Methionine analogue.

为了促进拟南芥植物或细胞培养物中合成的少量蛋白质样品的点击化学富集以供分析，高炔丙基甘氨酸可实现生物正交非规范氨基酸标记 (BONCAT)[1]。

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Met、AHA、HPG和15N标记对植物细胞生长的影响[1]
为了开始对植物细胞培养中的BONCAT标记进行系统比较，我们研究了AHA、HPG和15N对细胞培养生长的影响。通过靶向LC-MS测定，Met和ncAA被有效地吸收到拟南芥细胞中（表1）。记录的ncAA细胞含量与AHA处理细胞的细胞生长速率损失相关，但对15N处理细胞的生长速率没有影响；在HPG处理的细胞中也观察到生长速率下降不太严重（图1d）。细胞死亡评估表明，在拟南芥细胞培养中，HPG引起的细胞死亡比AHA少（图1b）。

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AHA和HPG刺激Met和相关代谢物的体内合成[1]
为了揭示AHA或HPG引起的细胞培养生长抑制的可能原因，我们测定了用AHA、HPG或Met处理24小时后拟南芥细胞培养物中Met和四种相关代谢物水平的变化（图2）。24小时后，S-腺苷高半胱氨酸、同型半胱氨酸或SAM的水平没有显著差异（P>0.05），但用Met和AHA处理的细胞中5-甲基硫代腺苷的水平显著升高（P<0.05），用HPG处理的细胞在较小程度上也显著升高。24小时后Met平均水平的差异似乎不同，但较大的标准差使这种差异在统计学上不显著。然而，观察到的Met代谢紊乱可能是我们在用AHA处理的细胞培养物中观察到的对细胞生长的影响的原因，而在用HPG处理的细胞培育物中则观察到的影响较小。治疗24小时后，AHA的ncAA与内源性Met的比率为1.6，HPG为4.8（表1和图2）。

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HPG比AHA更有效地掺入替代Met的蛋白质中[1]
在确定HPG对拟南芥细胞培养物中AHA的代谢破坏较小后，我们使用LC-MS/MS确定了暴露24小时后标记有AHA或HPG的蛋白质数量。我们使用数据依赖性采集蛋白质组分析（表S4和S5）在AHA和HPG处理的细胞中鉴定出相似的蛋白质组总数（分别为3177和3146个蛋白质组）。然而，在用AHA治疗的情况下，没有一种蛋白质显示出任何肽MS证据，表明AHA在已鉴定肽的氨基酸序列中取代了Met。相比之下，在用HPG处理的细胞中鉴定的100个蛋白质组（3.2%）显示，MS证据表明HPG在与其氨基酸序列匹配的肽中取代了Met（表2，图3）。因此，很明显，HPG是标记新生蛋白质样本的一种更有效的非编码氨基酸，这不仅是因为它造成的代谢破坏和细胞死亡更少，而且因为即使在通过数据依赖性采集分析的整个蛋白质组提取物中，也可以验证蛋白质的标记。来自AHA和HPG处理细胞的蛋白质组学数据集与主成分分析（PCA）是不可分割的，但这两个数据集与未处理细胞的蛋白组学数据集中略有不同，表明单独的AHA和HP-G处理对植物细胞蛋白质组组成有一定的影响（图4a）。

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从植物细胞中富集AHA和HPG标记的蛋白质[1]
当之前报道了来自植物的AHA标记蛋白质时（Glenn等人，2017；Yu等人，2020），使用胰蛋白酶将蛋白质从富集树脂上切割下来，这可能会导致ncAA标签留在树脂上，从而不会出现在肽MS数据中。然而，由于缺乏AHA标记蛋白质的直接证据，也有可能来自AHA处理植物的蛋白质可能通过与富集介质的替代植物特异性和/或尚未确定的化学相互作用而富集，而不是通过叠氮化物-炔烃环加成。

