LDN-0212320

GLT-1 (glutamate transporter); EAAT2 (excitatory amino acid transporter 2)
Activator of astroglial glutamate transporter-1 (GLT-1) [1]

兴奋性氨基酸转运蛋白2 (EAAT2) 是主要的谷氨酸转运蛋白，其功能是将谷氨酸从突触中清除。研究发现，一种硫代哒嗪衍生物能够提高星形胶质细胞中EAAT2蛋白的水平。结构-活性关系研究表明，该分子的几个组成部分，例如硫醚和哒嗪，对于其活性是必需的。对苄基硫醚进行修饰后，得到了几种衍生物（7-13、7-15和7-17），这些衍生物在浓度低于5 μM的情况下，作用24小时后可使EAAT2水平提高6倍以上。此外，其中一种衍生物（7-22；LDN-212320）在作用24小时后，EC50为0.5 μM时，可使EAAT2水平提高3.5-3.9倍[2]。

腹腔注射LDN-212320（10或20 mg/kg）可显著降低福尔马林诱导的伤害性行为[1]。腹腔注射LDN-212320（10或20 mg/kg）可显著恢复福尔马林损伤的海马依赖性行为。此外，LDN-212320（10或20 mg/kg，腹腔注射）可上调前扣带回皮层（ACC）和海马区域的GLT-1表达[1]。福尔马林诱导的ERK磷酸化（一种伤害感受标志物）在ACC和海马区被LDN-212320（20 mg/kg，腹腔注射）显著降低[1]。

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在雄性C57BL/6J小鼠的福尔马林诱导伤害性疼痛模型中，与仅注射福尔马林的小鼠相比，在福尔马林试验前24小时腹腔注射LDN-212320（10或20 mg/kg）可显著减轻福尔马林诱发的舔舐和啃咬行为，且这种减轻呈剂量依赖性。较低剂量5 mg/kg（腹腔注射）则未减轻舔舐和啃咬行为。 [1]
- 在福尔马林试验的两个阶段，选择性GLT-1拮抗剂二氢红藻氨酸（DHK，10 mg/kg，腹腔注射）全身给药均能显著逆转LDN-212320（10或20 mg/kg，腹腔注射）的镇痛作用。[1]
- 与福尔马林注射组小鼠相比，LDN-212320（20 mg/kg，腹腔注射）显著降低了福尔马林诱导的爪水肿。[1]
- 组织学评估显示，福尔马林注射后，LDN-212320（20 mg/kg，腹腔注射）对爪部白细胞浸润无明显影响。 [1] 在Y迷宫测试中，与注射福尔马林的小鼠相比，LDN-212320（20 mg/kg，腹腔注射）显著增加了小鼠在新臂停留的时间和进入新臂的次数，并显著逆转了福尔马林诱导的自发交替行为缺陷。[1] 在物体位置识别测试中，与注射福尔马林的小鼠相比，LDN-212320（10或20 mg/kg，腹腔注射）显著增加了小鼠对被移位物体的偏好。[1] 在高架十字迷宫（EPM）测试中，与注射福尔马林的小鼠相比，LDN-212320（10或20 mg/kg，腹腔注射）显著增加了小鼠进入开放臂的次数，但未显著改变小鼠的运动活性（以进入封闭臂的次数衡量）。 [1]
- Western blot 分析显示，与福尔马林注射小鼠相比，LDN-212320（10 或 20 mg/kg，腹腔注射）显著增加了海马和前扣带回皮层 (ACC) 中 GLT-1 的表达。[1]
- 免疫荧光染色显示，LDN-212320 不改变海马 CA1 区和齿状回 (DG) 区以及 ACC 中胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 的表达，表明星形胶质细胞数量没有变化。[1]
- Western blot 分析表明，LDN-212320（20 mg/kg，腹腔注射）显著逆转了福尔马林诱导的海马和 ACC 中细胞外信号调节激酶 (ERK1/2) 磷酸化水平的升高。 [1] 双重免疫荧光染色显示，LDN-212320 抑制 pERK1/2 表达的作用定位于海马齿状回 (DG)、CA1 区和前扣带回 (ACC) 的神经元（与 NeuN 标记物共定位），而非星形胶质细胞（与 GFAP 标记物共定位）。[1]

首先在PA-EAAT2细胞（一种稳定表达EAAT2 mRNA的原代星形胶质细胞系）中评估化合物1的所有衍生物。将化合物（10 μM）孵育4小时和24小时后，收集细胞并通过Western blot分析测定EAAT2蛋白水平。报告EAAT2蛋白水平相对于DMSO对照组的倍数变化。[2]

