Lapachol   中文名称: 拉帕醇

DHODH

接下来，为了解决LAP/Lapachol是否抑制DHODH活性的问题，我们通过测量DCIP的减少进行了无细胞DHODH活动测定。LAP钠盐显著抑制了hDHODH活性，IC50值为0.13μM（图1c），表明LAP是hDHODH活性的强效抑制剂。[1]

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LAP/Lapachol通过抑制嘧啶生物合成抑制淋巴细胞增殖[1]
接下来，我们评估了LAP的抗增殖作用。为此，用染料Efluor 670标记新分离的小鼠CD4 T细胞，并在LAP或LEF（10、30和100μM）存在下用抗CD3/CD28刺激4天。如图2a所示，LAP或LEF以剂量依赖的方式抑制小鼠CD4 T细胞的增殖。我们还研究了LAP对从健康供体外周血中分离的人CD4 T细胞的影响。与在小鼠细胞中观察到的类似，我们还发现，在LAP或LEF存在的情况下，人类T细胞增殖受到剂量依赖性抑制（图2b）。然而，我们发现，与同等浓度的LEF相比，LAP表现出更强的抑制人类和小鼠CD4 T细胞增殖的能力（图2a和b）。此外，我们对用LAP或LEF处理的人CD4 T细胞进行了膜联蛋白-V/碘化丙啶（PI）染色，以评估凋亡细胞死亡。虽然LEF在所有浓度下均未显示毒性作用，但流式细胞术分析显示，只有最高浓度的LAP（100μM）有毒（附加文件5：表S3）。因此，LAP在100μM以下减少T细胞增殖主要是由于抑制了增殖反应，而不是毒性降低了细胞活力。

补充尿苷可以完全逆转LEF的抗增殖作用，支持DHODH是LEF的靶点。然后，我们研究了Lapachol/LAP的抗增殖作用是否也是由于靶向DHODH。为此，在不同浓度的尿苷存在下，用LAP预处理人CD4 T细胞。如图2c所示，尿苷能够以剂量依赖的方式逆转LAP的抗增殖作用。值得注意的是，单独使用尿苷对抗CD3刺激的T细胞的增殖反应影响很小。 口服Lapachol对B16BL6黑色素瘤细胞实验性转移的影响[2] 在将肿瘤细胞注射到侧尾静脉之前，对小鼠口服拉帕乔三次（分别在-48、-24和-6小时）。肿瘤细胞注射两周后，对小鼠实施安乐死，并计算肺部转移结节的数量。低剂量（0.5、5、10和20mg/kg）的lapachol弱但显著地抑制了转移，而高剂量（80和100mg/kg）则显著促进了转移（图1A）。为了证实低剂量拉帕乔的转移抑制作用，我们增加了0.5和5.0 mg/kg的拉帕乔给药频率。虽然拉帕乔显示出抑制转移的趋势，但抑制作用并没有随着给药频率的增加而增加（图1B）。

与对转移的弱抑制相反，促进转移是实质性的。由于治疗剂对转移的强烈促进作用值得高度关注，我们进一步研究了拉帕乔的转移促进特性。为了确定Lapachol促进转移的敏感期，在肿瘤细胞注射前48、24或6小时给予lapachol（80mg/kg）一次。仅在肿瘤细胞注射前6小时给药显著增加了肺部转移结节的数量（图1C）。这些结果表明，lapachol在给药后6小时内促进转移，这种作用在24小时内消失。

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Lapachol体外治疗对B16BL6黑色素瘤细胞实验性转移的影响[2]
为了研究口服Lapachol是否通过直接影响肿瘤细胞或宿主因子来促进转移，B16BL6黑色素瘤细胞在体外用lapachol处理24小时，然后静脉注射到小鼠体内。据报道，单次口服35-40 mg/kg的拉帕乔后，24小时内人体血浆浓度为5.6-26.4μg/ml（Block等人，1974）。我们研究了lapachol对培养的B16BL6黑色素瘤细胞的影响，发现用>25μg/ml的lapachol治疗24小时完全杀死了B16BL6-黑色素瘤电池（数据未显示）。20μg/ml的拉帕乔体外治疗略微增加了肺部转移结节的数量（图1D），但这一增加远低于口服拉帕乔后观察到的增加（图1A和C）。这些结果表明，lapachol促进转移主要来自对宿主因子的影响，而不是对肿瘤细胞的直接影响。

