LCAHA

Deubiquitinase USP2a (IC50 = 9.7 μM)

LCAHA的 GI50 分别为 0.87±0.09 和 0.96±0.29μM，LD50 分别为 27.8±3.9 和 26.5±0.1μM，可抑制 HCT116wt 和 HCT116 p53-/-结肠癌细胞的活力[1]。 最有效的LCA衍生物LCA羟酰胺（LCAHA）抑制USP2a，导致细胞周期蛋白D1的Akt/GSK3β非依赖性失稳，但不会改变p27的表达。这导致了细胞周期进程中的缺陷。因此，LCAHA抑制表达细胞周期蛋白D1的细胞生长，但不抑制细胞周期蛋白D2阴性细胞的生长，与p53状态无关。我们发现LCA衍生物可能被认为是治疗细胞周期蛋白D1添加的p53表达和p53缺陷型癌症的未来疗法。[1]

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对于一种LCA衍生物，LCAHA，在测试的两种细胞类型中都观察到了双相反应：低浓度GI效应和高浓度毒性效应（图1A）。仅在与高浓度毒性作用相对应的浓度下观察到LDH释放（图1B）。根据MTT结果计算的两种细胞系的GI50值均低于1μM（表2），在2-20μM的浓度范围内，细胞的生长受到约60%的抑制（图1A）。对于致死效应，两种细胞系的LD50值均高于25μM，这表明GI效应的选择性高于p53wt细胞的31.9倍和p53-/-细胞的27.6倍的致死效应（表2）。[1]

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为了评估观察到的效应是否伴随着凋亡的诱导，我们检测了HCT116 p53wt细胞中胱天蛋白酶3和7的激活。在用1或5μM LCAHA处理48或72小时的细胞中检测到胱天蛋白酶活性的微弱而不显著的增加。只有在10μM LCAHA时胱天蛋白酶的活性才显著增加（图1C）。因此，在化合物的GI浓度范围内不能有效诱导细胞凋亡。用已知的凋亡诱导剂星孢菌素治疗，导致胱天蛋白酶3和7的活性显著增加（图1C）。 [1]

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LCAHA将HCT116细胞阻滞在G0/G1期[1]
低浓度的LCAHA抑制HCT116细胞的生长，而不影响其存活。为了研究这种效应，我们分析了细胞周期分布。用LCAHA或DMSO处理48小时的细胞用BrdU脉冲标记1小时，并用异硫氰酸荧光素（FITC）-抗溴脱氧尿苷（BrdU）抗体和碘化丙啶（PI）染色。流式细胞术分析显示，用5或10μM LCAHA处理的HCT116 p53wt和HCT116 p53−/-细胞均出现轻度但显著的G0/G1期阻滞（图1D）。BrdU掺入分析显示，LCAHA处理细胞的DNA合成速率呈剂量依赖性下降（图1E）。这表明，除了G0/G1期阻滞外，LCAHA还影响S期的进展

为了验证这一点，我们用BrdU对用LCAHA处理48小时1小时的HCT116 p53wt细胞进行脉冲标记，并再收获或培养3、6或9小时。为了精确追踪S期和G0/G1期阻滞的进展，我们使用ModFit LT软件分别分析了FITC阳性和阴性细胞的细胞周期分布。FITC阳性细胞代表掺入BrdU的细胞（在脉冲标记期间处于S期的群体，在随后的几个小时内向G2/M发展），FITC阴性细胞代表不掺入Brd U的细胞，即在脉冲标记过程中处于G0/G1期或G2/M期并在随后的几小时内进入S期或分裂的群体

正如预期的那样，在时间点t0，大多数BrdU+细胞处于S期，大多数Brd U−细胞处于G0/G1或G2/M期（图1F）。9小时后，用DMSO处理的BrdU+细胞中只有23%仍处于S期，超过50%的细胞已经完成细胞周期，处于G0/G1期（图1F，上图）。LCAHA治疗剂量依赖性地抑制了BrdU+细胞通过S期的转变，这可以从留在S期的细胞比例显著增加（在5μM LCAHA治疗时高达56%）和G0/G1期细胞比例显著降低（低至24%）中得到证明。与此同时，用DMSO处理的BrdU−细胞中约有44%离开G0/G1期并进入S期，而用LCAHA处理的化合物在5μM浓度下显著且剂量依赖性地抑制了这一转变，使其降至20%（图1F，底部三幅图）。这些结果显示，G0/G1期阻滞比对整个细胞群的简单分析所表明的要强烈得多（图1C）。图S2显示了测试的完整结果，以3小时的间隔显示了细胞周期的进展。

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LCAHA诱导的G0/G1期阻滞伴随着细胞周期蛋白D1表达的降低[1]
从G1期到S期的进展在很大程度上依赖于D细胞周期蛋白的表达和活性。为了验证LCAHA治疗后观察到的细胞周期进展障碍是否与D细胞周期蛋白有关，我们研究了HCT116 p53wt和HCT116 p53−/−细胞中细胞周期蛋白D1和D3的表达。在用5或20μM LCAHA处理的两种细胞系中，观察到细胞周期蛋白D1表达的显著剂量依赖性降低；然而，这种效应在HCT116 p53wt细胞中更为明显（图2A）。LCA不影响细胞周期蛋白D1的表达，LCAE对HCT116细胞的存活没有双相作用，降低了HCT116 p53wt细胞中该蛋白的表达，但这种作用比LCAHA弱得多（图2A）。用任何化合物处理24小时均不影响HCT116细胞系中细胞周期蛋白D1的表达（图S3B）。