Western blot分析[1]
Western blot分析按照先前描述的方法进行（Xu et al., 2006），并稍作修改。简而言之，小鼠经快速断头处死；使用小鼠脑立体定位坐标（Franklin and Paxinos, 2008）从1 mm厚的冠状切片中分离出前扣带回皮层（前囟1.18 mm）和海马（前囟-1.7 mm），并保存于-80 °C直至分析。将组织在改良的RIPA缓冲液中匀浆，该缓冲液含有Dulbecco磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、1% Igepal CA-630和0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）。向RIPA缓冲液中添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，并按照制造商的方案使用。样品经离心（16,000 g，4 °C，20 分钟）后收集上清液。采用二喹啉甲酸法测定蛋白质浓度，以白蛋白为标准。取等量蛋白质（60 μg）上样至 10% SDS-PAGE 凝胶进行电泳。分离后的蛋白质在 4 °C 下以 60 V 电压转移至硝酸纤维素膜上过夜。膜用含 5% 脱脂奶粉的 Tris 缓冲盐溶液（TBST）封闭 1 小时。然后，将膜与 GLT-1（1:1000，兔多克隆抗体）、ERK1/2 和 pERK1/2（1:1000，兔多克隆抗体，Cell Signaling Technology，MA，USA）或 β-微管蛋白（E7，1:5000，小鼠单克隆抗体）的一抗在 4°C 下孵育过夜。孵育后，用 TBST 洗涤膜，然后与适当的辣根过氧化物酶标记的二抗（用封闭缓冲液稀释至 1:5000）孵育。用 ECL Prime 试剂检测结合的抗体，并使用密度分析法进行蛋白质定量。[1]
免疫组织化学[1]
免疫组织化学研究按照先前描述的方法进行（Zhang 等，2018），并稍作修改。简而言之，小鼠通过快速断头处死；取出脑组织后，用4%多聚甲醛固定液在室温下固定过夜。然后将脑组织浸入30%蔗糖（溶于0.1 M磷酸盐缓冲液）中，于4℃进行低温保护，直至脑组织沉入液底。之后，将脑组织包埋于Tissue-Tek OCT包埋剂中，并使用Leica CM1850低温恒温切片机切成15 μm厚的切片。每组随机选取3～5张切片，用5%山羊血清（溶于0.3% Triton X-100的1×磷酸盐缓冲液）在室温下封闭1小时，然后在4℃下与pERK1/2（1:500，兔多克隆抗体）或GFAP（1:500，兔多克隆抗体）孵育过夜。对于双重免疫荧光染色，将切片与兔抗p-ERK1/2抗体和鼠单克隆抗神经元特异性核蛋白（NeuN）（神经元标记物，1:200）或鼠单克隆抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（星形胶质细胞标记物，1:200）的混合物于4℃孵育过夜，随后与AF488或AF647荧光标记的二抗混合物（1:200；ab 150077或ab169348）于室温避光孵育1小时。染色后的切片使用配备DP70数码相机的Olympus AX70荧光显微镜进行观察。免疫荧光定量分析采用ImageJ软件计算积分密度。海马和前扣带回（ACC）的坐标基于Franklin和Paxinos图谱的立体定位图（Franklin和Paxinos，2008）；前后（AP）坐标以颅骨囟为参考点，侧向（ML）坐标以正中矢状缝为参考点，腹侧（DV）坐标以颅骨表面为参考点：CA1（AP：-1.70 mm；ML：1.17 mm；DV：1.34 mm），齿状回（DG）（AP：-1.70 mm；ML：0.70 mm；DV：2.04 mm）和前扣带回（ACC）（AP：0.14 mm；ML：0.25 mm；DV：1.00 mm）。

动物/疾病模型：小鼠[1]。
剂量：10 或 20 mg/kg。
给药途径：腹腔注射，于注射福尔马林前 24 小时。
实验结果：与注射福尔马林的小鼠相比，在第一阶段和第二阶段，舔舐和啃咬行为均呈剂量依赖性显著减弱。舔舐和啃咬行为显著减少（P < 0.01 或 P < 0.001）。与注射福尔马林的小鼠相比，对被移位物体的偏好显著增加（F3,13 = 28.03，P < 0.01）。与注射福尔马林的小鼠相比，小鼠与移位物体的互动时间显著增加（P < 0.001）。