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观察到HepG2细胞的细胞毒性低（3405.8±261.33μM），抗利什曼原虫活性良好，对亚马逊乳杆菌（IC50=79.84±9.10μM，SI=42.65）和婴儿乳杆菌（IC50=135.79±33.04μM，SI=25.08）的前鞭毛体具有良好的选择性指数（SI）。此外，对细胞内无鞭毛体进行的抗利什曼原虫活性测定显示，对拉帕乔具有良好的活性（对亚马逊乳杆菌的IC50=191.95μM，对婴儿乳杆菌的IC50=171.26μM）。流式细胞术分析表明，Lapachol对利什曼原虫前鞭毛体的细胞毒性作用是由凋亡样死亡引起的[3]。

在 CIA 小鼠模型中，拉帕科尔（3、10 mg/kg；壁灌胃；每天一次，持续 4 周）可减轻实验性关节炎的严重程度 [1]。当每天使用一次，持续九天时，拉帕胆（10 mg/kg；壁灌胃）可显着降低患有灾难性关节炎 (AIA) 的成年 C57BL/6 小鼠的膝白细胞呼吸 [1]。

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LAP/Lapachol可减轻实验性关节炎的严重程度[1]
接下来，我们研究了LAP在两种关节炎实验模型中的治疗潜力。第一种模型是胶原诱导性关节炎（CIA），这是一种成熟的RA T细胞依赖性临床前模型。在第一次免疫接种后的第21天，在加强注射胶原蛋白后立即开始使用LAP治疗。小鼠每天口服一次LAP（3mg/kg和10mg/kg），持续4周。根据对一般毒性症状的观察，LAP耐受性良好，没有明显的副作用，包括竖毛、腹泻、体重减轻和虚脱。我们还发现，在CIA方案期间，LAP治疗没有改变ALT或AST的血清水平（附加文件6：图S3），表明在所用剂量下它没有肝毒性。作为阳性治疗对照，使用相同的治疗方案用LEF（3mg/kg）治疗小鼠。本治疗方案中使用的LEF和LAP剂量基于之前的报告。从加强针注射（第0天）开始记录临床关节炎评分，并根据爪肿胀、红斑和强直的程度进行分级（如方法部分所述）。我们发现，在两种剂量下，LAP均显著减轻了CIA小鼠关节炎的严重程度，与LEF治疗的小鼠相似，临床评分和受影响爪子数量的减少证明了这一点（图3a）。用H&E和赛峰红-O染色的载体处理小鼠膝关节切片的组织病理学分析显示，与未经处理的小鼠相比，炎症细胞浸润、血管翳形成和软骨损失（图3b和c）。值得注意的是，与赋形剂治疗组相比，LAP显著降低了关节炎严重程度的所有组织病理学特征。在用LAP和LEF治疗的小鼠之间，没有观察到组织病理学特征的显著差异（图3b和c）。此外，我们测量了接受或未接受LAP或LEF治疗的CIA小鼠后爪中炎性细胞因子和MPO活性的水平，这间接反映了中性粒细胞的浸润。我们没有发现各组之间IFN-γ水平有任何显著差异（图3d）。然而，用10mg/kg剂量的LAP治疗的CIA小鼠显示IL-17A水平显著降低（图3e）。此外，我们发现，与载体处理的CIA小鼠相比，用LAP或LEF处理的小鼠MPO活性降低（图3e）。

最后，我们在第二个实验性关节炎模型中研究了LAP/Lapachol的免疫调节作用。为此，我们在C57BL/6小鼠中采用了抗原诱导性关节炎（AIA）模型，该模型也需要T细胞反应来产生急性关节炎症。简而言之，从首次用抗原mBSA免疫后12天开始，在9天内每天口服一次LAP（10mg/kg）治疗小鼠。在第一次免疫后的第21天，通过将mBSA关节内注射到免疫小鼠的膝盖中诱导关节炎。我们没有发现用LAP治疗或未用LAP（载体）治疗的mBSA免疫小鼠之间抗mBSA总IgG的血清水平存在差异（附加文件7:图S4）。然而，与赋形剂处理的小鼠相比，经LAP处理的小鼠在mBSA攻击后6小时，白细胞浸润膝关节的情况显著减少（图4a）。然后，我们评估了接受或未接受LAP治疗的mBSA免疫小鼠的细胞的回忆反应。在用LAP治疗的小鼠中，通过引流淋巴结细胞和脾细胞产生的mBSA特异性IL-17和IFN-γ显著降低（图4b和c）。在受刺激细胞的上清液中未检测到IL-4（数据未显示）。总的来说，这些发现显示了LAP在两种实验性关节炎模型中的显著免疫调节作用。