为了验证我们实验中点击化学产物富集的特异性，我们富集了用HPG和AHA处理的细胞培养物中的完整蛋白质（表2，表S4和S5）。AHA富集使用炔烃官能化树脂，而HPG富集使用叠氮化物官能化树脂。PCA表明，HPG富集过程产生的蛋白质组的组成和基于强度的绝对定量（iBAQ）丰度不同于从细胞培养物中提取的总蛋白质样本（图4b）。相比之下，来自AHA处理的细胞培养物的富集和批量数据集与PCA是不可分割的（图4c）。有趣的是，PCA还表明，富含HPG和AHA的数据集彼此不同（图4d）。以前，已经表明，使用这种色谱方法富集未经处理的蛋白质是可以忽略不计的，因为它是在非常严格的条件下进行的，使用高尿素浓度进行洗涤和大稀释体积，这将防止任何显著的非共价结合被保留（Zhang等人，2014）。

为了确定富集是否对带有HPG和AHA标签的蛋白质具有选择性，我们使用MS在来自ncAA处理细胞的大量蛋白质的肽中寻找Met到HPG和Met到AHA的置换，并将其与富集后在蛋白质样本中检测到的蛋白质的肽进行比较。表2总结了这些实验的结果。

对于用HPG处理的细胞培养物，在富含树脂的蛋白质样品中发现了555个蛋白质组，其中461个也在全组织提取物中发现；因此，在全组织提取物中鉴定的3146个蛋白质组中，约15%也在富集数据集中鉴定出来。在555个富集蛋白组中，74个在批量数据集中显示出HPG标记的证据（表1，表S6）。我们还计算了相对富集值（[riBAQ富集-riBAQ总量]/[riBAQ+riBAQ总量]）；值>0表示富集物中的蛋白质相对丰度高于总提取物。在555个富集蛋白组中，240个（43%）的富集值＞0，其中39个在批量数据集中显示出HPG标记的证据（表1，表S6）。应该指出的是，并非所有蛋白质都会产生具有ncAA的肽，这种肽也可以通过LC-MS/MS检测到，因此人们会认为，在富集过程中，无法通过实验检测到标签的蛋白质的丰度会增加。富集值小于0的蛋白质可能是由于HPG标签的化学计量比低或未标记蛋白质的结合较弱。555个蛋白质组中只有7个在树脂富集的蛋白质样品中显示出HPG标记的实验证据，但这可以用胰蛋白酶从富集树脂中切割蛋白质来解释，留下许多HPG标记肽仍附着在树脂上。

相比之下，对于用AHA处理的细胞培养物，在富含树脂的蛋白质样品中只发现了131个蛋白质组。其中，78个蛋白质组（60%）的富集值＞0，尽管在散装或树脂富集的数据集中没有证据表明这些蛋白质的肽被AHA标记。比较两种处理的富集数据集中蛋白质组的绝对数量可能表明，AHA比HPG更有选择性地掺入新生蛋白质。然而，比较两种处理之间富集值大于0的富集蛋白的百分比表明，AHA在其标记的蛋白质中的掺入程度可能比HPG更大。尽管该方法效率低下，但在使用肼从树脂中切割蛋白质的实验中也观察到了上述趋势，在树脂上消化后仍结合的肽使用肼从聚合物中切割出来，然后单独分析（表2）。

综上所述，这些结果表明，点击化学富集过程有些不透明，通过叠氮化物-炔烃环加成以外的相互作用与ncAA结合的蛋白质可能对鉴定的蛋白质组有贡献。因此，我们警告不要认为在点击化学富集的蛋白质样本中存在给定的蛋白质就足以得出该蛋白质已被ncAA标记的结论。相反，富集应通过富集前后肽中ncAA掺入的MS证据来确认，以验证新生蛋白质组的成员。此外，我们的HPG处理实验的数据表明，并非所有标记的蛋白质都能有效地与树脂结合（我们的数据显示，来自HPG处理细胞的100个Met至HPG标记的蛋白质中有26个在炔烃树脂富集数据集中未被识别），因此富集过程中似乎存在一些未识别的偏差，导致一些真正的标记蛋白质丢失。