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福尔马林诱导的伤害性疼痛行为[1]
福尔马林诱导的伤害性疼痛模型采用先前描述的方法（Fisher和Coderre，1996；Kim等，1999），并稍作修改。简而言之，将小鼠置于15 × 12 × 10 cm的有机玻璃箱中，每天至少30分钟，连续三天，以适应实验环境。在箱子后方以45°角放置两面镜子，以便清晰地观察小鼠的爪子。在注射福尔马林前24小时，小鼠分别接受（载体，腹腔注射）或（LDN-212320，5、10或20 mg/kg，腹腔注射）处理。对照组动物接受（载体，10 μl，皮下注射 + LDN-212320 20 mg/kg，腹腔注射）。在拮抗剂研究中，于行为学测试前30分钟腹腔注射DHK（10 mg/kg）（Yang等，2011）。随后，使用30号针头Hamilton微量注射器（美国内华达州里诺市）将10 μl 2.5%福尔马林或10 μl载体皮下注射到小鼠后爪背侧。注射后立即将小鼠放回实验箱，开始观察。对于伤害感受反应，通过测量典型双相疼痛行为早期（0-5分钟）和晚期（10-45分钟）两个阶段中舔舐和啃咬注射爪的总持续时间（秒）来监测。 LDN-212320、头孢曲松或DHK的剂量使用方法如前所述（Rasmussen等，2011；Tallarida等，2013）。
LDN-212320溶解于含1%二甲基亚砜（DMSO）和0.5%吐温80的生理盐水（0.9% NaCl）中。

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动物：** 使用雄性C57BL/6J小鼠（体重20-30克，5-9周龄）。小鼠以四只为一组饲养于标准实验室条件下（22±2℃，湿度50-60%，12小时光照/黑暗循环），可自由摄取食物和水。 [1]
- **药物制备和给药：**LDN-212320溶解于含1%二甲基亚砜(DMSO)和0.5%吐温80的生理盐水(0.9% NaCl)中（溶剂）。所有药物均以10 ml/kg体重的剂量腹腔注射(ip)。[1]
- **福尔马林诱导的伤害感受：**小鼠在注射福尔马林前24小时分别接受溶剂或LDN-212320（5、10或20 mg/kg，腹腔注射）处理。在拮抗剂研究中，小鼠在福尔马林试验前30分钟接受DHK（10 mg/kg，腹腔注射）处理。然后，将10 μl 2.5%福尔马林或溶剂皮下注射到小鼠后爪背侧。在早期（0-5分钟）和晚期（10-45分钟）分别测量小鼠舔舐和啃咬注射爪的总持续时间。[1]
- **爪水肿测量：**通过足底注射福尔马林（2.5%，10 μl）诱导爪水肿。在注射福尔马林前和注射后60分钟，使用千分尺测量足背-足底厚度。[1]
- **Y迷宫测试：**将小鼠置于一个封闭臂（新臂）的Y迷宫中探索15分钟。45分钟后，允许小鼠探索所有三个臂5分钟。记录小鼠进入新臂的次数和停留时间。对于自发交替行为，将小鼠置于所有臂均开放的Y迷宫中5分钟，并计算自发交替行为的百分比。 [1]
- **高架十字迷宫 (EPM) 测试：** 将每只小鼠放置在迷宫中心区域，面向开放臂，并录像 5 分钟。分析小鼠进入开放臂和封闭臂的次数。[1]
- **物体位置识别测试：** 将小鼠在带有视觉线索的箱中适应 15 分钟。测试当天，将小鼠放入装有三个相同物体的箱中 2 分钟，然后取出。清洁箱后，将其中一个物体移动到新的位置，并将小鼠放回原处。测量小鼠与每个物体互动的时间。[1]
- **蛋白质印迹分析：** 将小鼠安乐死，并解剖海马和前扣带回皮层 (ACC)。将组织在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 缓冲液中匀浆。测定蛋白质浓度后，取等量蛋白质（60 μg）上样至 10% SDS-PAGE 凝胶，转移至硝酸纤维素膜，并用 GLT-1、ERK1/2、pERK1/2 或 β-微管蛋白的一抗进行孵育，随后用 HRP 标记的二抗进行孵育。结合的抗体用 ECL Prime 试剂检测。[1]
- **免疫组织化学：** 小鼠安乐死后，取脑组织，用 4% 多聚甲醛进行后固定，用 30% 蔗糖进行低温保护，然后切片（15 μm 厚）。切片封闭后，与一抗（pERK1/2 或 GFAP）孵育过夜。对于双重免疫荧光染色，切片与兔抗 p-ERK1/2 抗体和鼠抗 NeuN 抗体或鼠抗 GFAP 抗体的混合物孵育，随后用荧光标记的二抗进行孵育。染色切片用荧光显微镜观察，并使用 ImageJ 软件进行积分密度定量分析。[1]

