活力（IC50 分别为：2.75、3.83、7.50、5.08、11.53 μM）[1]。 KAN0438757（10 μM，6 KAN0438757（50 μM，12 小时）可降低 U2OS 细胞中的同源重组 (HR) 活性并增加电离辐射 (IR) 诱导的 γH2AX 焦点水平 [1]。KAN0438757（50 μM，12 小时）可降低HCT-116、SW-1463 和 HUVEC KAN0438757（0-50 μM，24 小时）可以减少 HUVEC 中的 HCT-116 碳水化合物和糖酵解 [2]。

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前药 KAN0438757（为提高细胞通透性和细胞内水解为活性酸形式而设计）在胰腺癌（MIA PaCa-2）、胃癌（NUGC-3）和结肠癌（SW620）细胞系中，能以亚微摩尔级的IC50值显著抑制细胞内果糖-2,6-二磷酸（F-2,6-P2）水平，而其酸形式 KAN0438241 在细胞中的活性较弱 [1]。
通过磺酰罗丹明B法测定，KAN0438757 在长时间（72小时）孵育后能降低多种癌细胞系（MIA PaCa-2, PANC-1, SW620, SW480）的活力 [1]。
在U2OS细胞中，用 KAN0438757 （10 μM）抑制PFKFB3会损害电离辐射（IR）诱导的同源重组（HR）修复因子RPA32和RAD51向核病灶的募集 [1]。
在U2OS细胞的DR-GFP报告基因实验中，KAN0438757 处理将使HR修复活性降低至溶剂对照组的约10%，此效果比ATR抑制更强 [1]。
在IR处理前用 KAN0438757 处理U2OS细胞，会导致IR后24小时γH2AX病灶（DNA双链断裂标志物）水平显著升高，表明DNA修复能力下降 [1]。
KAN0438757 在克隆形成实验中能诱导放射增敏作用。在IR前用 KAN0438757 （10 μM）预处理U2OS细胞，会导致克隆形成呈剂量依赖性减少 [1]。
KAN0438757 的放射增敏作用对转化细胞具有选择性。在同源细胞对中，KAN0438757 联合IR处理能显著降低转化型BJ RAS细胞的克隆形成存活率，而在相同浓度下对非转化型BJ TERT（hTERT永生化）细胞仅产生轻微影响。相比之下，ATM或ATR抑制剂联合IR会严重降低转化和非转化细胞的存活率 [1]。
过表达RAD51可以挽救经 KAN0438757 在其IC50浓度下联合IR处理的BJ RAS细胞的克隆形成存活率，这表明其毒性与其导致的HR功能丧失有关 [1]。
KAN0438757 处理会损害IR诱导的U2OS细胞G2/M期EdU（胸腺嘧啶类似物）掺入增加，提示其在修复合成过程中的脱氧核苷酸掺入中发挥作用 [1]。
KAN0438757 处理消除了IR诱导的PFKFB3与核糖核苷酸还原酶（RNR）RRM2亚基在核病灶中的共定位，并且敲低PFKFB3也会阻断RRM2的募集，这表明PFKFB3的活性位于RRM2向损伤位点募集的上游 [1]。
免疫共沉淀实验显示，在IR后2小时，FLAG标记的PFKFB3与RRM2之间存在相互作用，而在非IR条件下则未检测到 [1]。
KAN0438757 处理（10-30 μM，4小时）会降低U2OS细胞中每个细胞的EdU掺入强度，其效果与羟基脲（HU）相似，表明DNA复制受损 [1]。
DNA纤维实验表明，KAN0438757 处理（10 μM，24小时）严重降低了U2OS细胞中复制叉的速度。这种损害可通过在处理期间补充核苷（腺苷、胞苷、鸟苷、尿苷）来恢复 [1]。
用 KAN0438757 （10 μM）处理U2OS细胞4小时和24小时，会导致所有四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）的水平下降50-75% [1]。
与羟基脲（HU）不同，KAN0438757 的抑制不会诱导RPA包裹的ssDNA、p53的诱导或ATR、ATM、Chk1、H2AX的磷酸化，表明它导致复制叉停滞，但并未立即引起复制叉崩溃或检查点激活 [1]。
细胞热转移分析（CETSA）证实了 KAN0438757 在U2OS细胞中与PFKFB3的细胞内靶点结合，其浓度与其细胞活性一致，并且这种结合在处理24小时和72小时后仍然持续 [1]。