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AHA和HPG标记了一些与15N相同的蛋白质[1]
为了验证ncAA标记的样本蛋白质群体代表整个新生蛋白质库的程度，我们将其与通过在24小时内将15N盐掺入蛋白质中标记的蛋白质进行了比较。在发现的100个标记有HPG的蛋白质组中，在细胞培养物中24小时内显著标记有15N的366个蛋白质组中也发现了62个（图3）。为了根据新生蛋白质的丰度对15N标记的蛋白质进行排序，我们将15N标记蛋白质部分乘以未经处理的细胞培养数据集中每种蛋白质的丰度。这种丰度是使用iBAQ估算的。当我们从新合成的蛋白质最多到最少对蛋白质组列表进行排序时，我们发现该列表中排名前40的蛋白质组中有34个也被验证为HPG标记的（15）和/或从HPG处理的样品中富集的树脂（32）（图5，表S6）。虽然前40个蛋白质组中有27个也是从AHA处理的样品中富集的树脂，但没有一个被证实是AHA标记的（图5，表S6）。

与15N标记的比较为研究ncAA富集过程对新生蛋白质的选择性提供了多种途径。用15N标记的蛋白质组与用AHA或HPG处理的细胞富含树脂的样品中检测到的蛋白质组之间存在很大重叠。在366个标记有15N的蛋白质组中，其中90个和219个也分别富集在用AHA或HPG处理的细胞样本中（图4e；分别富集后，用15N标记的蛋白质组的25%和60%也存在于用AHA和HPG处理的细胞培养物样本中）。然而，所有三个列表中只有69个蛋白质组是共享的（图4e）；21个富集组仅在15N和AHA富集数据集之间共享，150个富集组仅供15N和HPG富集数据集共享。当仅考虑富集值大于0的蛋白质组时，这些重叠显著减少（图4f）。

富集与MET百分比呈弱相关，但与蛋白质长度、每种蛋白质的标签数量、标签的相对位置或新合成蛋白质的丰度无关 由于AHA或HPG在Met残基的位置标记蛋白质，因此澄清富集是否受到蛋白质百分比Met、长度、标签数量或标签在氨基酸序列中的相对位置的显著影响非常重要。我们寻找这些属性中的每一个与富集值之间的相关性（见图S1-S6）。唯一明显的相关性是蛋白质中Met的百分比与其相对富集度之间的弱相关性（图S1和S2）；与用AHA处理的细胞相比，用HPG处理的细胞的这种相关性更强。可以预期，显示最高富集度的蛋白质将是基于15N标记的新合成物质丰度最高的蛋白质；然而，我们发现使用ncAA标签进行富集没有这种相关性（图S7和S8）。

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基因本体术语富集分析揭示了15N和ncAAs标记和富集的蛋白质类型[1]
使用AgriGO（Du等人，2010；Tian等人，2017），我们观察到标签和ncAA富集集中存在一定程度的基因本体论（GO）术语富集。HPG和15N都有利于标记刺激反应蛋白，但对于HPG来说，它们主要是热反应蛋白，而对于15N来说，它们则主要是镉反应蛋白（图S9和S10）。在点击化学富集方面，从AHA处理的细胞中富集的蛋白质树脂是参与碳水化合物代谢和应激/刺激反应蛋白的蛋白质（图S11），而在从HPG处理的细胞富集的树脂样品中，应激和热反应蛋白的表达率过高（图S12）。
综上所述，这些数据表明，胁迫/刺激反应蛋白在拟南芥细胞培养物中快速合成。这可能不是用ncAA治疗的结果，因为15N标记的数据集中压力/刺激反应蛋白也过多，而且没有先例认为15N会导致这些类型蛋白质的合成上调。

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开放式大规模搜索未发现AHA处理细胞中肽的修饰[1]
我们的数据中缺乏可观察到的AHA标签的一个可能原因是，将AHA掺入植物蛋白质会导致意想不到的质量变化[例如，通过AHA部分的翻译后修饰（PTM）]。为了研究这种可能性，我们对AHA处理和未处理细胞的数据进行了开放式大规模搜索。我们使用来自富集数据集和HPG标记数据集的拟南芥基因组计划基因座代码对数据进行过滤，然后使用过滤后的数据构建肽质量修饰的频率直方图，以寻找AHA掺入后新的δ质量变化的证据，而不依赖于AHA的紧密前体质量过滤器。然而，与AHA治疗细胞相关的新质量变化的δ质量变化直方图的比较没有明确的证据（表S7）。