热迁移实验(TSA) [1]
在USP2a和测试化合物存在下，通过监测SYPRO Orange染料的荧光强度随温度升高(22°C至98°C)的变化进行TSA分析。实验在pH=7.4的PBS缓冲液中进行。将USP2a(1 μM)单独或与LCAE/LCAHA化合物(均为50 μM)共同孵育。应用恒定温度梯度(0.2°C/min)，使用实时热循环仪监测荧光变化。通过荧光强度对温度的一阶导数曲线估算熔解温度(Tm)。

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基于MALDI-TOF的高通量DUB活性检测[1]
实验方法参照先前报道(Ritorto等，2014)。将31种人源DUBs用反应缓冲液(40mM Tris-HCl，pH 7.6，5mM DTT，0.005% BSA)新鲜稀释至适当浓度。酶与LCAHA和LCAE(终浓度100 μM)在室温孵育30分钟。将二聚泛素拓扑异构体(K63、K48、K11和M1)稀释至0.2 μl/μg，使用纳升级移液系统加入反应体系(终浓度1.5 μM)。密封板后在室温孵育30分钟，加入TFA(终浓度2% v/v)终止反应。
终止的反应液(1.050 μl)转移至384孔板，加入15N-泛素内标(0.15 μl，16 μM)，与新鲜配制的2.5 DHAP基质(7.6 mg 2,5 DHAP溶于375 μl乙醇和125 μl 12 mg/ml柠檬酸氢二铵水溶液)按1:1混合。取200 μl混合液点样至MTP AnchorChip 1,536 TF(600 mm anchor)靶板。
质谱数据在UltrafleXtreme MALDI-TOF质谱仪(Compass 1.3控制和数据处理软件)上采集。每次分析前进行样品载体校准以优化激光聚焦。使用15N-Ub峰[M+H]+(平均值=8,569.3)进行内标校准。如文献报道(Ritorto等，2014)采用自动模式分析样品。面积计算时考虑完整同位素分布。使用内部脚本计算15N和单泛素峰面积；图表绘制、标准差和变异系数(%)计算在Microsoft Excel中完成。

细胞活力测定[1]
细胞类型： HCT116wt 和 HCT116 p53-/- 结肠癌细胞
测试浓度： 0.01、0.1、1、10 和100 μM
孵育时间： 6 天
实验结果： 对于 HCT116wt 和 HCT116 p53-/-，GI50 分别为 0.87±0.09 和 0.96±0.29 μM结肠癌细胞。

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细胞周期分析 [1]
细胞分别用DMSO或LCAHA处理48小时，并在处理最后1小时脉冲标记10 μM溴脱氧尿苷(BrdU)。随后，细胞经胰蛋白酶消化后立即用96%乙醇固定，或在无BrdU条件下继续培养3-9小时后收集固定。使用PI和FITC标记的抗BrdU抗体染色后，通过Fortessa流式细胞仪检测，并采用ModFit LT软件分析细胞周期分布。

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Caspase 3/7活性检测 [1]
将细胞接种于96孔白色平底板，分别用DMSO、LCAHA或Staurosporine处理。按照制造商说明书使用Caspase-Glo 3/7检测系统测定caspase活性。鉴于LCAHA具有抑制细胞生长的特性，结果根据细胞数量进行标准化校正（校正系数来源于透明培养板上Hoechst染色细胞的核计数：DMSO处理3天的平均核数为6452个/视野，而不同浓度LCAHA处理组分别为3957、4229和2783个/视野）。

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克隆形成实验 [1]
MCF-7或SAOS-2细胞经DMSO或5 μM LCAHA预处理5天后，取1000个细胞接种于6孔板，培养2-4周至形成肉眼可见克隆。结晶紫染色后，通过ChemiDoc MP系统成像，并运用ImageJ软件(Schneider等，2012)的"Analyze particles"工具分析。存活分数(SF)计算公式为：SF = (处理组PE/对照组PE)×100%，其中PE(平板效率)=形成克隆数/接种细胞数。

[1]. Lithocholic Acid Hydroxyamide Destabilizes Cyclin D1 and Induces G 0/G1 Arrest by Inhibiting Deubiquitinase USP2a. Cell Chem Biol. 2017 Apr 20;24(4):458-470.e18.

总之，我们发现LCAHA诱导的细胞生长抑制伴随着细胞周期蛋白D1水平的显著降低，这是由于该蛋白稳定性下降所致。我们还发现LCAHA拮抗培养基中血清传递的增殖信号，并阐明了USP2a蛋白参与LCAHA诱导的细胞周期蛋白D1不稳定化的机制。我们的研究为基于LCA骨架设计更有效的USP抑制剂以改善癌症治疗奠定了基础。[1]

C24H41NO3

391.587247610092

391.308

C, 73.61; H, 10.55; N, 3.58; O, 12.26

117094-40-3

126961696

White to off-white solid powder

5.5

69.6

3

3

4

28

594

9

O[C@@H]1CC[C@@]2(C)C(C1)CC[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)CCC(NO)=O)CC[C@H]21

WZXAGWREMCSWMF-HVATVPOCSA-N

InChI=1S/C24H41NO3/c1-15(4-9-22(27)25-28)19-7-8-20-18-6-5-16-14-17(26)10-12-23(16,2)21(18)11-13-24(19,20)3/h15-21,26,28H,4-14H2,1-3H3,(H,25,27)/t15-,16-,17-,18+,19-,20+,21+,23+,24-/m1/s1

(4R)-N-hydroxy-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3-hydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanamide

LCAHA; 117094-40-3; (4R)-N-hydroxy-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3-hydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanamide; Lithocholic acid hydroxyamide;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~45 mg/mL (~114.92 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.31 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.31 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。