KU-0060648

PI3Kα (IC50 = 4 nM); PI3Kβ (IC50 = 0.5 nM); PI3Kγ (IC50 = 0.594 μM);PI3Kδ (IC50 = 0.1 nM); DNA-PK (IC50 = 8.6 nM)
KU-0060648 exhibits differential effects on growth inhibition, but is not profoundly cytotoxic in a panel of human cancer cell lines. When compared to SW620 cells, MCF7 cells exhibit more potent inhibition of DNA-PK and PI-3K. In MCF7 cells, exposure to 1 mM KU-0060648 for five days significantly reduces cell proliferation by more than 95%, but only by 55% in SW620 cells. In clonogenic survival assays, KU-0060648 increases etoposide and doxorubicin's cytotoxicity across a panel of DNA-PKcs-proficient cells, but not in DNA-PKcs-deficient cells, demonstrating that the increased cytotoxicity of the topoisomerase II poisons is caused by DNA-PK inhibition. [1]

KU-0060648 对生长抑制表现出不同的作用，但在一组人类癌细胞系中没有明显的细胞毒性。与 SW620 细胞相比，MCF7 细胞表现出更有效的 DNA-PK 和 PI-3K 抑制作用。在 MCF7 细胞中，暴露于 1 mM KU-0060648 5 天，细胞增殖显着降低 95% 以上，但在 SW620 细胞中仅降低 55%。在克隆生存测定中，KU-0060648 在一组 DNA-PKcs 熟练的细胞中增加依托泊苷和阿霉素的细胞毒性，但在 DNA-PKcs 缺陷的细胞中则不然，这表明拓扑异构酶 II 毒物的细胞毒性增加是由 DNA-PK 引起的抑制。 [1]

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KU-0060648 浓度依赖性地抑制细胞中DNA-PK在Ser2056位点的自磷酸化，在MCF7乳腺癌细胞中的IC₅₀为0.02 µM，在SW620结肠癌细胞中的IC₅₀为0.2 µM。[1]
它也抑制PI-3K介导的AKT在Ser473位点的磷酸化，在MCF7细胞中的IC₅₀为0.04 µM。然而，其在SW620细胞中对PI-3K的抑制活性很弱 (IC₅₀ >10 µM)，表明其抑制具有细胞系依赖性。[1]
连续暴露5天可抑制一系列人乳腺癌（MCF7, T47D, MDA-MB-231）和结肠癌（LoVo, SW620）细胞系的增殖。生长抑制 (GI₅₀) 值范围从0.21 µM (LoVo) 到1 µM (MDA-MB-231 和 SW620)。[1]
KU-0060648 (1 µM，暴露16小时) 单药细胞毒性较低（在大多数细胞系中存活率 >80%，MDA-MB-231除外，为41%）。[1]
它显著增强了拓扑异构酶II毒物依托泊苷和多柔比星的细胞毒性。在DNA-PKcs正常的细胞系 (V3-YAC, M059-Fus-1) 中，该化合物将依托泊苷的细胞毒性增强了4至13倍，将多柔比星的细胞毒性增强了高达32倍。而在DNA-PKcs缺陷的细胞系 (V3, M059J) 中，这种增强作用微乎其微，证实化学增敏作用主要归因于DNA-PK的抑制。[1]
在一组人类癌细胞系中，KU-0060648 (1 µM) 将依托泊苷的细胞毒性最高增强了105倍（在SW620细胞中），将多柔比星的细胞毒性最高增强了107倍（在MCF7细胞中）。[1]

KU-0060648 可增加 MCF7 和 SW620 异种移植模型中依托泊苷的抗肿瘤活性，并且在 MCF7 异种移植模型中具有单药活性。 [1]

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在体内，腹腔注射KU-0060648显著抑制了裸鼠体内HepG2异种移植物的生长。AKT-mTOR活化在异种移植肿瘤中也受到抑制。最后，我们发现DNA-PKcs在人HCC组织中的表达显著上调。[2]

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在携带MCF7乳腺癌异种移植瘤的小鼠中，单用KU-0060648治疗 (10 mg/kg 腹腔注射，每日两次，持续14天) 导致中位肿瘤生长延迟30天。在SW620结肠癌异种移植瘤中未观察到显著的单一药物活性。[1]
KU-0060648 与依托泊苷磷酸酯联用显著增强了抗肿瘤活性。在MCF7移植瘤中，联合用药导致中位生长延迟55天，而单独使用依托泊苷为38天，单独使用KU-0060648为30天。[1]
在SW620移植瘤中，当KU-0060648与依托泊苷联用时，特别是在抑制剂每日给药两次的情况下，观察到活性增强的趋势。[1]