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开发一组高置信度的富集、新合成的蛋白质[1]
根据我们的综合数据，我们生成了248种新生蛋白质的高置信度列表（表3；表S8），其中包括在用AHA和/或HPG处理后通过点击化学富集的蛋白质，以及（i）在富集前被发现被HPG标记的蛋白质，和/或（ii）已知在同一时间段内被15N独立标记的蛋白质。以mapman功能分类为指导（Schwacke等人，2019），这些蛋白质被分为八个超群。大约四分之一的样本群体与蛋白质生物合成有关。参与核苷酸代谢和加工、细胞组织、营养吸收、光合作用、氧化还原稳态、次生代谢、溶质运输和囊泡运输的蛋白质以及酶和辅酶也在这份清单中。对于所检查的每个超群蛋白质，HPG富集群体比AHA富集群体包含更多的蛋白质。

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新生蛋白质的PTM谱与总蛋白质集不同[1]
能够树脂富集一部分新生蛋白质，使我们能够对新生蛋白质提取物和总蛋白质提取物之间的差异进行一些重要观察。我们分析了10种常见PTM的数据（见实验程序），发现分别用AHA或HPG处理的细胞培养物总蛋白提取物中55%和51%的蛋白质肽含有一种或多种PTM（图6）。与此形成鲜明对比的是，分别来自AHA或HPG处理细胞的富含树脂的新生蛋白质数据集中，只有9%或10%的蛋白质的肽含有PTM（图6）。在使用AHA在新生和总数据集中发现的214种蛋白质中，只有三种（1%）含有肽，富集数据集中的PTM比批量数据集中的多。相应地，在使用HPG在新生和总数据集中发现的593种蛋白质中，只有9种（2%）在富集数据集中的PTM含量高于批量数据集（表S9）。当考虑单个蛋白质时，在所有情况下，对于AHA处理细胞的数据集[25个蛋白质ID；P<0.05（n=3）；表S9]，与富集的对应物相比，批量数据集中每种蛋白质含PTM肽的光谱命中率更高，对于HPG处理细胞的数据集，除三种情况外，其余所有情况下都有光谱命中率[64个蛋白质ID，共；P<0.05（n=3）；表S9]。考虑到更大的HPG处理数据集，与新生数据集相比，批量数据集中修饰得更多的蛋白质通常是与初级代谢或蛋白质生物合成、稳态和修饰相关的蛋白质。随着年龄的增长，这些途径中蛋白质的高度修饰可能表明它们比体内其他蛋白质暴露在更长时间或更恶劣的（生物）化学环境中。
我们进一步分析了数据，以观察AHA和HPG处理细胞的新生和大量蛋白质中10种修饰的相对发生频率是否存在差异（图6，表S9）。这表明，蛋白质提取物中PTMs的频率较高，主要是由于Glu甲基化、Met氧化和Thr/Tyr磷酸化的频率较高。
考虑到AHA数据集，除了氧化（批量数据集中频率较高）和N-末端乙酰化（新生数据集中频率较高）的微小差异外，新生和批量蛋白质在PTM频率方面似乎相似（图6b）。初步分析显示，在AHA处理的细胞培养物中，新生蛋白质中Arg甲基化的比例频率很高（图6），但是，在该数据集中发现的129个Arg甲基肽谱中，除了两个外，其余都被映射到热休克蛋白（HSP）70伴侣（AT3G09440.1），这表明这不是大量蛋白质组和新生蛋白质组之间的一般差异，而是特定蛋白质富集优势PTM的情况。
相比之下，与匹配的本体蛋白组相比，来自HPG处理的细胞培养物的新生蛋白含有更低的MET氧化频率和更高的N-末端乙酰化频率（图6c）。在48种富含HPG的蛋白质中发现了N-末端乙酰化。与含PTM的肽相比，光谱计数较低的一组新生蛋白质包括参与核糖体、呼吸代谢和分子伴侣的主要蛋白质（表S9）。