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口服Lapachol可促进T细胞缺陷小鼠和NK抑制小鼠B16BL6黑色素瘤细胞的实验性转移[2]
免疫细胞，如T细胞和NK细胞，被认为负责检测和消除肿瘤细胞（Trinchieri，1989，Jakobisiak等人，2003，Mehlen和Puisieux，2006）。为了检查lapachol是否通过这些免疫细胞介导转移增强，使用T细胞缺陷的裸鼠和NK抑制的小鼠进行了转移试验。当B16BL6黑色素瘤细胞在口服lapachol 6小时后静脉注射到这些小鼠体内时，肺部转移结节的数量急剧增加（图2），与正常小鼠一样（图1C）。这些观察结果表明，lapachol可以在没有T细胞和NK细胞的情况下促进转移。然而，如果不检查lapachol对正常小鼠中这些免疫细胞的影响，就不能排除lapachol影响T细胞和NK细胞的可能性。

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口服维生素K拮抗剂后蛋白C活性和凝血酶原时间[2]
维生素K拮抗剂可以在治疗开始时短暂诱导高凝状态（Vigano等人，1984，Stirling，1995，Srinivasan等人，2004）。高凝状态促进癌症患者的血液-身体转移（Bick，1992，Rickles等人，1992，Mousa等人，2006）和实验动物（Cliffton等人，1961，Cliffton和Agostino，1964）。为了研究拉帕酚引起的高凝状态是否会促进转移，口服拉帕酚后测量了蛋白C活性和凝血酶原时间。蛋白C活性在服用Lapachol后3小时内显著下降，在6至12小时之间最大程度降低，在12至24小时之间缓慢恢复。另一方面，凝血酶原时间仅在服用lapach后12小时显著延长（图4A）。服用lapachol 6小时后，蛋白C活性受到最大程度的抑制，但凝血酶原时间没有延长。因此，服用lapachol后至少6小时出现高凝状态。高凝状态的这些时间过程与以下观察结果一致：在服用拉帕乔6小时后注射肿瘤细胞时转移增加，在服用拉帕乔24小时后注射瘤细胞时缺乏转移促进（图1B）。

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为了评估利什曼原虫对宿主组织的影响，将CL和VL的小鼠模型提交给使用口服拉帕乔的治疗方案。治疗后，动物被安乐死。在样本采集过程中，没有观察到病变大小和肝脏或脾脏的宏观变化有显著差异（数据未显示）。与对照组（阴性治疗组）相比，用Lapachol或Amb治疗CL显著降低了小鼠皮肤中的寄生虫负荷（p < 0.05). 皮肤病变中寄生虫的平均数量（5.4× 108 lapachol组测定的寄生虫/mg约为未治疗组的24.5倍（1.324× 1010 寄生虫/mg）。同样，用Amb治疗的动物（阳性治疗组）的寄生虫数量减少了33.5倍（3.95× 108) 与未治疗对照组相比，每毫克皮肤（图4B）。[3]

另一项研究表明，在感染巴西乳杆菌的仓鼠中口服Lapachol并没有显著降低病变处的寄生虫载量（Teixeira等人，2001）。尽管本研究中口服了拉帕乔，但CL（BALB/c小鼠代替仓鼠）模型、利什曼原虫种类、治疗方案和评估寄生负荷的方法与之前的研究不同，这可能解释了结果的差异。[3]

引人注目的是，Lapachol治疗VL小鼠显著降低了动物脾脏和肝脏中的寄生负荷（p < 0.05). 与未治疗的动物相比，用Lapachol治疗的小鼠脾脏和肝脏中的寄生虫分别减少了约4.6和5.3个。与未治疗的动物相比，用Amb治疗的小鼠脾脏和肝脏中的寄生虫分别减少了约18.6和54.4个（图4A）[3]。

