LHF-535

Antiviral; Arenavirus envelope glycoprotein
LHF-535 is a small-molecule viral entry inhibitor that targets the arenavirus envelope glycoprotein (GP).Strong antiviral activity is shown by LHF-535 against a variety of hemorrhagic fever arenaviruses. With an IC50 of 0.1-0.3 nM, LHF-535 inhibits Lassa GP-pseudotyped lentivirus[2].

LHF-535是一种小分子病毒进入抑制剂，针对沙粒病毒包膜糖蛋白（GP）。LHF-535对多种出血热沙粒病毒表现出强大的抗病毒活性。 LHF-535 抑制 Lassa GP 假型慢病毒，IC50 为 0.1-0.3 nM[2]。

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使用慢病毒假病毒系统，LHF-535 能强效抑制多种出血热沙粒病毒的包膜糖蛋白（GP）介导的病毒进入。对于大多数拉沙病毒毒株（谱系 II, III, IV），其50%抑制浓度 (IC50) 在 0.10 nM 到 0.33 nM 之间。谱系 I 的 LP 毒株是个例外，其 IC50 为 17 nM [1]。
其他旧世界沙粒病毒显示出不同的敏感性：Mobala (IC50 = 0.96 nM)，Mopeia (0.81 nM)，Gbagroube (0.29 nM)，Menekre (120 nM)。淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 (LCMV) 和 Lujo 病毒的 GP 没有特异性敏感，其 IC50 在微摩尔范围 (3.9-6.8 μM)，与作为对照的疱疹性口炎病毒 (VSV) GP 相似 [1]。
新世界（B支）出血热沙粒病毒对 LHF-535 高度敏感：胡宁病毒 (0.10 nM)，马丘波病毒 (Carvalio: 0.13 nM; Mallele: 0.093 nM)，Tacaribe病毒 (0.13 nM)，瓜纳里托病毒 (IC50 未测定)，萨比亚病毒 (2.0 nM)，查帕雷病毒 (19 nM)。A支病毒 Flexal 和 Pichinde 敏感性较低 (分别为 160 nM 和 2.7 μM) [1]。
拉沙病毒 LP 毒株敏感性降低被定位于 GP2 跨膜结构域的一个 V434I 取代。将回复突变 I434V 引入 LP GP 后，恢复了高敏感性 (IC50 = 0.12 nM)。相反，将 V435I（相当于 V434I）引入高度敏感的 Josiah（谱系 IV）GP 后，降低了对 LHF-535 的敏感性 (IC50 = 25 nM) [1]。
胡宁病毒减毒活疫苗株 Candid#1 在 GP2 中含有一个 F427I 减毒决定簇（类似于拉沙病毒的 V434），在假病毒实验中，与强毒的胡宁病毒 (IC50 = 0.10 nM) 相比，对 LHF-535 高度耐药 (IC50 > 20 μM)。将 F427I 引入胡宁病毒 GP 也消除了敏感性 [1]。
在使用具有复制能力的病毒进行的病毒产量减少实验中，胡宁病毒 (Romero) 毒株对 LHF-535 高度敏感 (IC90 = 9.3 ± 7.1 nM)，而 Candid#1 疫苗株的敏感性显著降低 (IC90 = 3.0 ± 1.5 μM)，相差数百倍。两种毒株对利巴韦林的敏感性相似 [1]。
在 LHF-535 浓度递增的压力下，于 Vero 细胞中对 Tacaribe 病毒进行连续传代，筛选出了对药物敏感性降低的变异株。这些变异株在 GP 上含有氨基酸取代（如 F425L, T434I, F436L/I），其中大多数变异株的 IC50 值与野生型相比增加了 >100 到 >5000 倍 [1]。