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一个配体用于 E3 泛素连接酶，另一个配体用于靶蛋白；这两个配体通过接头连接形成 PROTAC。 PROTAC 利用细胞内泛素-蛋白酶体系统特异性破坏靶蛋白[2]。

确定在给定时间点哪些蛋白质是主动合成的，并提取代表性样品进行分析，对于了解植物的反应非常重要。在这里，我们表明蛋氨酸（Met）类似物Homopropargylglycine（HPG）能够对拟南芥植物或细胞培养物中合成的蛋白质的小样本进行生物正交非规范氨基酸标记（BONCAT），从而促进其点击化学富集以供分析。HPG掺入位点可以通过肽质谱法在整个蛋白质氨基酸序列的Met位点进行确认，并与15N蛋白质标记的独立研究进行相关性验证。我们提供的证据表明，在拟南芥中，基于HPG的BONCAT标记的新生植物蛋白样本比基于叠氮单丙氨酸（AHA）的BONCAT更好，并表明AHA对Met代谢的诱导和对细胞生长速率的更大抑制可能限制了AHA在拟南芥Met位点的掺入。我们表明，基于HPG的BONCAT提供了一种可验证的采样方法，在给定的时间点合成哪些植物蛋白，并从散装蛋白库中富集一小部分新的蛋白分子，用于鉴定、定量和后续的生化分析。发现富集的新生多肽样品含有的常见翻译后修饰残基明显少于来自全植物提取物的相同蛋白质，为植物中翻译后修饰的年龄相关性积累提供了证据[1]。

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HPG/Homopropargylglycine在全植物蛋白质标记方面比AHA更有效[1]
之前有报道称，通过幼苗洪水用AHA处理的整个拟南芥植物显示，使用特异性抗体将AHA掺入蛋白质中，另外，使用肽MS鉴定了使用点击化学富集的蛋白质（Glenn等人，2017；Yu等人，2020）。虽然这些研究表明了BONCAT的普遍效用，但都没有提供MS/MS证据表明AHA残基取代了MS鉴定的标记蛋白中的Met残基。为了确定AHA处理植物中AHA标记的程度，我们使用相同的技术用AHA处理拟南芥植物。从用AHA处理的植物中分离的蛋白质在整个幼苗的总提取物中的3022个蛋白质组中只有一个（0.03%；鉴定出一个标记肽）具有MS确认的AHA标签（图1a，表S2）。作为独立比较，我们还使用相同的方法用替代的ncAA、HPG处理植物，相比之下，这些植物在2917个蛋白质组中的11个中显示了HPG标签（0.37%；鉴定出16种独特的标记肽；图1a，表S3）。因此，HPG似乎比AHA更有效地标记整株植物中新生蛋白质的样本群体，尽管我们手中的幼苗洪流似乎对研究整株植物的蛋白质合成用途有限。从上方观察绿叶面积的评估表明，用AHA淹没24小时后会抑制生长，但用HPG淹没则不会；这表明HPG可能是更适合整株植物的BONCAT试剂。然而，48小时后，AHA处理的平板和HPG处理的平板都显示出生长迟缓（图1c）。为了进一步研究AHA和HPG作为植物中新生蛋白质标记剂的潜在用途，我们因此转向了一系列使用拟南芥细胞培养的实验，其中淹水环境是细胞的控制状态。

