LDN-0212320

GLT-1 (glutamate transporter); EAAT2 (excitatory amino acid transporter 2)

兴奋性氨基酸转运蛋白2（EAAT2）是主要的谷氨酸转运蛋白，其功能是从突触中清除谷氨酸。已经发现一种硫代哒嗪衍生物可增加星形胶质细胞中EAAT2蛋白水平。一项构效关系研究表明，该分子的几种成分是活性所必需的，如硫醚和哒嗪。苄硫醚的改性产生了几种衍生物（7-13、7-15和7-17），在浓度<5μM的情况下，24小时后EAAT2水平提高了>6倍。此外，其中一种衍生物（7-22；LDN-212320）在EC50为0.5μM的条件下，24 h后EAAT1水平提高了3.5-3.9倍[2]。

腹腔注射 LDN-212320（10 或 20 mg/kg）可显着减少福尔马林引起的伤害性行为[1]。腹腔注射 LDN-212320（10 或 20 mg/kg）显着恢复了福尔马林损害的海马依赖性行为。此外，LDN-212320（10 或 20 mg/kg，腹腔注射）可提高 ACC 和海马区的 GLT-1 表达 [1]。 LDN-212320（20 mg/kg，腹腔注射）可显着降低 ACC 和海马区中福尔马林诱导的 ERK 磷酸化（一种伤害感受标记物）[1]。

化合物（10μM）孵育4和24小时后，在PA-EAAT2细胞（稳定表达EAAT2mRNA的原代星形胶质细胞系）中初步评估1的所有衍生物，然后收获并通过蛋白质印迹分析测量EAAT2水平。报道了EAAT2蛋白水平相对于DMSO对照的倍数增加。[2]

蛋白质印迹分析[1]
如前所述（Xu et al.，2006）进行蛋白质印迹分析，但进行了小的修改。简言之，通过快速斩首对小鼠实施安乐死；使用小鼠大脑立体定位坐标（Franklin和Paxinos，2008）从1mm的冠状切片中解剖其前扣带皮质（前扣带1.18 mm）和海马（前扣带回−1.7 mm），并在−80°C下保存直至分析。将组织在含有Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）、1%Igepal CA-630和0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）的改良RIPA缓冲液中匀浆。将蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂加入RIPA缓冲液中，并按照制造商的方案使用。将样品离心（16000 g，在4°C下20分钟）并收集上清液。以白蛋白为标准，通过双辛可宁酸测定法测定蛋白质浓度。将等量的蛋白质（60μg）加载到10%凝胶上进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。将分离的蛋白质在60 V、4°C下转移到硝化纤维素膜上过夜。用Tris缓冲盐水和0.1%吐温-20（TBST）中的5%脱脂奶粉封闭膜1小时。然后，在4°C下与GLT-1（1:1000，兔多克隆）、ERK1/2和pERK1/2（1:1000、兔多克隆，细胞信号技术，MA，USA）或β-微管蛋白（E7，1:5000，小鼠单克隆）的一级抗体孵育过夜。孵育后，在TBST中洗涤膜，然后用适当的辣根过氧化物酶偶联的第二抗体孵育，在浓度为1:5000的封闭缓冲液中稀释。用ECL Prime试剂检测结合抗体，并使用密度计分析进行蛋白质定量。[1]
免疫组织化学[1]
如前所述进行免疫组织化学研究（Zhang et al.，2018），进行了轻微修改。简言之，通过快速斩首对小鼠实施安乐死；取出它们的大脑并在室温下在4%多聚甲醛固定剂中后固定过夜。通过在4°C下浸泡在0.1 M PB中的30%蔗糖中对大脑进行冷冻保护，直到大脑沉入底部。用Tissue Tek OCT嵌入大脑，并用Leica CM1850低温恒温器将其切成15μm厚的切片。每组三到五个随机切片用0.3%Triton X-100的5%山羊血清在1x BPS中在室温下封闭1小时，然后与pERK1/2（1:500，兔多克隆）或GFAP（1:500）在4°C下孵育过夜。对于双重免疫荧光，将切片与兔p-ERK1/2和小鼠单克隆抗神经元特异性核蛋白（NeuN）（神经元标记，1:200）或小鼠单克隆抗神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）（星形胶质细胞标记，1-200）的混合物在4°C下孵育过夜，然后在室温下在黑暗处用AF488或AF647荧光缀合的第二抗体（1:200；ab 150077或ab169348）的混合液孵育1小时。然后用附着有DP70数码相机的奥林巴斯AX70奥林巴斯显微镜Epi荧光检查染色切片。对于免疫荧光的定量，使用ImageJ软件对积分密度进行定量。海马体和ACC坐标基于Franklin和Paxinos图谱的立体定位板（Franklin and Paxinos，2008）；前-后（AP）坐标指的是脑骨，侧（ML）坐标指中矢状缝合线，腹（DV）坐标指颅骨表面：CA1（AP:-1.70 mm；ML:1.17 mm和DV:1.34 mm），DG（AP:−1.70 mm；ML:0.70 mm和DV:2.04 mm）和ACC（AP:0.14 mm；ML:0.25 mm和DV:10.00 mm）。