酶活性实验[1]
使用监测2,6-二氯靛酚（DCIP）还原的比色连续测定法评估hDHODH活性。在25°C下，使用微孔板读数器在60秒内监测610 nm处的吸光度变化。在195μl的总体积中分析酶反应，其中含有50 mmol/l Tris、pH 8.15、150 mmol/l KCl、0.1%Triton X-100、1 mmol/l l-二氢乳清酸盐、100μmol/l CoQ0和60μmol/l DCIP。该测定从5μl 0.8μmol/l酶储备开始，该酶储备在50 mmol/l HEPES、pH 7.7、400 mmol/l NaCl、10%甘油、0.05%Thesit和1 mmol/l EDTA中制备，酶的终浓度为20 nmol/l。通过制备不含酶的相同溶液获得参考测量值。
对每种浓度的LAP/Lapachol进行了四次分析。LAP/Lapachol钠盐在DMSO中制备为10mmol/l的储备。从该溶液中，在测定混合物中制备稀释液，以达到100μmol/l至0.35 nmol/l的范围。在没有抑制剂的情况下，对照酶活性取100%。绘制了LAP/Lapachol浓度图的活性百分比与对数。使用浓度-反应数据对方程的非线性拟合计算半最大抑制浓度（IC50）值。

细胞增殖测定[1]
细胞类型：鼠 CD4 T 细胞
测试浓度：10、30、100 μM
孵育时间：4天
实验结果：以剂量依赖性方式抑制小鼠CD4 T细胞的增殖。

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Lapachol对体外前鞭毛体存活率的影响[3]
使用基于刃天青的比色测定法测定了拉帕酚对婴儿乳杆菌和亚马逊乳杆菌前鞭毛体的抑制浓度（IC50）（Corral等人，2013）。对数相位前鞭毛体（2.5× 105 寄生虫/孔）接种在完全α-MEM的平底96孔细胞培养板中，并在26℃下孵育 °C.Lapachol在七种浓度下连续稀释两倍（从412 μM至6 μM），每种浓度测试三次。Amb用作阳性对照（0.54–0.008μM）。未经处理的寄生虫用于比较存活率。细胞与这些物质一起孵育48小时 h、 之后，向孔中加入刃天青溶液（10%v/v），并将平板孵育4小时 h.荧光（Spectramax M2，Molecular Devices LLC，美国）在550℃下测量 nm激发和590 nm发射波长。荧光强度以任意单位表示。

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Lapachol对HepG2细胞系的体外细胞毒性[3]
使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）法测定物质对HepG2细胞的细胞毒性浓度（CC50）（Mosmann，1983）。在5℃时将细胞接种在96孔平底板中 × 104 将细胞/孔置于完全RPMI-1640培养基中并保持24小时 h at 37 在5%CO2的加湿环境中，温度为°C。Lapachol在七种浓度下连续稀释两倍（从4.12 mM至0.016 μM）并加入培养皿中，培养48小时 h at 37 在5%的二氧化碳存在下，温度为°C。随后，将MTT溶液（5 mg/mL，50μg/孔）加入孔中，并将平板再孵育4小时 h.吸出上清液，将形成的甲赞晶体溶解在DMSO中。在570℃下用分光光度计测定吸光度 nm（Dutta等人，2005，Mosmann，1983）。未经处理的HepG2细胞和Amb（1.080 mM–17） μM）作为对照。Lapachol在微孔板上进行了利什曼病活性和细胞毒性的技术三重测试，结果代表了三个独立的实验（生物三重）。 Lapachol在微孔板上进行了利什曼病活性和细胞毒性的技术三重测试，结果代表了三个独立的实验（生物三重）。

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Lapachol对细胞内无鞭毛体的疗效[3]
永生小鼠巨噬细胞RAW 264.7，在完全RPMI-1640培养基中培养，并保持在37 在5%CO2和95%湿度的气氛中，在°C下播种（5× 104/在每个孔中都装有圆形盖玻片的24孔组织培养板上培养4个孔（37°C，5%CO2） h以允许细胞粘附。然后，加入处于晚期稳定生长阶段的利什曼原虫前鞭毛体，以10个前鞭毛体/巨噬细胞/孔的比例与巨噬细胞相互作用24小时 h.随后，将lapachol连续稀释两倍（范围为660 μM至41 μM）和Amb（范围为0.54至0.03 μM）加入到孔中。48之后 h、 取下盖玻片，用快速全景镜染色，用加拿大香脂装在载玻片上，用光学显微镜分析巨噬细胞的感染率。每种浓度获得的值[（感染的巨噬细胞数量/300个计数的巨噬细胞） × 100] 用于获得lapachol的无鞭毛体细胞内IC50值。lapachol对细胞内无鞭毛体影响的IC50表示为与未处理的对照细胞相比，将感染的巨噬细胞数量减半所需的浓度（Vermeersch等人，2009）。