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动物：使用雄性 C57BL/6J 小鼠（体重 20-30 g，5-9 周龄）。小鼠以四只为一组饲养于标准实验室条件下（22 ± 2°C，湿度 50-60%，12 小时光照/黑暗循环），自由摄取食物和水。[1]
- 药物制备和给药：LDN-212320 溶解于含 1% 二甲基亚砜 (DMSO) 和 0.5% Tween 80（溶剂）的生理盐水（0.9% NaCl）中。所有药物均以 10 ml/kg 体重的剂量腹腔注射 (ip)。 [1]
- 福尔马林诱导的伤害感受：小鼠在注射福尔马林前24小时分别接受赋形剂或LDN-212320（5、10或20 mg/kg，腹腔注射）处理。在拮抗剂研究中，小鼠在福尔马林试验前30分钟接受DHK（10 mg/kg，腹腔注射）处理。随后，小鼠后爪背侧皮下注射10 μl 2.5%福尔马林或赋形剂。分别在早期（0-5分钟）和晚期（10-45分钟）测量小鼠舔舐和啃咬注射爪的总持续时间。[1]
- 爪水肿测量：通过足底注射福尔马林（2.5%，10 μl）诱导爪水肿。在注射福尔马林前和注射后60分钟，使用千分尺测量足背-足底厚度。 [1]
- Y迷宫测试：将小鼠置于一个封闭的迷宫臂中探索15分钟（新臂）。45分钟后，允许小鼠探索所有三个臂5分钟。记录小鼠进入新臂的次数和停留时间。对于自发交替行为，将小鼠置于所有臂都开放的Y迷宫中5分钟，并计算自发交替行为的百分比。[1]
- 高架十字迷宫（EPM）测试：将每只小鼠置于迷宫中心区域，面向一个开放的臂，并录像5分钟。分析小鼠进入开放臂和封闭臂的次数。[1]
- 物体位置识别测试：将小鼠置于带有视觉线索的箱中适应15分钟。测试当天，将小鼠置于装有三个相同物体的箱中2分钟，然后取出。清洁箱后，将其中一个物体移至新位置，并将小鼠放回原处。测量与每个物体互动的时间。[1]
- 蛋白质印迹分析：处死小鼠，解剖海马和前扣带回皮层（ACC）。将组织在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中匀浆。测定蛋白质浓度，取等量蛋白质（60 μg）上样至10% SDS-PAGE凝胶，转移至硝酸纤维素膜，并用GLT-1、ERK1/2、pERK1/2或β-微管蛋白的一抗进行孵育，随后用HRP标记的二抗进行孵育。用ECL Prime试剂检测结合的抗体。[1]
- 免疫组织化学：处死小鼠，将脑组织用4%多聚甲醛固定，在30%蔗糖溶液中进行低温保护，并切片（15 μm厚）。将切片封闭后，与一抗（pERK1/2或GFAP）孵育过夜。对于双重免疫荧光染色，将切片与兔抗p-ERK1/2抗体和鼠抗NeuN抗体或鼠抗GFAP抗体的混合物孵育，随后与荧光标记的二抗孵育。用荧光显微镜观察染色切片，并使用ImageJ软件定量分析积分密度。[1]

LDN-212320（10 或 20 mg/kg，腹腔注射）并未显著改变高架十字迷宫实验中的运动活性，各组间进入封闭臂的次数无差异。[1]
- LDN-212320 不影响海马 CA1 区和齿状回 (DG) 区以及前扣带回 (ACC) 中星形胶质细胞标志物 GFAP 的表达，表明其不会增加星形胶质细胞的数量。[1]

[1]. Effects of glial glutamate transporter activator in formalin-induced pain behaviour in mice. Eur J Pain. 2019 Apr;23(4):765-783.

[2]. Structure-activity relationship study of pyridazine derivatives as glutamate transporter EAAT2 activators. Bioorg Med Chem Lett. 2011 Oct 1;21(19):5774-7.

这是首篇报道潜在 GLT-1 激活剂 LDN-212320 在福尔马林诱导疼痛模型中对海马和前扣带回皮层 (ACC) 发挥作用的报告。[1] 研究表明，LDN-212320 通过上调海马和 ACC 中星形胶质细胞 GLT-1 的表达来抑制伤害性疼痛，从而减少谷氨酸溢出和随后的神经元 pERK1/2 信号传导。因此，像 LDN-212320 这样的 GLT-1 激活剂可能成为治疗伤害性疼痛的一种新型疗法。[1]

C17H15N3S

293.386101961136

293.099

C, 61.60; H, 4.68; N, 10.26; O, 15.63; S, 7.83

894002-50-7

7207425

White to gray solid powder

4.139

63.97

0

4

4

21

312

0

N1C(SCC2C(C)=CC=CC=2)=CC=C(C2C=CC=CN=2)N=1

DUUQLWDHNYFUPP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H15N3S/c1-13-6-2-3-7-14(13)12-21-17-10-9-16(19-20-17)15-8-4-5-11-18-15/h2-11H,12H2,1H3

3-[(2-methylphenyl)methylsulfanyl]-6-pyridin-2-ylpyridazine

LDN-0212320 Maleate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~170.42 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。