动物/疾病模型：小鼠[1]。
剂量：10 或 20 mg/kg。
给药途径：腹腔注射，于注射福尔马林前 24 小时。
实验结果：与注射福尔马林的小鼠相比，在第一阶段和第二阶段，舔舐和啃咬行为均呈剂量依赖性显著减弱。舔舐和啃咬行为显著减少（P < 0.01 或 P < 0.001）。与注射福尔马林的小鼠相比，对被移位物体的偏好显著增加（F3,13 = 28.03，P < 0.01）。与注射福尔马林的小鼠相比，小鼠与移位物体的互动时间显著增加（P < 0.001）。

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福尔马林诱导的伤害性疼痛行为[1]
福尔马林诱导的伤害性疼痛模型采用先前描述的方法（Fisher 和 Coderre，1996；Kim 等，1999），并稍作修改。简而言之，将小鼠置于 15 × 12 × 10 cm 的有机玻璃箱中，每天至少 30 分钟，连续三天，以适应实验环境。在箱子后方以 45° 角放置两面镜子，以便清晰观察小鼠的爪子。在注射福尔马林前 24 小时，小鼠分别接受（载体，腹腔注射）或（LDN-212320，5、10 或 20 mg/kg，腹腔注射）处理。对照组动物接受（载体，10 μl，皮下注射 + LDN-212320 20 mg/kg，腹腔注射）。在拮抗剂研究中，于行为学测试前30分钟腹腔注射DHK（10 mg/kg）（Yang等，2011）。随后，使用30号针头Hamilton微量注射器（美国内华达州里诺市）将10 μl 2.5%福尔马林或10 μl载体皮下注射到小鼠后爪背侧。注射后立即将小鼠放回实验箱，开始观察。对于伤害感受反应，通过测量典型双相疼痛行为早期（0-5分钟）和晚期（10-45分钟）两个阶段中舔舐和啃咬注射爪的总持续时间（秒）来监测。 LDN-212320、头孢曲松或DHK的剂量使用方法如前所述（Rasmussen等，2011；Tallarida等，2013）。
LDN-212320溶解于含1%二甲基亚砜（DMSO）和0.5%吐温80的生理盐水（0.9% NaCl）中。

