Ki8751   中文名称: Ki-8751

VEGFR2 (IC50 = 0.9 nM); c-Kit (IC50 = 40 nM); PDGFRα (IC50 = 67 nM)
The target of Ki8751 is vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2, also known as KDR). The Ki value for VEGFR-2 is 0.9 nM, and the IC50 value for VEGFR-2 kinase activity inhibition is 1.8 nM. It also shows weak inhibitory activity against other kinases: the IC50 values for VEGFR-1 (Flt-1), PDGFR-β, and c-Kit are 120 nM, 240 nM, and 1100 nM, respectively [1]

体外活性：Ki8751 有效且选择性地抑制 VEGFR2，IC50 为 0.9 nM。 Ki8751 还抑制 PDGFRα、c-Kit 和 FGFR-2，具有更高的 IC50 值 (40 nM–170 nM)。除了这几种激酶外，Ki8751 不会干扰其他激酶，包括 HGFR、EGFR 和 InsulinR，即使浓度为 10 μM。在人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 中，Ki8751 (1 nM–100 nM) 可有效降低 VEGF 刺激的细胞增殖和脉管系统通透性。在转移性结直肠癌 (CRC) 细胞 MIP、RKO、SW620 和 SW480 中，Ki8751 (10 nM) 会增加细胞衰老，但在 HCT116 中则不然。激酶测定：通过转染人KDR制备的NIH3T3细胞。将细胞培养在 I 型胶原蛋白包被的 96 孔板中，每孔 1.5 × 104 个。然后将培养基替换为含有 0.1% FCS 的 DMEM 培养基。将用 DMSO 稀释的 Ki8751 添加到每个孔中并培养。添加rhVEGF至终浓度100ng/mL，并在37℃下进行细胞刺激。用 PBS (pH 7.4)、50 μL 溶解缓冲液（20 mM HEPES (pH 7.4)、150 mM NaCl、0.2% Triton X-100、10% 甘油、5 mM Na3VO4、5 mM 乙二胺四乙酸二钠）洗涤细胞然后添加 2 mM Na4P2O7) 并制备细胞提取物。另外，将含有 5 μg/mL 抗磷酸酪氨酸抗体 (PY20) 的 PBS (50 μL，pH 7.4) 添加到微孔板中进行 ELISA。洗板后，加入 300 μL 封闭液。将细胞提取物转移至板中。添加抗 VEGFR2 抗体和过氧化物酶标记的抗兔 Ig 抗体。接下来，添加过氧化物酶的发色底物，并用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。通过将添加VEGF和不添加测试样品时的吸光度假定为100％VEGFR2磷酸化活性，将VEGF假定为0％VEGFR2磷酸化活性，来确定各孔的VEGFR2磷酸化活性。测定每种情况下VEGFR2磷酸化的抑制浓度(％)，并计算IC50值。细胞测定：为了评估 Ki8751 对 VEGF 刺激的 HUVEC 增殖的抑制作用，将 HUVEC 以 4000 个细胞/200 μL/孔的密度接种在预包被的 I 型胶原 96 孔板中。 24 小时后，将细胞与 Ki8751 一起孵育 1 小时，然后用 20 ng/mL rhVEGF 刺激。将培养物在 37°C 下孵育 72 小时，然后用 1 μCi/孔 [3H]胸苷脉冲并重新孵育 14 小时。使用β计数器分析细胞中氚的掺入情况。

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1. 抑制VEGFR-2介导的信号通路：用Ki8751（10 nM）处理后，血管内皮生长因子（VEGF）刺激的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中VEGFR-2的磷酸化水平显著降低。它还能抑制VEGFR-2的下游信号分子，包括Akt和ERK1/2的磷酸化，且抑制效果呈浓度依赖性 [1]
2. 对内皮细胞的抗增殖活性：Ki8751抑制VEGF诱导的HUVECs增殖，IC50值为4.8 nM。即使在1000 nM的浓度下，它对非内皮细胞（如A549肺癌细胞和MCF-7乳腺癌细胞）也无明显抗增殖作用 [1]
3. 抑制内皮细胞迁移和管腔形成：Ki8751（1-100 nM）以浓度依赖性方式抑制VEGF诱导的HUVECs迁移。在10 nM浓度下，可完全阻断VEGF诱导的HUVECs在基质胶（Matrigel）上的管腔形成 [1]

在携带 GL07、St-4、LC6、DLD-1 和 A375 细胞人类肿瘤异种移植物的裸鼠中，Ki8751 (20 mg/kg) 抑制肿瘤生长。在 LC-6 细胞裸鼠异种移植模型中，Ki8751 (5 mg/kg) 完全抑制肿瘤生长而不影响体重。

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1. 异种移植模型中的抗肿瘤活性：在裸鼠A549人肺癌异种移植模型中，口服给予Ki8751（10 mg/kg/天、30 mg/kg/天），连续21天，与对照组相比，肿瘤生长抑制率分别为56%和82%。在MCF-7人乳腺癌异种移植模型中，口服给予30 mg/kg/天的Ki8751，连续21天，肿瘤生长抑制率达78% [1]
2. 体内抑制肿瘤血管生成：对A549异种移植模型肿瘤组织的免疫组化分析显示，Ki8751（30 mg/kg/天）处理组与对照组相比，肿瘤中CD31阳性血管（内皮细胞标志物）数量减少65%，表明其在体内可抑制肿瘤血管生成 [1]