在 C57BL6/N 模型中，KAN0438757（腹腔注射，10；25；50 mg/kg）耐受性良好，没有表现出任何显着的全身毒性作用[2]。

使用ADP-Glo法测定重组人PFKFB3的激酶活性。该法通过检测从ATP和果糖-6-磷酸（F6P）生成ADP和F-2,6-P2来量化激酶活性。反应终止后，消耗剩余的ATP。然后将ADP转化回ATP，并通过萤光素酶/萤光素反应测量新合成的ATP，产生的化学发光与激酶活性成正比。抑制剂在与底物孵育前先与酶预孵育 [1]。
使用此实验形式测定了化合物对PFKFB3和PFKFB4的抑制效力（IC50）[1]。
通过将 KAN0438241 （200 μM）滴定到PFKFB3蛋白（20 μM）中进行等温滴定量热法（ITC）实验，以确认结合并确定亲和力 [1]。

克隆形成实验： 将U2OS、BJ TERT或BJ RAS细胞以低密度接种。对于siRNA实验，细胞转染后24小时进行辐照，然后接种进行克隆形成。对于抑制剂研究，细胞用溶剂或 KAN0438757 处理24小时，然后辐照。抑制剂在指定时间后（抑制剂研究为72小时，siRNA研究为4小时）洗去。让细胞形成克隆数天（根据细胞系不同为4-12天），然后固定，用亚甲蓝染色并手动计数 [1]。
免疫荧光显微镜与病灶定量： 将细胞培养在盖玻片上，进行处理和/或辐照。为观察PFKFB3、RPA32、RAD51、γH2AX和RRM2等修复病灶蛋白，细胞在固定前需进行原位细胞分级分离（用含去垢剂的细胞骨架缓冲液提取）以降低背景。然后固定、透化、封闭，并与一抗和荧光二抗孵育。用DAPI染色DNA。通过共聚焦显微镜获取图像。使用CellProfiler软件对病灶数量、强度和共定位进行定量 [1]。
DR-GFP同源重组修复实验： 用siRNA或抑制剂处理U2OS DR-GFP报告细胞。24小时后，转染I-SceI核酸内切酶表达载体以诱导位点特异性双链断裂。转染后24-48小时，收集细胞，通过流式细胞术测量GFP阳性细胞百分比（表示成功的HR修复）。HR活性相对于对照处理细胞计算 [1]。
EdU掺入实验（修复合成）： 处理U2OS细胞，辐照，并在不同恢复时间点用EdU脉冲标记30分钟。固定细胞，通过基于点击化学的荧光标记检测掺入的EdU。用Hoechst染色DNA含量。通过流式细胞术定量处于G2/M期（基于DNA含量）且EdU阳性的细胞，以特异性评估修复过程中的核苷酸掺入，排除S期复制 [1]。
EdU掺入实验（复制）： 用化合物处理U2OS细胞数小时，在最后40分钟用EdU脉冲标记，然后固定。通过点击化学检测掺入的EdU，并使用图像分析软件（CellProfiler）定量每个细胞的荧光强度 [1]。
DNA纤维实验： 用抑制剂处理U2OS细胞24小时。用两种不同的卤代核苷酸（CldU标记20分钟，然后IdU标记20分钟）顺序标记复制叉。收集细胞，将DNA纤维铺在载玻片上，固定并变性。用特异性抗体检测掺入的核苷酸。使用ImageJ软件测量IdU和CldU轨迹的长度，并计算复制叉速度（单位：千碱基/分钟）[1]。
细胞内dNTP测量： 使用基于HIV-1逆转录酶的方法测量dNTP水平。将细胞胰酶消化、计数，并用甲醇提取dNTP。将干燥的提取物重悬，在存在特定引物/模板和一种dNTP的情况下，由HIV-1 RT进行引物延伸反应。延伸产物的量（对应于提取物中该特定dNTP的水平）被量化。dNTP含量根据细胞数归一化，并与对照处理相比较 [1]。
细胞热转移分析（CETSA）： 用 KAN0438757 或DMSO处理U2OS细胞，收集细胞，并通过冻融循环裂解。将细胞裂解物分装，加热到一系列温度，然后离心去除沉淀的蛋白质。通过蛋白质印迹法分析上清液中残留的可溶性PFKFB3蛋白。通过比较药物处理组与溶剂对照组中PFKFB3的溶解曲线来评估其稳定性（指示配体结合）[1]。
Van Schaftingen实验（细胞内F-2,6-P2）： 将癌细胞在低葡萄糖/低血清培养基中饥饿过夜，然后用化合物处理并加入葡萄糖刺激。用NaOH裂解细胞，并将裂解液中和。使用基于焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶-1（PPi-PFK）被F-2,6-P2强效激活的偶联酶法来量化F-2,6-P2水平。这种激活导致NADH的消耗，通过分光光度法监测。吸光度的下降在线性范围内与F-2,6-P2浓度成正比 [1]。