动物/疾病模型：雄性DBA1/J小鼠（10-12周龄）胶原诱导性关节炎（CIA）模型[1]
剂量：3 mg/kg和10 mg/kg
给药途径：口服；每日一次，持续4周
实验结果：两种剂量均显著减轻了CIA小鼠的关节炎严重程度。显著减轻了所有与关节炎严重程度相关的组织病理学特征。

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胶原诱导性关节炎 (CIA) [1]
雄性 DBA/1 J 小鼠于第 0 天经尾根部皮内注射 200 μg 牛 II 型胶原蛋白 (CII)（溶于弗氏完全佐剂 (CFA)）。第 21 天，小鼠再次皮内注射 200 μg CII（溶于弗氏不完全佐剂 (IFA)）。每日观察小鼠的关节炎症状。根据每只爪子出现的红斑、肿胀或关节强直情况，按 0 至 3 分进行评分，每只小鼠最高分为 12 分。关节炎诱导后，小鼠每日口服 LAP/拉帕醇（3 mg/kg 和 10 mg/kg）、LEF（3 mg/kg）或生理盐水。胶原蛋白加强注射后，每日评估临床评分。所有小鼠在加强免疫后4周被安乐死，用于后肢组织学评估。

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抗原诱导性关节炎 (AIA) [1]
小鼠按照先前描述的方法用甲基化牛血清白蛋白 (mBSA) 进行免疫。简而言之，小鼠通过皮下注射含有 mBSA (500 μg) 和 CFA（2 mg/ml 灭活结核分枝杆菌）的乳剂进行免疫。在首次免疫后第7天和第14天，分别给予 mBSA/FFA 加强注射。在首次免疫后第21天，通过关节内注射 mBSA (30 μg) 诱导关节炎。在 AIA 实验方案中，从首次免疫后第12天到第21天，每天口服 LAP/拉帕醇 (10 mg/kg) 或生理盐水（载体）。

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药物给药和治疗[2]
拉帕醇溶于2%碳酸钠水溶液，华法林溶于水。这些药物通过灌胃给药。维生素K3溶于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，腹腔注射给药。所有溶液均在使用前新鲜配制。体外治疗中，拉帕醇溶于40 mM乙醇溶液中，并加入培养物。对照组培养物中加入0.05%乙醇。拉帕醇对利什曼病的体内疗效[3]
本研究已获得乌贝兰迪亚联邦大学动物实验伦理委员会的批准（方案编号069/2013），所有程序均按照国际指南（《实验动物护理原则》（1985））执行。

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皮肤利什曼病模型[3]
18只BALB/c小鼠（8周龄雌性）经皮下途径感染1 × 10⁷个亚马逊利什曼原虫（L. amazonensis）后环状前鞭毛体。感染30天后，将小鼠随机分为三组：（a）拉帕醇组（n = 6；25 mg/kg，口服，持续24小时，共10天），（b）安非他明组（n = 6；5 mg/kg，腹腔注射，持续24小时，共10天），（c）PBS组（n = 6；口服，持续24小时，共10天）。治疗结束后处死动物，收集皮肤病变组织，用于定量聚合酶链式反应（qPCR）检测寄生虫载量。

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内脏利什曼病模型[3]
18只BALB/c小鼠（8周龄雌性）经腹腔注射感染1 × 10⁷个婴儿利什曼原虫后环状前鞭毛体。感染20天后，将小鼠随机分为三组：（a）拉帕醇组（n = 6；25 mg/kg，24小时口服，连续10天），（b）两性霉素B组（n = 6；5 mg/kg，24小时腹腔注射，连续10天），以及（c）PBS组（n = 6；24小时口服，连续10天）。

采用超高效液相色谱串联质谱法 (UPLC-MS/MS) 分析了拉帕醇钠盐在血浆和酸性介质（类似于胃内环境）中的稳定性，结果证实拉帕醇钠盐可瞬间转化为中性拉帕醇分子。静脉给药后，拉帕醇和拉帕醇钠盐的血浆浓度曲线完全一致，符合二室开放模型，分布容积为 0.19 ± 0.03 L/kg，总清除率为 0.04 ± 0.01 L/h/kg，半衰期为 4.1 ± 1.1 h（补充文件 1：图 S1；补充文件 2：表 S1）。在所研究的剂量范围 (2–25 mg/kg) 内，观察到线性药代动力学特征。口服 LAP 和 LAP 钠盐（两种不同剂量）后的血浆浓度曲线最符合单室模型，生物利用度分别为 55–77% 和 42%（附加文件 1：图 S1；附加文件 3：表 S2）。[1]