LHF-535（3、10 或 30 mg/kg；口服；每日；14 天）显着降低血浆、脾脏和肝脏中的病毒滴度，同时保护小鼠免受致命的塔卡里布病毒攻击。延迟 LHF-535 的第一剂（感染后 1、2 或 3 天注射 LHF-535（10 mg/kg）也会导致存活率增加，这表明 LHF-535 作为小鼠暴露后治疗剂的有效性[2]。

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在使用 AG129 小鼠的致死性 Tacaribe 病毒攻击模型中，从感染前 0.5 小时开始，每日口服给予 LHF-535（10 或 30 mg/kg/天）可提供 100% 的保护，防止死亡，而 3 mg/kg/天 组显示部分保护。溶剂对照组存活率为 0% [1]。
与溶剂处理的小鼠相比，从攻击前 0.5 小时开始使用 LHF-535（10 或 30 mg/kg/天）治疗，显著降低了感染后第 7 天检测到的血浆、脾脏和肝脏中的病毒滴度 [1]。
LHF-535 作为暴露后治疗有效。当每日口服给药（10 mg/kg/天）的开始时间延迟至 Tacaribe 病毒攻击后 24、48 或 72 小时，与溶剂对照组相比，仍然显著提高了存活率 [1]。
大多数在体外筛选出的 LHF-535 耐药 Tacaribe 病毒变异株（如 F425L, T434I, F436L）在体内高度减毒。这些变异株在 AG129 小鼠中的半数致死剂量 (LD50) >2000 空斑形成单位 (PFU)，而野生型亲本病毒的 LD50 <2 PFU [1]。
减毒的耐药变异株 Tacaribe F425L 起到了疫苗的作用。先前感染 F425L 并存活下来的小鼠，在随后受到强毒野生型 Tacaribe 病毒的致死性攻击时，得到了完全保护 [1]。

抗病毒检测[2]
Junín病毒产量减少测定法[2]
进行病毒产量降低（VYR）实验，以确定Junín-Romero野生型和疫苗株对LHF-535的敏感性。在感染前，将不同浓度的LHF-535添加到含有70-80%融合Vero细胞的测试孔中，感染复数（MOI）约为0.002。培养板培养3天，此时将感染病毒的培养板冷冻和解冻，并收集培养上清液用于感染病毒的终点滴定。将样品接种在Vero细胞上，并在感染后第10天测量视觉细胞病变效应。LHF-535针对Candid#1和Romero菌株进行一式三份的测试。接种疫苗的人员在BSL-3+实验室对Junín病毒的致病性Romero株进行了研究。

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Tacaribe病毒抗病毒试验[2]
接种在96孔板中的Vero细胞（每孔5000个细胞）在DMSO中加入一式三份的系列化合物稀释液后，以0.1的MOI感染Tacaribe病毒。3天后，从细胞裂解物（Promega SV 96总RNA分离系统）中提取RNA，通过qRT-PCR和比较CT方法评估Tacaribe病毒的RNA[40]。简言之，提取的RNA用于用高容量RNA-to-cDNA试剂盒（Thermo Fisher Scientific）产生cDNA。对于基于TaqMan的qPCR，使用TaqMan-Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher Scientific）以及引物和双重标记的TaqMan-探针组（靶向GP的约100个核苷酸区域（nt 809–912））对cDNA进行反应。使用赛默飞世尔科学公司的18S rRNA（VIC/MGB探针）作为内部控制。

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假型病毒抑制[2]
将293T细胞接种在不透明的384孔板中（每孔4000个细胞）。第二天，通过HP D300e数字分配器将LHF-535（溶解在DMSO中）和单独的DMSO分配到所有孔中的最终浓度为0.2%的DMSO。随后加入固定体积的慢病毒假病毒粒子，在37°C下孵育3天，并测量萤光素酶活性（Promega Bright Glo萤光素酶测定系统）。试验浓度一式四份。对每种浓度或对照（阳性对照单独接受DMSO，阴性对照模拟感染）的发光进行平均，并使用XLfit计算50%的有效浓度。多次重复实验以建立平均值（几何平均值）EC50；重复实验，直到多个实验的平均值的标准误差小于平均值的四分之一。