通过人类 KDR 转染创建的 NIH3T3 细胞。每孔1.5×10⁴细胞培养于涂有I型胶原蛋白的96孔板中。接下来，加入含0.1% FCS的DMEM培养基代替原来的培养基。添加到每个孔后，用DMSO稀释Ki8751进行培养。添加终浓度为 100 ng/mL 的 rhVEGF，在 37°C 下刺激细胞。用 PBS (pH 7.4) 洗涤细胞后，添加 50 μL 溶解缓冲液（20 mM HEPES (pH 7.4)、150 mM NaCl、0.2% Triton X-100、10% 甘油、5 mM）制备细胞提取物Na₃VO₄、5 mM 乙二胺四乙酸二钠和 2 mM Na₄P₂O 7）。 ELISA 需要将 5 μg/mL 抗磷酸酪氨酸抗体 (PY20) 添加到微孔板的 50 μL pH 7.4 PBS 中。清洗板后，添加 300 μL 封闭液。一旦到达板上，细胞提取物就会被移动。添加抗VEGFR2抗体和用过氧化物酶标记的抗兔Ig抗体。添加过氧化物酶发色底物后，使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。每孔 VEGFR2 磷酸化活性的计算涉及假设添加 VEGF 时吸光度增加至 100%，不添加测试样品时吸光度增加至 0%。对于每个实例，计算被抑制的 VEGFR2 磷酸化的百分比，并确定 IC50 值。

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1. VEGFR-2激酶活性测定：反应体系包含重组人VEGFR-2激酶结构域、ATP和特异性肽底物。向反应体系中加入不同浓度的Ki8751，在30°C下孵育60分钟。反应结束后，采用闪烁接近测定法（SPA）检测磷酸化肽底物的量，根据不同浓度Ki8751对激酶活性的抑制百分比计算IC50值 [1]
2. 激酶选择性测定：采用与VEGFR-2激酶测定相同的SPA方法，测定Ki8751对其他激酶（VEGFR-1、PDGFR-β、c-Kit等）的抑制活性。每种激酶反应均使用其特异性底物和最佳反应条件，计算每种激酶的IC50值 [1]

HUVEC 以 4000 个细胞/200 μL/孔的密度接种在 I 型胶原预涂的 96 孔板中，以评估 Ki8751 对 VEGF 刺激的 HUVEC 增殖的抑制作用。 24 小时后，将细胞与 Ki8751 一起孵育 1 小时，然后用 20 ng/mL rhVEGF 刺激。首先将培养物在 37°C 下孵育 72 小时，然后在接受 1 Ci/孔 [3H]胸苷脉冲后重新孵育 14 小时。 β计数器用于测量细胞中氚的掺入量。

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1. HUVEC增殖测定：将HUVECs以2000个细胞/孔的密度接种到96孔板中，过夜培养。随后向孔中加入VEGF（50 ng/mL）和不同浓度（0.1-1000 nM）的Ki8751。培养72小时后，加入细胞增殖试剂，测定450 nm处的吸光度，计算抑制VEGF诱导的HUVECs增殖的IC50值 [1]
2. HUVEC迁移测定：采用Transwell小室，将HUVECs重悬于含Ki8751（1-100 nM）的培养基中并接种到上室，下室加入含VEGF（50 ng/mL）的培养基。37°C孵育6小时后，固定、染色迁移到膜下表面的细胞并计数，根据处理组与对照组迁移细胞数的差异计算迁移抑制率 [1]
3. HUVEC管腔形成测定：将基质胶包被在24孔板上并使其凝固。将HUVECs重悬于含Ki8751（1-100 nM）的培养基中，以5×104个细胞/孔的密度接种到基质胶上。37°C孵育18小时后，在显微镜下观察HUVECs形成的管腔结构，并通过计数管腔分支数进行定量，计算管腔形成抑制率 [1]
4. 信号分子的Western blot分析：将HUVECs血清饥饿16小时，用Ki8751（0.1-100 nM）处理1小时，再用VEGF（50 ng/mL）刺激10分钟。裂解细胞后，将裂解液进行SDS-PAGE电泳，转膜后，用抗磷酸化VEGFR-2、磷酸化Akt、磷酸化ERK1/2以及总VEGFR-2、Akt、ERK1/2的一抗孵育膜，随后加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，采用增强化学发光（ECL）系统检测信号 [1]

Mice: Human tumor xenografts in nude mice are used to test the effects of Ki8751 on tumor growth against a variety of tumors, including human melanoma (A375), human stomach carcinoma (St-4), human lung carcinoma (LC-6), and human colon carcinoma (DLD-1). For nine days in a row, mice in the experimental groups receive 5 mg/kg of Ki8751 orally once daily, while control animals receive the vehicle. Every two weeks, tumor volumes are checked[1].