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LAP 钠盐的制备[1]
将 LAP（500 mg，2.06 mmol）溶于乙醇（20 ml）中，加入 NaOH（112 mg，0.28 mmol），反应混合物搅拌 24 小时。 LAP消耗完毕后，反应混合物在减压下浓缩，固体残余物用二氯甲烷（4次）和石油醚（4次）洗涤，得到518 mg紫色固体，产率为95%（1H NMR (300 MHz, D2Od6) δ7.66 (br s, 1H), 7.64 (br s, 1H), 7.53 (br t, J = 9 Hz, 1H), 7.41 (br t, J = 9 Hz, 1H), 5.15 (br t, J = 9 Hz, 1H), 3.06 (d, J = 6 Hz, 2H), 1.72 (s, 3H), 1.63 (s, 3H); 13C NMR (101 MHz, DMSOd6) δ 187.2, 178.4, 169.6, 1000 ppm）。 136.0、133.2、131.3、129.7、127.5、125.76、124.81、124.4、117.9、25.59、20.8、14.1；HRMS-ESI m/z 计算值：[M + Na]+ = 265.0835；实测值 = 265.0834）。

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药代动力学研究设计[1]
为给 Wistar 大鼠给药，将 LAP/拉帕醇 溶解于 DMSO:Tween 80:5% 葡萄糖溶液中，体积比为 15:5:80，得到浓度为 1 mg/ml（用于静脉注射）和 5 mg/ml（用于口服）的溶液。将LAP以2 mg/kg的静脉推注剂量（n = 7）和10 mg/kg（n = 8）及25 mg/kg（n = 6）的口服剂量分别给予大鼠。LAP盐以静脉注射（2 mg/kg，n = 6）和口服（30 mg/kg，相当于27.5 mg/kg的LAP，n = 8）的方式给药。静脉注射剂量经尾侧静脉注射，口服剂量经灌胃给药。剂量选择基于先前的毒理学和药效学研究[20]。在预定的时间点（给药前30分钟以及给药后0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24小时），通过穿刺侧尾静脉（与给药静脉相反），抽取血样（200–250 μl）至肝素化试管中。口服LAP后也采用相同方法，分别在0.25、0.5、1、1.5、2、3、6、12、24和30小时采集血样。静脉注射和口服LAP钠盐后，分别在给药后10小时和12小时内采集血样。通过离心（6800 × g，4 °C，10 分钟）分离血样，获得血浆，并储存于 –80 °C 直至进行 UPLC-MS/MS 分析。药代动力学分析 [1]
静脉和口服给药后，采用非房室模型 (NCA) 分析个体血浆浓度-时间曲线，测定拉帕醇/拉帕醇和拉帕醇钠盐的药代动力学参数。口服给药后，通过目测血浆浓度-时间曲线数据获得血浆峰浓度 (Cmax) 和达峰时间 (Tmax)。消除速率常数 (λ)、曲线下面积 (AUC0–∞)、清除率 (CLtot)、半衰期 (t1/2)、分布容积 (Vdss)、平均滞留时间 (MRT) 和生物利用度 (Fabs) 等药代动力学参数采用经典方程计算。房室模型分析使用 SCIENTIST v.2.0.1 软件进行。评估了采用或不采用加权方案的一室模型和二室模型。根据残差的随机分布、相关系数以及软件给出的模型选择标准 (MSC) 选择最适合数据的模型。静脉注射后，LAP/拉帕醇和LAP钠盐的个体血浆浓度曲线最符合二室开放模型。口服两种不同剂量的LAP和一种剂量的LAP钠盐后的血浆浓度曲线最符合一室模型。采用UPLC-MS/MS [1] 进行血浆分析。血浆样本中LAP/拉帕醇的浓度采用经验证（美国食品药品监督管理局，2001）的UPLC-MS/MS方法测定。分析在Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 × 50 mm，1.7 μm粒径）上进行，流速为300 μL/min，柱温为35 °C。流动相为水（A）和乙腈（B），并用0.1%乙酸酸化，梯度洗脱程序如下：0 min (90% A)，1 min (75% A)，7 min (50% A)，8.5 min (0% A)，9.5 min (100% A)。三重四极杆质谱仪的参数设置如下：毛细管电压 (2.20 kV)；萃取器电压 (3.0 V)；离子源温度 (150 °C)；脱溶剂温度 (300 °C)；锥孔气流速 (50 L/h)；脱溶剂气流速 (700 L/h)。定量分析采用多反应监测 (MRM) 方法。对于 LAP，使用 24 V 锥孔能量和 19 V 碰撞能量，确定 m/z 243 > 187 的跃迁最适合定量分析（LAP 的校准曲线浓度范围为 1 至 20,000 ng/ml，R > 0.99，定量限为 1 ng/ml，检测限为 0.1 ng/ml）。