细胞和病毒
Vero和293T细胞从美国典型培养物保藏中心（ATCC；Manassas，VA）获得。Vero细胞维持在补充有10%胎牛血清的最低必需培养基（MEM）中（HyClone Thermo Scientific，Logan，UT）。293T细胞维持在补充有10%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、青霉素（100U/ml）和链霉素（100μg/ml）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。Tacaribe病毒株TRVL 11573从ATCC获得。Junín病毒的Candid#1疫苗株由Robert Tesh（德克萨斯州加尔维斯顿得克萨斯大学医学分院新发病毒和虫媒病毒世界参考中心）提供。Candid#1病毒原液（~108PFU/ml）在非洲绿猴肾细胞（来自ATCC的BS-C-1）中传代一次，在Vero细胞中传代两次后，由澄清的裂解物产生。Junín病毒的Romero株的分子克隆由Slobodan Paessler（德克萨斯大学医学分院，德克萨斯州加尔维斯顿）提供。病毒在幼仓鼠肾成纤维细胞（从ATCC获得的BHK-21）中被拯救，并且从Vero细胞中的单个传代制备储备物（~108PFU/ml）。接种疫苗的人员在BSL-3+实验室对Junín病毒的致病性Romero株进行了研究。[2]

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慢病毒假病毒抑制实验： 将异源病毒包膜糖蛋白 (GP) 基因克隆到哺乳动物表达载体中。通过将该 GP 质粒、携带荧光素酶报告基因的慢病毒骨架质粒以及包装质粒共转染 293T 细胞来产生假病毒颗粒。产生的假病毒颗粒用于感染预先铺板在不透明 384 孔板中的 293T 靶细胞。在加入固定体积的假病毒颗粒之前，将 LHF-535 或对照 DMSO 分配至孔中。孵育 3 天后，使用商业荧光素酶检测系统测量荧光素酶活性。计算每个药物浓度的平均发光值，并计算 50% 有效浓度 (EC50)。每个测试浓度进行四重复实验 [1]。
病毒产量减少实验（胡宁病毒）： 将 70-80% 汇合度的 Vero 细胞以低感染复数 (MOI ~0.002) 感染胡宁病毒 (Romero 或 Candid#1 毒株)。在感染前立即向孔中加入不同浓度的 LHF-535。孵育 3 天后，将培养物冻融。收集上清液，在新鲜的 Vero 细胞上进行终点滴定，以确定产生的感染性病毒量。在感染后第 10 天通过肉眼观察细胞病变效应评分。确定使病毒产量减少 90% 所需的化合物浓度 (IC90)。实验进行三重复 [1]。
Tacaribe 病毒抗病毒实验 (qRT-PCR)： 在 96 孔板中铺板的 Vero 细胞，在加入 DMSO 中连续稀释的 LHF-535（三重复）后，以 MOI 0.1 感染 Tacaribe 病毒。孵育 3 天后，从细胞裂解液中提取总 RNA。将提取的 RNA 反转录为 cDNA。使用靶向病毒 GP 基因区域的引物和探针，通过基于 TaqMan 的定量实时荧光 PCR (qRT-PCR) 定量病毒 RNA 水平。使用 18S rRNA 检测作为内参进行归一化。使用比较 Ct 法分析数据 [1]。
耐药变异株筛选： 在 LHF-535 浓度递增的选择压力下（从 1x 到 170x IC50），在 Vero 细胞中对 Tacaribe 病毒进行连续传代。感染后 3-6 天收获病毒，并在 5 倍更高的药物浓度下再次传代。几轮传代后，对最终传代的病毒进行噬斑纯化、扩增，并评估其药物敏感性。对敏感性改变的变异株的 GP 基因进行测序 [1]。

Animal Model: IFN-α/β and-γ receptor-deficient AG129 mice[2]
Dosage: 3, 10, or 30 mg/kg/day
Administration: Orally; daily; 14 days
Result: Effective as a post-exposure therapeutic.