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动物：**本研究使用雄性C57BL/6J小鼠（体重20-30 g，5-9周龄）。小鼠以4只为一组饲养于标准实验室条件下（22 ± 2°C，湿度50-60%，12小时光照/黑暗循环），自由摄取食物和水。[1]
- **药物制备和给药：**LDN-212320溶解于含1%二甲基亚砜（DMSO）和0.5%吐温80（溶剂）的生理盐水（0.9% NaCl）中。所有药物均以10 ml/kg体重的剂量进行腹腔注射（ip）。 [1]
- **福尔马林诱导的伤害感受：**小鼠在注射福尔马林前24小时分别接受载体或LDN-212320（5、10或20 mg/kg，腹腔注射）处理。在拮抗剂研究中，小鼠在福尔马林试验前30分钟接受DHK（10 mg/kg，腹腔注射）处理。随后，小鼠后爪背侧皮下注射10 μl 2.5%福尔马林或载体。分别在早期（0-5分钟）和晚期（10-45分钟）测量小鼠舔舐和啃咬注射爪的总持续时间。[1]
- **爪水肿测量：**通过足底注射福尔马林（2.5%，10 μl）诱导爪水肿。在注射福尔马林前和注射后60分钟，使用千分尺测量足背-足底厚度。 [1]
- **Y迷宫测试：**小鼠被允许在迷宫中探索15分钟，其中一条臂封闭（新臂）。45分钟后，它们被允许探索所有三条臂5分钟。记录小鼠在新臂停留的时间和进入次数。对于自发交替行为，将小鼠置于所有臂都开放的Y迷宫中5分钟，并计算自发交替行为的百分比。[1]
- **高架十字迷宫（EPM）测试：**每只小鼠被放置在迷宫的中心区域，面向一条开放的臂，并录像5分钟。分析小鼠进入开放臂和封闭臂的次数。[1]
- **物体位置识别测试：**小鼠在带有视觉线索的箱中适应15分钟。在测试当天，将它们放入装有三个相同物体的箱中2分钟，然后取出。清洁实验舱后，将一个物体移至新位置，并将小鼠放回原处。记录小鼠与每个物体互动的时间。[1]
- **蛋白质印迹分析：**处死小鼠后，解剖海马和前扣带回皮层（ACC）。将组织在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中匀浆。测定蛋白质浓度，取等量蛋白质（60 μg）上样至10% SDS-PAGE凝胶，转移至硝酸纤维素膜，并用GLT-1、ERK1/2、pERK1/2或β-微管蛋白的一抗进行孵育，随后用HRP标记的二抗进行孵育。用ECL Prime试剂检测结合的抗体。 [1]
- **免疫组织化学：** 将小鼠安乐死后，取出脑组织，用4%多聚甲醛进行后固定，再用30%蔗糖进行低温保护，然后切片（15 μm厚）。切片经封闭后，与一抗（pERK1/2或GFAP）于4℃孵育过夜。对于双重免疫荧光染色，切片先与兔抗p-ERK1/2抗体和鼠抗NeuN抗体或鼠抗GFAP抗体的混合物孵育，再与荧光标记的二抗孵育。染色后的切片用荧光显微镜观察，并使用ImageJ软件进行积分密度定量分析。[1]

[1]. Effects of glial glutamate transporter activator in formalin-induced pain behaviour in mice. Eur J Pain. 2019 Apr;23(4):765-783.

[2]. Structure-activity relationship study of pyridazine derivatives as glutamate transporter EAAT2 activators. Bioorg Med Chem Lett. 2011 Oct 1;21(19):5774-7.

C17H15N3S

293.386101961136

293.099

C, 61.60; H, 4.68; N, 10.26; O, 15.63; S, 7.83

894002-50-7

7207425

White to gray solid powder

4.139

63.97

0

4

4

21

312

0

N1C(SCC2C(C)=CC=CC=2)=CC=C(C2C=CC=CN=2)N=1

DUUQLWDHNYFUPP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H15N3S/c1-13-6-2-3-7-14(13)12-21-17-10-9-16(19-20-17)15-8-4-5-11-18-15/h2-11H,12H2,1H3

3-[(2-methylphenyl)methylsulfanyl]-6-pyridin-2-ylpyridazine

LDN-0212320 Maleate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~170.42 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。