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药代动力学研究的样品制备 [1]
将 200 μl 含有 5 μg/ml 内标（2-甲基氨基拉帕醇）和 0.05% 三氟乙酸的冷乙腈加入到 100 μl 血浆中，涡旋振荡 20 秒。通过离心（4 °C，6800 × g，10 分钟）去除沉淀的蛋白质。取200 μl上清液，用纯水1:1稀释，经0.22 μm滤膜过滤后进行分析。为制备校准曲线，将LAP/拉帕醇加入空白血浆样品中，并按指示进行后续处理。浓度处于校准曲线上限的动物样品，在处理前用空白血浆稀释。

3884 大鼠口服 LDLo 1200 mg/kg，《毒理学与应用药理学》，17(1)，1970 [PMID:4989601]
3884 小鼠口服 LD50 487 mg/kg 行为：嗜睡（总体活动抑制）；胃肠道：肠蠕动亢进、腹泻；皮肤及附属器官（皮肤）：皮炎，其他：全身暴露后，《毒理学与应用药理学》，17(1)，1970 [PMID:4989601]
3884 小鼠腹腔注射 LD50 400 mg/kg，《药物化学杂志》，26(570)，1983

[1]. Lapachol, a compound targeting pyrimidine metabolism, ameliorates experimental autoimmune arthritis. Arthritis Res Ther. 2017 Mar 7;19(1):47.
[2]. Promotion or suppression of experimental metastasis of B16 melanoma cells after oral administration of lapachol. Toxicol Appl Pharmacol. 2008 Jun 1;229(2):232-8.
[3]. Efficacy of lapachol on treatment of cutaneous and visceral leishmaniasis. Exp Parasitol. 2019 Apr:199:67-73.

拉帕醇是一种羟基-1,4-萘醌，即1,4-萘醌在2位和3位分别被羟基和3-甲基丁-2-烯-1-基取代。它是一种天然化合物，具有抗菌和抗癌特性，于1882年首次从紫葳科植物Tabebuia avellanedae的树皮中分离得到。它可作为植物代谢产物、抗肿瘤剂、抗菌剂和抗炎剂发挥作用。它是一种羟基-1,4-萘醌类烯烃化合物。
据报道，拉帕醇存在于梓树（Catalpa ovata）、杨树（Plenckia populnea）和其他有相关数据的生物体中。

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背景：抑制嘧啶生物合成，阻断二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）的活性（来氟米特的主要靶点），已被证明是治疗类风湿性关节炎（RA）的有效策略。然而，相当一部分RA患者对LEF治疗无效。本研究以天然萘醌类化合物拉帕醇（LAP）为潜在的DHODH抑制剂，并探讨了其免疫抑制特性。
方法：我们进行了分子柔性对接研究和生物活性测定，以确定LAP与DHODH相互作用并抑制其活性的能力。此外，我们还利用分离的淋巴细胞进行了体外研究，以评估LAP的抗增殖作用。最后，我们采用胶原诱导性关节炎 (CIA) 和抗原诱导性关节炎 (AIA) 模型来研究 LAP 的抗关节炎作用。
结果：我们发现 LAP 是一种有效的 DHODH 抑制剂，具有显著的体外抑制人和小鼠淋巴细胞增殖的能力。重要的是，补充尿苷可消除 LAP 的抗增殖作用，表明嘧啶代谢途径是 LAP 的作用靶点。体内实验表明，LAP 治疗显著减轻了 CIA 和 AIA 的进展，表现为临床评分、关节组织损伤和炎症的降低。
结论：我们的研究结果提出了一种结合模型，并证实 LAP 能够抑制 DHODH，从而减少淋巴细胞增殖并减轻实验性自身免疫性关节炎的严重程度。因此，LAP 可被视为一种潜在的免疫抑制剂，具有治疗类风湿关节炎的潜在应用价值。 [1]拉帕醇[2-羟基-3-(3-甲基-2-丁烯基)-1,4-萘醌]是一种具有抗肿瘤活性的维生素K拮抗剂。本研究考察了拉帕醇对小鼠B16BL6黑色素瘤细胞实验性转移的影响。在静脉注射肿瘤细胞前6小时，单次口服高毒性剂量的拉帕醇（80-100 mg/kg）可显著促进肿瘤转移。在T细胞缺陷小鼠和NK细胞抑制小鼠中也观察到了这种转移促进作用。体外用拉帕醇处理B16BL6细胞仅轻微促进了转移，表明拉帕醇促进转移的主要机制是影响除T细胞和NK细胞以外的宿主因子。在静脉注射肿瘤细胞前6小时，单次口服最常用的维生素K拮抗剂华法林也可显著促进B16BL6细胞的转移。预先给予维生素K3几乎完全抑制了拉帕醇和华法林促进转移的作用，表明拉帕醇促进转移的作用源于维生素K拮抗作用。口服拉帕醇或华法林6小时后，蛋白C水平降至最低，而凝血酶原时间未延长。这些观察结果提示，高毒性剂量的拉帕醇通过抑制维生素K依赖性通路诱导高凝状态，从而促进转移。另一方面，连续口服低剂量（5-20 mg/kg）的拉帕醇可微弱但显著地抑制转移，其机制尚不清楚，提示拉帕醇可能具有抗转移药物的潜力。[2]