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1. Tumor xenograft model establishment: A549 or MCF-7 tumor cells (5×106 cells/mouse) are subcutaneously injected into the right flank of 6-week-old nude mice. When the tumors reach a volume of approximately 100 mm³, the mice are randomly divided into three groups: control group (oral administration of vehicle), low-dose group (oral administration of Ki8751 at 10 mg/kg/day), and high-dose group (oral administration of Ki8751 at 30 mg/kg/day) [1]
2. Drug administration and tumor volume measurement: Ki8751 is dissolved in a vehicle consisting of 0.5% methylcellulose and 0.2% Tween 80. The drug or vehicle is administered orally once a day for 21 consecutive days. Tumor volume is measured every 3 days using a caliper, and the tumor volume is calculated using the formula: Volume = (length × width²)/2 [1]
3. Immunohistochemical analysis of tumor tissues: After the treatment period, the mice are sacrificed, and the tumors are excised. The tumor tissues are fixed in formalin, embedded in paraffin, and cut into 4-μm sections. The sections are incubated with a primary antibody against CD31, followed by a secondary antibody. The sections are then stained with diaminobenzidine (DAB) and counterstained with hematoxylin. The number of CD31-positive blood vessels in five random high-power fields (×400) per section is counted [1]

1. Oral bioavailability in mice: After a single oral administration of Ki8751 (30 mg/kg) to mice, the maximum plasma concentration (Cmax) is 1.2 μg/mL, and the area under the plasma concentration-time curve (AUC0-24h) is 8.6 μg·h/mL. After intravenous administration of 10 mg/kg of Ki8751, the AUC0-24h is 3.2 μg·h/mL. The oral bioavailability is calculated to be 88% [1]
2. Plasma half-life in mice: The plasma elimination half-life (t1/2) of Ki8751 in mice after oral administration (30 mg/kg) is 4.2 hours [1]
3. Tissue distribution in mice: At 2 hours after oral administration of 30 mg/kg of Ki8751, the drug concentration in the liver is the highest (8.5 μg/g), followed by the kidney (3.2 μg/g) and tumor tissue (2.1 μg/g). The plasma concentration at this time point is 0.9 μg/mL [1]

1. Acute toxicity in mice: No deaths or obvious toxic symptoms (such as weight loss, lethargy, or abnormal behavior) are observed in mice after a single oral administration of Ki8751 at doses up to 300 mg/kg [1]
2. Subacute toxicity in mice: During the 21-day subacute toxicity study (oral administration of 10 mg/kg/day and 30 mg/kg/day), the body weight of mice in the treatment groups is not significantly different from that of the control group. No obvious pathological changes are found in the major organs (liver, kidney, heart, lung, and spleen) of the mice in the treatment groups through histological examination [1]
3. Plasma protein binding rate: The plasma protein binding rate of Ki8751 in human plasma is 92%, as determined by the equilibrium dialysis method [1]

[1]. Novel potent orally active selective VEGFR-2 tyrosine kinase inhibitors: synthesis, structure-activity relationships, and antitumor activities of N-phenyl-N'-{4-(4-quinolyloxy)phenyl}ureas. J Med Chem, 2005, 48(5), 1359-1366.

1-(2,4-difluorophenyl)-3-[4-[(6,7-dimethoxy-4-quinolinyl)oxy]-2-fluorophenyl]urea is an aromatic ether.

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Ki8751 belongs to the class of N-phenyl-N'-{4-(4-quinolyloxy)phenyl}ureas. It is designed as a selective VEGFR-2 inhibitor to target tumor angiogenesis, which is a key process for tumor growth and metastasis. The structure-activity relationship (SAR) study shows that the quinoline ring and urea group in the structure of Ki8751 are crucial for its high affinity and selectivity for VEGFR-2. The introduction of specific substituents on the quinoline ring enhances its inhibitory activity against VEGFR-2 while reducing the inhibitory effect on other kinases [1]

C24H18F3N3O4

469.41

469.124

C, 61.41; H, 3.87; F, 12.14; N, 8.95; O, 13.63

228559-41-9

11317348

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

497.1±45.0 °C at 760 mmHg

239℃

254.4±28.7 °C

0.0±1.3 mmHg at 25°C

1.657

5.91

81.71

2

8

6

34

677

0

FC1C([H])=C(C([H])=C([H])C=1N([H])C(N([H])C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1F)F)=O)OC1C([H])=C([H])N=C2C([H])=C(C(=C([H])C2=1)OC([H])([H])[H])OC([H])([H])[H]

LFKQSJNCVRGFCC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H18F3N3O4/c1-32-22-11-15-20(12-23(22)33-2)28-8-7-21(15)34-14-4-6-19(17(27)10-14)30-24(31)29-18-5-3-13(25)9-16(18)26/h3-12H,1-2H3,(H2,29,30,31)

1-(2,4-difluorophenyl)-3-[4-(6,7-dimethoxyquinolin-4-yl)oxy-2-fluorophenyl]urea

2934.99.03.00

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.33 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.33 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.33 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 4% DMSO+corn oil: 2.5mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。