点击AHA/HPG标记蛋白的化学富集[1]
对于需要富集叠氮化物（AHA）或炔烃（Homopropargylglycine/HPG）标记蛋白质的实验，使用点击化学工具点击蛋白质富集试剂盒，对方案进行最小修改。如上所述提取组织样品（1-2g）（除了沉淀和洗涤步骤体积增加了七倍），直至丙酮洗涤步骤完成。在此之后，将颗粒重新悬浮在3.2ml Lysis缓冲液中，并使用Amido Black测定法测定蛋白质浓度。点击反应按照方案所述进行，但反应混合物的制备如下：蛋白质溶液：2400µl（含1mg蛋白质），2×Cu催化剂溶液：3000µl，树脂：200µl，H2O:400µl。洗涤树脂结合的蛋白质后，将树脂各切成两半，其中一半用胰蛋白酶处理，另一半用水合肼（2%v/v溶液）处理，然后用磷酸盐缓冲盐水（供应商建议含有1%w/v SDS，尽管该方案不要求在该溶液中使用SDS）洗涤，以从树脂中切割结合的蛋白质。然后，用胰蛋白酶处理过的树脂也用水合肼（2%v/v溶液）处理，以切割消化后仍与树脂结合的肽。用肼从树脂上切割下来的蛋白质用冰冷的丙酮（≥10×溶液体积）沉淀。将所得蛋白质颗粒重新悬浮在消化缓冲液中（根据方案），并用胰蛋白酶消化。从树脂中切割的富集样品（包括作为完整蛋白质切割的样品和胰蛋白酶消化后切割的样品）没有进行分级，而是使用安装在C18阱上的J4-SDS柱通过高效液相色谱法去除残留的SDS和盐。使用硅胶C18 MacroSpin柱进一步纯化这些肽样品，以及通过消化树脂结合蛋白产生的肽。清洁的肽级分在减压下干燥，并储存在-80或-20°C下，直到可以进行分析。

植物生长条件[1]
将拟南芥（Col-0）种子撒在琼脂平板上（0.9%w/v琼脂，半浓度Murashige&Skoog盐，0.3%蔗糖），灭菌（70%v/v乙醇水溶液，0.05%v/v Triton X100端对端旋转5分钟，然后用100%乙醇冲洗）。将种子分层约2天，然后转移到22°C的连续光照下（约600µmol m-2 sec-1）。用AHA或Homopropargylglycine/HPG（1 mm，9.9 mm柠檬酸钾缓冲液（pH 5.6，含150 mm蔗糖、4.32 mg ml-1 Murashige&Skoog盐和0.0024%v/v Silwett L-77）处理3天大的幼苗2分钟（Glenn等人，2017）。倾析溶液，3小时后将植物收获到液氮中。

为了确定ncAA处理对拟南芥生长的长期影响，重复了上述处理程序，但允许植物在处理后（在相同条件下）继续生长72小时。每种治疗都有两个盘子。处理后立即拍摄植物，然后在24、48和72小时后再次拍摄。使用Corral等人（2017）描述的ImageJ中的“阈值颜色”插件对照片进行分析。为了控制每个板上发芽种子总数的差异，每张照片中的绿色像素总数被归一化如下：每个重复的初始绿色区域被平均，并通过将该平均值除以每个重复的原始绿色区域来生成一个因子。然后将每个测量值乘以该因子，以生成归一化的绿色区域。

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测量AHA、高炔丙基甘氨酸和15N对植物细胞生长的影响[1]
用1mm AHA或HPG处理在液体MSMO培养基（每份120ml）中生长的三天大的拟南芥细胞培养物（PBS-D），在26-28°C的黑暗中持续搅拌。通过将固体粉末直接添加到细胞培养物中以达到所需浓度来进行初始处理。通过加入足够的过滤器灭菌的AHA或Homopropargylglycine/HPG溶液（100 mm的H2O溶液）进行后续实验，使最终浓度达到1 mm。在暴露于AHA、HPG或15N约0、8和24小时后，通过真空过滤收集细胞培养物的样品（每个约占总培养体积的三分之一）。在液氮中快速冷冻之前，记录每个样品的新鲜重量。在这些时间点也获得了对照的新重量。在每种处理中使用三个重复，每个重复由一个单独的细胞培养瓶组成。每种处理也取一个重复的小样本（<1ml），用碘化丙啶和荧光素二乙酸酯进行存活率染色，然后进行显微镜分析。

[1]. In vivo homopropargylglycine incorporation enables sampling, isolation and characterization of nascent proteins from Arabidopsis thaliana. Plant J. 2021 Aug;107(4):1260-1276.

[2]. Small-molecule PROTACs: An emerging and promising approach for the development of targeted therapy drugs. EBioMedicine. 2018 Oct;36:553-562.

[3]. Protocol for visualizing newly synthesized proteins in primary mouse hepatocytes. STAR Protoc. 2021;2(3):100616. Published 2021 Jun 17.