在药物发现过程中，化合物的性质被表征，例如缓冲液稳定性、溶解度、代谢稳定性、血浆稳定性、蛋白质结合和渗透性[1]。
具体而言，KAN0438757（活性酸KAN0438241的酯）的前药设计旨在提高细胞渗透性，并实现有效的细胞内水解以释放活性化合物[1]。

与癌细胞系不同，外周血单核细胞 (PBMC) 的活力在 PFKFB3 被 KAN0438757 抑制后并未受到影响 [1]。
在克隆形成实验中，未转化的 BJ TERT 细胞在 KAN0438757 浓度下仅表现出轻微的存活率下降，而转化的 BJ RAS 细胞的存活率却显著降低，尤其是在与 IR 联合使用时，这表明存在潜在的治疗窗口 [1]。

[1]. Targeting PFKFB3 radiosensitizes cancer cells and suppresses homologous recombination. Nat Commun. 2018 Sep 24;9(1):3872.

[2]. Effects of the Novel PFKFB3 Inhibitor KAN0438757 on Colorectal Cancer Cells and Its Systemic Toxicity Evaluation In Vivo. Cancers (Basel). 2021 Feb 28;13(5):1011.

KAN0438757是一种选择性小分子糖酵解酶PFKFB3抑制剂，其开发目的是为了研究PFKFB3在DNA修复中的作用[1]。
该研究揭示了PFKFB3在DNA损伤反应中一种新的、非经典的作用。PFKFB3通过MRN-ATM-γH2AX-MDC1通路被募集到DNA双链断裂位点。其酶活性对于后续募集核糖核苷酸还原酶的 RRM2 亚基和 HR 修复因子（RPA、RAD51）是必需的，从而促进局部 dNTP 的产生和修复合成 [1]。
用 KAN0438757 抑制 PFKFB3 会损害同源重组修复，减少细胞 dNTP 池，停滞复制叉，并使癌细胞对电离辐射敏感，同时不影响非转化细胞。这使得PFKFB3抑制成为癌症特异性放射增敏的潜在策略[1]。
先前报道的PFKFB3抑制剂3-PO在作者的酶促或细胞HR修复试验中未显示活性，促使人们开发了KAN0438757[1]。
活性代谢物KAN0438241与人PFKFB3的共晶结构显示，它结合在果糖-6-磷酸底物口袋中，模拟内源性底物的相互作用，并且是一种非ATP竞争性抑制剂[1]。

C21H18FNO7S

447.433528423309

447.078

1451255-59-6

71586631

Typically exists as solid at room temperature

3.2

142

4

9

8

31

700

0

QRDFCYMUXHUTCS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H18FNO7S/c22-14-4-7-19(25)18(11-14)13-2-1-3-16(10-13)31(28,29)23-15-5-6-17(20(26)12-15)21(27)30-9-8-24/h1-7,10-12,23-26H,8-9H2

2-hydroxyethyl 4-[[3-(5-fluoro-2-hydroxyphenyl)phenyl]sulfonylamino]-2-hydroxybenzoate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~130 mg/mL (~290.55 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.17 mg/mL (4.85 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 21.7 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.17 mg/mL (4.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 21.7 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.17 mg/mL (4.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 21.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。