KU-0060648抗DNA-PK和PI-3K细胞活性的测定[1]
在X射线照射（10 Gy）前，在暴露于不同浓度KU-0060648 1小时的细胞中测定DNA-PK自磷酸化。30分钟后，根据制造商的说明，使用磷安全提取试剂制备细胞裂解物。通过蛋白质印迹法测定Ser2056处DNA-PKcs相对于未磷酸化DNA-PKcs的自磷酸化水平。为了测定PI-3K活性，在用50ng/ml胰岛素样生长因子-1处理30分钟之前，将细胞暴露于不同浓度的KU-0060648中1小时。通过蛋白质印迹法测定PI-3K依赖性AKT磷酸化（Ser473）相对于非磷酸化AKT的水平。

细胞毒性和生长抑制研究[1]
通过克隆试验测量细胞毒性。在6孔板中生长的细胞在收获和接种到直径10cm的无药物培养基中的皮氏培养皿之前，暴露于含有或不含KU-0060648（1μM）的依托泊苷或阿霉素16小时。10至14天后，用结晶紫对菌落进行染色，并用自动菌落计数器计数。如前所述，通过SRB测定法测定连续暴露于KU-0060648 5天后的细胞生长抑制。GI50是导致50%细胞生长抑制的浓度。

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DNA-PK和PI-3K细胞活性测定： 细胞用一系列浓度的KU-0060648处理1小时。对于DNA-PK抑制评估，随后用X射线照射细胞（10 Gy），30分钟后裂解。对于PI-3K抑制评估，在1小时预孵育后，用胰岛素样生长因子-1 (50 ng/ml) 处理细胞30分钟。制备细胞裂解液，使用特异性抗体通过蛋白质印迹法测定磷酸化DNA-PKcs (Ser2056) 或磷酸化AKT (Ser473) 相对于总蛋白的水平。进行光密度分析以计算抑制百分比和IC₅₀值。[1]
克隆形成存活实验： 为了评估细胞毒性和化学增敏作用，将培养板中的细胞暴露于依托泊苷或多柔比星，同时使用或不使用KU-0060648 (1 µM)，持续16小时。然后收集细胞，在无药培养基中接种到培养皿中，并使其形成克隆10-14天。对克隆进行染色和计数。[1]
生长抑制 (SRB) 实验： 细胞连续暴露于KU-0060648 5天。然后使用磺酰罗丹明B (SRB) 比色法测量细胞密度以确定生长抑制 (GI₅₀)。[1]

人源肿瘤SW620或MCF7异种移植模型
10 mg/kg，每日两次
i.p.

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KU-0060648不同给药途径后的血浆药代动力学[1]
所有体内实验均经相关机构动物福利委员会审查批准，并按照国家法律进行。我们测定了雌性Balb C小鼠分别以10 mg/kg剂量静脉注射(iv)、腹腔注射(ip)或口服(po)给药后KU-0060648的血浆药代动力学。 KU-0060648 配制于等摩尔磷酸溶剂中，用无菌生理盐水定容至最终 pH 值为 5。小鼠在注射 KU-0060648 后，每隔一段时间处死一次，最长达 360 分钟，并按照先前描述的方法，通过 LC-MS/MS 分析测定血浆中 KU-0060648 的浓度。KU-0060648 在肿瘤异种移植模型中的分布[1]
雌性无胸腺小鼠在特定病原体清除 (SPF) 条件下饲养和处理，用于组织分布和疗效研究。将 KU-0060648 (12.5 mg/kg，静脉注射) 注射到携带 MCF7 或 SW620 肿瘤（650 mm³）的小鼠体内，分别在 60 分钟或 240 分钟后处死小鼠。将肿瘤切除后，置于冰上，用搅拌式均质器在PBS（1:3 w/v）中以10秒为单位进行均质。采用LC-MS/MS分析测定血浆和肿瘤中KU-0060648的浓度，方法如前所述。

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DNA-PK离体药效学试验[1]
将KU-0060648（2.5或25 mg/kg）或载体单独静脉注射给携带SW620肿瘤的小鼠。1小时或4小时后，处死动物，切除肿瘤并进行均质处理。通过 ELISA 检测测定 p53 肽底物 (Ser15) 的 DNA-PK 依赖性磷酸化，确定肿瘤匀浆中的 DNA-PK 活性，如前所述。