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利什曼病是全球最重要的被忽视疾病之一。它是一种危及生命的疾病，会导致严重的疾病负担、长期残疾和过早死亡。治疗方法包括控制疾病或采取干预措施，但目前使用的药物需要长期治疗，且存在毒性和疗效降低的问题。从植物中分离的天然产物，例如拉帕醇（lapachol），一种天然存在于南美洲风铃木属（紫葳科）植物中的丰富的萘醌类化合物，是治疗利什曼病的一种很有前景的选择。本研究在体外和体内分别检测了拉帕醇对婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）和亚马逊利什曼原虫（L. amazonensis）的杀灭活性，这两种病原体分别是内脏利什曼病和皮肤利什曼病的病原体。在HepG2细胞中观察到较低的细胞毒性（3405.8 ± 261.33 μM），良好的抗利什曼原虫活性，以及对亚马逊利什曼原虫（IC50 = 79.84 ± 9.10 μM，SI = 42.65）和婴儿利什曼原虫（IC50 = 135.79 ± 33.04 μM，SI = 25.08）前鞭毛体的良好选择性指数（SI）。此外，对细胞内无鞭毛体进行的抗利什曼原虫活性测定显示，拉帕醇具有良好的活性（对亚马逊利什曼原虫的IC50 = 191.95 μM，对婴儿利什曼原虫的IC50 = 171.26 μM）。流式细胞术分析表明，拉帕醇对利什曼原虫前鞭毛体的细胞毒性作用是由凋亡样死亡引起的。有趣的是，拉帕醇的体外杀灭利什曼原虫作用在小鼠内脏利什曼病和皮肤利什曼病模型中得到了体内验证。拉帕醇（25 mg/kg，口服，24 小时，连续 10 天）能够显著降低皮肤病变、肝脏和脾脏中的寄生虫载量，其效果与参考药物两性霉素 B 相似。这些结果强化了拉帕醇的治疗潜力，值得进一步研究其作为抗利什曼病治疗药物的潜力。[3]

C15H14O3

242.27

242.094

C, 74.36; H, 5.82; O, 19.81

84-79-7

3884

Light yellow to yellow solid powder

1.2±0.1 g/cm3

390.1±42.0 °C at 760 mmHg

141-143ºC(lit.)

203.9±24.4 °C

0.0±0.9 mmHg at 25°C

1.606

4.08

54.37

1

3

2

18

439

0

O=C1C2C(=CC=CC=2)C(=O)C(C/C=C(\C)/C)=C1O

CWPGNVFCJOPXFB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H14O3/c1-9(2)7-8-12-13(16)10-5-3-4-6-11(10)14(17)15(12)18/h3-7,16H,8H2,1-2H3

4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-enyl)naphthalene-1,2-dione

NSC 11905; 84-79-7; 2-Hydroxy-3-(3-methylbut-2-enyl)-1,4-naphthoquinone; lapachol; Greenhartin; Bethabarra wood; Taiguic acid; Lapachol wood; Taigu wood; NSC-11905; Lapachol

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~66.67 mg/mL (~275.19 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。