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Tacaribe virus in vivo model[2]
AG129 mice are IFN-α/β and–γ receptor-deficient mice. They were a kind gift from Michael Diamond (Washington University in St. Louis). For Tacaribe virus studies, we used mice that were sex- and age-matched (6–8 weeks old). All animal procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) and were conducted at Kineta in a BSL-2 facility. Experimental groups were sized (as specified in the figure legends) to allow for statistical analysis, and all animals were included in the analysis. All animal experiments were conducted in a non-blinded fashion.
For the LHF-535 dose titration study, mice were sorted into survival and titer arms and challenged by intraperitoneal (i.p.) injection with 200 PFU of Tacaribe virus. In the survival arm, mice were dosed orally with LHF-535 at 3, 10, or 30 mg/kg/day or with vehicle alone for 14 days with the first dose 30 min prior to infection. Micronized LHF-535 was suspended in 0.5% Methocel E15 and 1% Tween 80. The mice were observed for signs of morbidity and mortality. For the titer arm, mice were sacrificed at 7 days post-challenge; plasma, liver, and spleen samples were collected for assaying virus titers.
For the delayed treatment studies, AG129 mice were split into five groups with each receiving LHF-535 30 min prior, and 24, 48, and 72 h post infection along with a vehicle control group. All mice were challenged by i.p. injection with 200 PFU of Tacaribe virus and dosing ceased 14 days post-challenge. The mice were observed for signs of morbidity and mortality and were humanely removed from study if there were clinical observations of inactivity, labored breathing, or excessive weight loss (≥20%).
For the pathogenesis studies (LD50 determination), AG129 mice were infected with wild-type or mutant Tacaribe virus via i.p. injection using 10-fold serial dilutions of virus. The Reed-Muench method was used for LD50 calculations

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Tacaribe Virus Efficacy Study (AG129 Mice): Age- and sex-matched AG129 mice (6-8 weeks old) were challenged intraperitoneally (i.p.) with 200 PFU of Tacaribe virus. For the dose-response study, mice received daily oral doses of micronized LHF-535 suspended in a vehicle of 0.5% Methocel E15 and 1% Tween 80. Dosing at 3, 10, or 30 mg/kg/day (or vehicle alone) began 0.5 hours before challenge and continued for 14 days. Mice were monitored for survival for 21 days. In a parallel cohort, mice were sacrificed at 7 days post-challenge to collect plasma, liver, and spleen for viral titer determination by plaque assay [1].
Post-Exposure Treatment Study (AG129 Mice): Mice were challenged i.p. with 200 PFU of Tacaribe virus. Groups then began receiving daily oral doses of LHF-535 (10 mg/kg, same vehicle) starting at 0.5 hours before, or 24, 48, or 72 hours after infection. Dosing continued for 14 days post-challenge, and survival was monitored [1].
Pathogenicity Study (LD50 Determination): AG129 mice were infected i.p. with 10-fold serial dilutions of wild-type or mutant (drug-resistant) Tacaribe virus. Mice were observed for morbidity and mortality, and the LD50 was calculated using the Reed-Muench method [1].
Vaccination/Challenge Study: Mice were infected i.p. with 2000 PFU of the attenuated LHF-535-resistant variant Tacaribe F425L. Thirty-one days later, these mice and a group of age-matched naïve controls were challenged i.p. with 200 PFU of virulent wild-type Tacaribe virus. Survival was monitored [1].

[1]. Antiviral drugs for treatment of arenavirus infection. WO2013123215A2.

[2]. A potent Lassa virus antiviral targets an arenavirus virulence determinant. PLoS Pathog. 2018 Dec 21;14(12):e1007439.