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抗肿瘤疗效研究[1]
当肿瘤可触及时（植入后 8-10 天，约 5 mm × 5 mm），对携带 SW620 或 MCF7 异种移植瘤的小鼠（每组 n = 5）进行治疗。动物每天接受一次生理盐水腹腔注射（对照组），单药 KU-0060648 10 mg/kg 腹腔注射，每天两次，SW620 荷瘤小鼠连续 5 天（2 × d × 5），MCF7 荷瘤小鼠连续 14 天（2 × d × 14），每天两次给药间隔 8 小时，或每天一次腹腔注射依托泊苷磷酸盐（11.35 mg/kg 生理盐水，相当于 10 mg/kg 游离依托泊苷，腹腔注射，d × 5）。对于联合用药，KU-0060648 每日腹腔注射一次或两次，持续 5 天（SW620 细胞）或每日一次，持续 14 天（MCF7 细胞），首次给药紧接依托泊苷磷酸酯给药之前。

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体内抗肿瘤疗效测定[2]
将大量 HepG2 细胞（500 万个/只小鼠）皮下注射到 6-8 周龄雌性裸鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，将小鼠随机分为三组，每组 12 只：载体对照组（生理盐水）、KU-0060648 10 mg/kg 组（每日腹腔注射，持续 21 天）和 KU-0060648 50 mg/kg 组（每日腹腔注射，持续 21 天）。当肿瘤形成（体积约 100 mm³）时开始注射。每周记录肿瘤体积，并使用既定公式计算：体积 (mm³) = (d² × D)/2，其中 d 和 D 分别为肿瘤的最短直径和最长直径。首次给予 KU-0060648 两周后，分离每组两只小鼠的异种移植瘤，并进行蛋白质印迹和免疫组织化学 (IHC) 染色分析。采用人道终点以最大程度减少动物痛苦。首次给予 KU-0060648 五周后，通过手术分离 HepG2 异种移植瘤并称重。药代动力学研究：KU-0060648 配制于等摩尔磷酸溶剂中，并用无菌生理盐水调节 pH 至 5。雌性 Balb C 小鼠通过静脉注射 (iv)、腹腔注射 (ip) 或口服 (po) 途径单次给予 10 mg/kg 的 KU-0060648。在长达 360 分钟的不同时间点采集血液样本，用于血浆浓度分析。[1]
肿瘤分布研究：将携带 MCF7 或 SW620 皮下异种移植瘤（约 650 mm³）的雌性无胸腺小鼠单次静脉注射 KU-0060648（12.5 mg/kg）。分别于给药后 60 分钟或 240 分钟处死小鼠。切除肿瘤，在 PBS 中匀浆，并与血浆一起分析药物浓度。[1]
体外 DNA-PK 活性测定：将携带 SW620 肿瘤的小鼠单次静脉注射 KU-0060648（2.5 或 25 mg/kg）或载体。分别于给药后 1 小时或 4 小时处死小鼠。切除肿瘤并匀浆。采用基于 ELISA 的检测方法，通过测定 DNA-PK 依赖的 p53 肽底物 (Ser15) 的磷酸化水平来确定匀浆中的 DNA-PK 活性。[1]
异种移植瘤疗效研究：将已建立的 SW620 或 MCF7 皮下异种移植瘤小鼠在肿瘤长至约 5×5 mm 时进行治疗。
SW620 模型：动物分别接受赋形剂（对照组）、单独使用 KU-0060648（10 mg/kg，腹腔注射，每日一次或两次，持续 5 天）、单独使用依托泊苷磷酸酯（11.35 mg/kg，腹腔注射，每日一次，持续 5 天）或联合治疗。
MCF7 模型：动物分别接受赋形剂、单独使用 KU-0060648（10 mg/kg，腹腔注射，每日两次，持续 14 天）、单独使用依托泊苷磷酸酯（11.35 mg/kg，腹腔注射，每日一次，持续 5 天）或联合治疗。 （以mg/kg剂量腹腔注射，每日一次，连续5天），或联合用药，其中KU-0060648的首剂应在依托泊苷给药前立即给予。[1]

表2列出了通过不同途径向Balb/C小鼠给予10 mg/kg KU-0060648后测定的血浆药代动力学参数。口服给药后KU-0060648的生物利用度≥100%。腹腔注射给药后KU-0060648的药代动力学参数与静脉注射给药相似，生物利用度为78%。[1]