据报道，在Cortinarius claricolor中发现了(2S)-2-氮基己-5-炔酸酯，并有相关数据。

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在此，我们跟进这些报道，以更好地了解AHA如何影响植物生长，阐明哪些蛋白质被AHA标记，并将AHA与替代的BONCAT试剂高丙炔基甘氨酸/HPG以及内源氨基酸库的15N标记进行比较，从而更全面地了解BONCAT在植物科学中对新生蛋白质进行取样的用途。我们得出结论，BONCAT 是植物新生蛋白质取样的有效工具，但 HPG 在标记和分离植物新生蛋白质方面比 AHA 更具优势，可用于植物蛋白质合成的一般取样，以及用于鉴定和/或分离标记蛋白质以进行独立研究。[1]

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BONCAT 是植物新生蛋白质取样进行进一步研究的宝贵工具，但它存在一些在其他生物体中未曾遇到的技术挑战，这些挑战可能与植物的 Met 合成有关。使用 HPG/高丙炔基甘氨酸 (HPG/Hoprognaggyglycine) 而非 AHA 似乎可以克服其中的一些挑战。然而，为了充分发挥这项技术的潜力，还需要进一步的技术进步，以便 BONCAT 能够以更高的效率应用于完整植物（图 1）。此外，由于点击化学方法在富集植物蛋白质方面的选择性仍存在疑问，目前需要来自非天然氨基酸残基分析或同位素标记的独立证据来证实相关结论。尽管如此，我们相信BONCAT技术的应用将有助于发现新生植物蛋白的新特征，例如翻译后修饰（PTM）的积累，从而研究蛋白质在体内衰老过程中的变化。[1] 确定特定时间点哪些蛋白质正在积极合成，并提取代表性样本进行分析，对于理解植物的响应至关重要。本文表明，甲硫氨酸（Met）类似物高丙炔基甘氨酸（HPG）能够对拟南芥植株或细胞培养物中少量正在合成的蛋白质进行生物正交非天然氨基酸标记（BONCAT），从而促进其点击化学富集以进行分析。通过肽质谱分析，可以确定HPG掺入蛋白质氨基酸序列中Met位点的位置，并且与使用¹⁵N标记蛋白质的独立研究结果相符，验证了上述数据。我们提供的证据表明，在拟南芥中，基于HPG的BONCAT标记法比基于叠氮高丙氨酸（AHA）的BONCAT标记法能更好地标记新生植物蛋白。我们还发现，AHA诱导Met代谢以及对细胞生长速率的抑制作用可能比HPG更显著，这限制了AHA在拟南芥Met位点的掺入。我们证明，基于HPG的BONCAT标记法提供了一种可验证的取样方法，用于确定特定时间点正在合成的植物蛋白，并从整体蛋白池中富集少量新生蛋白分子，以便进行鉴定、定量和后续的生化分析。我们发现，富集的新生多肽样品中常见的翻译后修饰残基显著少于来自全植物提取物的相同蛋白，这为植物中翻译后修饰的年龄相关性积累提供了证据。[1]

C6H9NO2

127.14116

127.063

C, 56.68; H, 7.14; N, 11.02; O, 25.17

98891-36-2

211054-02-3 (R-isomer);98891-36-2;942518-19-6 (HCl);

11344028

White to yellow solid powder

0.512

63.32

2

3

3

9

144

1

C#CCC[C@@H](C(=O)O)N

SCGJGNWMYSYORS-YFKPBYRVSA-N

InChI=1S/C6H9NO2/c1-2-3-4-5(7)6(8)9/h1,5H,3-4,7H2,(H,8,9)/t5-/m0/s1

(2S)-2-aminohex-5-ynoic acid

L-homopropargylglycine; 98891-36-2; (2S)-2-AMINOHEX-5-YNOIC ACID; L- Homopropargylglycine (HPG) HCl salt; (S)-2-Aminohex-5-ynoic acid; 5-Hexynoic acid, 2-amino-, (2S)-; L-Homopropargylglycine (HPG); (S)-2-Amino-5-hexynoic acid;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~1966.34 mM)
H2O : ~83.33 mg/mL (~655.42 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (16.36 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (16.36 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (16.36 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。