沙粒病毒是出血热的重要病原体，出血热是一种常致死的疾病，目前尚无获批的抗病毒疗法。拉沙热尤其在西非地区造成高发病率和高死亡率，该地区是拉沙热的流行区。近期尼日利亚爆发的疫情规模更大，地理分布也更加广泛。我们正在开发LHF-535，一种靶向沙粒病毒包膜糖蛋白的小分子病毒入侵抑制剂，作为治疗拉沙热和其他沙粒病毒引起的出血热的候选药物。利用慢病毒假型感染试验，我们发现LHF-535对所有拉沙病毒谱系的病毒包膜糖蛋白均具有亚纳摩尔级的抑制活性，但谱系I的LP毒株的糖蛋白除外，其敏感性比其他毒株低100倍。这种敏感性降低是由包膜糖蛋白GP2亚基跨膜结构域中独特的氨基酸替换V434I介导的。该位置对应于Candid#1的减毒决定簇，Candid#1是一种用于预防阿根廷出血热的活减毒胡宁病毒疫苗株。我们利用病毒产量降低试验确定LHF-535能有效抑制胡宁病毒，但对Candid#1无抑制作用，并且Candid#1的减毒决定簇F427I调控了这种敏感性差异。我们还证明，每日口服10 mg/kg的LHF-535可保护小鼠免受致死剂量的塔卡里贝病毒感染。在经LHF-535处理的Vero细胞中连续传代塔卡里贝病毒，可获得对LHF-535具有耐药性的病毒，并且大多数耐药病毒表现出毒力减弱。这些发现为LHF-535作为一种广谱沙粒病毒入侵抑制剂的临床开发提供了框架，并为监测耐药病毒的出现提供了重要的背景。[2]

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LHF-535是苯并咪唑衍生物ST-193的优化类似物，ST-193最初是为治疗和预防拉沙热和其他沙粒病毒出血热（例如阿根廷出血热、玻利维亚出血热）而开发的[1]。
其作用机制被认为是结合并稳定沙粒病毒糖蛋白复合物的融合前构象，从而抑制病毒膜融合和入侵所需的pH依赖性构象重排[1]。
一项关键发现是，LHF-535敏感性的病毒决定簇与已知的毒力决定簇重叠。 GP2跨膜结构域中的氨基酸替换（例如，Tacaribe中的F425L，类似于Junín Candid#1中的F427I）赋予病毒耐药性，通常会导致体内病毒毒力显著减弱[1]。
这表明，在LHF-535治疗期间耐药病毒的出现可能与病毒致病能力降低有关。这也意味着该药物与减毒活疫苗Candid#1之间的干扰极小[1]。
在本文发表时，LHF-535的人体临床开发正在进行中，一项Ia期试验正在评估其安全性和药代动力学[1]。

C27H28N2O2

412.523427009583

412.22

C, 78.61; H, 6.84; N, 6.79; O, 7.76

1450929-77-7

(E)-LHF-535

71711529

Light yellow to yellow solid powder

5.8

47.3Ų

1

3

6

31

588

0

CC(C)OC1=CC=C(C=C1)N2C=NC3=C2C=CC(=C3)/C=C\C4=CC=C(C=C4)C(C)(C)O

DBNZTRPIBJSUIX-WAYWQWQTSA-N

InChI=1S/C27H28N2O2/c1-19(2)31-24-14-12-23(13-15-24)29-18-28-25-17-21(9-16-26(25)29)6-5-20-7-10-22(11-8-20)27(3,4)30/h5-19,30H,1-4H3/b6-5-

(Z)-2-(4-(2-(1-(4-Isopropoxyphenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-yl)vinyl)phenyl)propan-2-ol

LHF535; LHF 535; LHF-535

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~150 mg/mL (~363.62 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.42 mg/mL (5.87 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 24.2 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.42 mg/mL (5.87 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 24.2 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。