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静脉注射给药后KU-0060648在MCF7和SW620荷瘤小鼠体内的组织分布[1]
向携带MCF7或SW620异种移植瘤的小鼠静脉注射KU-0060648（12.5 mg/kg）后，KU-0060648广泛分布于肿瘤组织，并在血浆清除后仍保留在肿瘤组织中（表2）。 KU-0060648 在肿瘤中的浓度维持在 1 μM 以上（该浓度在体外可产生化疗增敏作用），且至少持续 4 小时。小鼠单次静脉注射 10 mg/kg 剂量后，KU-0060648 的血浆峰浓度 (Cmax) 为 19 µg/ml（5 分钟），消除半衰期 (T₁/₂) 为 102 分钟，清除率 (CL) 为 41 ml/kg/min。[1] 口服给药 (10 mg/kg po) 的生物利用度接近 100% (119%)，Tmax 为 120 分钟，T₁/₂ 为 142 分钟。[1] 腹腔注射给药 (10 mg/kg ip) 的生物利用度为 78%，Tmax 为 30 分钟。半衰期为 106 分钟。[1]
在荷瘤小鼠中静脉注射 12.5 mg/kg 剂量后，KU-0060648 广泛分布于 MCF7 和 SW620 异种移植瘤中。血浆清除后，肿瘤浓度至少维持在 1 µM 以上（体外化疗增敏的有效浓度）。[1]

在MCF7异种移植疗效研究中，KU-0060648单药治疗的毒性可忽略不计（最大体重下降3%）。与依托泊苷磷酸酯联合用药时，最大体重下降7%，该结果被认为是可接受的。[1]
在SW620异种移植研究中，KU-0060648单药治疗或依托泊苷磷酸酯单药治疗均未引起显著的体重下降。二者联合用药时，最大体重下降11%。[1]

[1]. Chemosensitization of cancer cells by KU-0060648, a dual inhibitor of DNA-PK and PI-3K. Mol Cancer Ther. 2012 Aug;11(8):1789-98.

[2]. KU-0060648 inhibits hepatocellular carcinoma cells through DNA-PKcs-dependent and DNA-PKcs-independent mechanisms. Oncotarget. 2016 Mar 29;7(13):17047-59.

2-(4-乙基-1-哌嗪基)-N-[4-[2-(4-吗啉基)-4-氧代-1-苯并吡喃-8-基]-1-二苯并噻吩基]乙酰胺是二苯并噻吩类化合物。

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KU-0060648 是一种双重 ATP 竞争性 DNA-PK 和 PI-3K 抑制剂，由 LY294002 药效团开发而来。它对其他PIKK家族成员（如ATM、ATR和mTOR）具有选择性。[1]
它对拓扑异构酶II抑制剂（依托泊苷、阿霉素）的化疗增敏作用主要归因于DNA-PK的抑制，从而削弱了DNA双链断裂的非同源末端连接（NHEJ）修复途径。[1]
在MCF7异种移植瘤（携带PIK3CA突变）中观察到了单药抗肿瘤活性，但在SW620异种移植瘤中未观察到，这表明PI-3K通路激活的肿瘤可能对其敏感。[1]
该研究为DNA-PK和PI-3K双重抑制的治疗策略提供了原理验证。[1]

C33H34N4O4S

582.7125

582.23

C, 68.02; H, 5.88; N, 9.61; O, 10.98; S, 5.50

881375-00-4

881375-00-4

11964036

Off-white to brown solid powder

1.3±0.1 g/cm3

819.9±65.0 °C at 760 mmHg

449.7±34.3 °C

0.0±3.0 mmHg at 25°C

1.694

5.56

106.5

1

8

6

42

1010

0

O=C1C2C=CC=C(C=2OC(N2CCOCC2)=C1)C1C2SC3C(C=2C(NC(CN2CCN(CC)CC2)=O)=CC=1)=CC=CC=3

AATCBLYHOUOCTO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C33H34N4O4S/c1-2-35-12-14-36(15-13-35)21-29(39)34-26-11-10-23(33-31(26)25-6-3-4-9-28(25)42-33)22-7-5-8-24-27(38)20-30(41-32(22)24)37-16-18-40-19-17-37/h3-11,20H,2,12-19,21H2,1H3,(H,34,39)

2-(4-ethylpiperazin-1-yl)-N-[4-(2-morpholin-4-yl-4-oxochromen-8-yl)dibenzothiophen-1-yl]acetamide

KU0060648; KU 0060648; LM6DZS6PYA; 2-(4-ethylpiperazin-1-yl)-N-[4-(2-morpholin-4-yl-4-oxochromen-8-yl)dibenzothiophen-1-yl]acetamide; CHEMBL1086377; 2-(4-ethylpiperazin-1-yl)-N-(4-(2-morpholino-4-oxo-4H-chromen-8-yl)dibenzo[b,d]thiophen-1-yl)acetamide; KU-0060648

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 2~2.8 mg/mL (3.4~4.8 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.28 mg/mL (0.48 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 2.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 0.28 mg/mL (0.48 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 2.8mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 0.28 mg/mL (0.48 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 2.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 30% propylene glycol, 5% Tween 80, 65% D5W: 20 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。