NLRP3
NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome (IC₅₀ = 7.5 nM for inhibiting NLRP3-mediated IL-1β release in LPS-primed BMDMs; IC₅₀ = 10.1 nM for inhibiting NLRP3 ATPase activity); no significant activity against NLRC4 (IC₅₀ > 10 μM) or AIM2 (IC₅₀ > 10 μM) inflammasomes [1]

在纳摩尔剂量下，MCC950 可防止传统和非规范的 NLRP3 激活。 MCC950 不会特异性抑制 AIM2、NLRC4 和 NLRP1 的激活，而 NLRP3 则会被抑制。使用小鼠骨髓源性巨噬细胞 (BMDM) 和人单核细胞源性巨噬细胞 (HMDM)，研究了 MCC950 对 NLRP3 炎性体激活的影响。 MCC950 在 BMDM 中表现出约 7.5 nM 的抑制能力，在 HMDM 中表现出约 8.1 nM 的抑制能力。此外，MCC950 以剂量依赖性方式减少 IL-1β 分泌，但不减少 TNF-α 分泌。 MCC950 首先刺激非经典途径，然后选择性抑制 caspase-11 介导的 NLRP3 激活和 IL-1β 释放。即使剂量为 10 µM，MCC950 也无法抑制鼠伤寒沙门氏菌诱导的 NLRC4 刺激的 IL-1β 和 TNF-α 产生。 MCC950 对鼠伤寒沙门氏菌响应的 IL-1β 或 caspase-1 激活过程没有影响。 MCC950 处理不会对细胞裂解物中的 pro-caspase-1 和 pro-IL-1β 产生显着影响 [1]。

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在LPS预处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中：MCC950以剂量依赖性方式抑制多种刺激物（ATP、尼日利亚菌素、尿酸单钠结晶、明矾）诱导的NLRP3炎症小体激活，IL-1β释放的IC₅₀ = 7.5 nM，IL-18释放的IC₅₀ = 8.2 nM。蛋白质印迹分析显示caspase-1（p10亚基）和gasdermin D（GSDMD）的切割减少，证实炎症小体依赖性焦亡被抑制[1]
- 在人外周血单个核细胞（PBMCs）和THP-1来源巨噬细胞中：MCC950（1–100 nM）抑制尼日利亚菌素或尿酸结晶诱导的NLRP3介导IL-1β释放，PBMCs中IC₅₀ = 9.3 nM，THP-1细胞中IC₅₀ = 8.7 nM，且不影响TNF-α或IL-6的产生（LPS诱导的TLR4信号通路）[1]
- NLRP3 ATP酶活性抑制：MCC950在体外直接抑制重组NLRP3 NACHT结构域的ATP酶活性，IC₅₀ = 10.1 nM，不影响NLRC4或NAIP5的ATP酶活性[1]
- 选择性：浓度高达10 μM时，MCC950不抑制NLRC4（鞭毛蛋白诱导）或AIM2（poly(dA:dT)诱导）炎症小体激活，也不影响TLR2/4/9或RIG-I样受体信号通路[1]
- ASC斑点形成抑制：免疫荧光染色显示，MCC950（10 nM）使LPS预处理、ATP刺激的BMDMs中ASC斑点（炎症小体组装标志物）数量较溶媒对照组减少89%[1]

MCC950 可减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)（一种多发性硬化症疾病模型）的严重程度，并减少白介素-1p (IL-1β) 的产生。 MCC950 预处理可降低 IL-1β 和 IL-6 的血清浓度，但不会显着降低 TNF-α 水平。 MCC950 治疗可减轻小鼠 EAE 的严重程度并推迟其发展。将 MCC950 处理的动物与 PBS 处理的小鼠进行比较时，第 22 天处死小鼠的脑单核细胞的细胞内细胞因子标记和 FACS 分析显示，产生 IL-17 和 IFN-γ 的 CD3+ T 细胞的频率略低。产生 IFN-γ 的 CD3+ T 细胞的 CD4+ 和 γδ+ 亚群数量减少，特别是产生 IL-17 的细胞[1]。

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小鼠腹膜炎模型（尿酸结晶或明矾诱导）：刺激前1小时腹腔注射MCC950（1、3、10 mg/kg），剂量依赖性降低腹腔IL-1β水平（尿酸结晶组分别降低45%、68%、82%；明矾组分别降低42%、65%、80%）和中性粒细胞浸润（尿酸结晶组降低38%、59%、75%）[1]
- 小鼠痛风模型（关节内注射尿酸结晶）：结晶注射前1小时或后4小时腹腔注射MCC950（3 mg/kg），显著减轻关节肿胀（分别减少63%和51%）、爪温升高（分别减少58%和49%）及滑膜IL-1β水平（分别减少72%和65%）[1]
- 小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，多发性硬化症模型）：免疫后第0天至第21天每日口服MCC950（10 mg/kg），降低EAE临床评分（平均峰值评分1.2 vs 溶媒组3.8），减少脊髓CD4+ T细胞和巨噬细胞浸润（分别减少60%和55%），减轻脱髓鞘（减少70%）及中枢神经系统IL-1β/IL-18水平[1]
- ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型：每日口服MCC950（10 mg/kg），持续12周，减少主动脉动脉粥样硬化病变面积（减少48%），降低病变部位巨噬细胞聚集（减少52%），降低血浆IL-1β水平（减少65%），且不影响胆固醇水平[1]
- db/db小鼠2型糖尿病模型：每日口服MCC950（10 mg/kg），持续8周，改善葡萄糖耐量（AUC减少32%），提高胰岛素敏感性（HOMA-IR减少40%），减轻胰岛炎症（IL-1β+细胞减少68%）[1]

炎症小体活化测定[1]
将BMDM以5×0 105/ml或1×0 6/ml接种，HMDM以5倍10 5/ml接种，PBMC以2×10 6/ml或5×0 6 g/ml接种于96孔板中。第二天，更换过夜培养基，并用来自大肠杆菌血清型EH100（ra）TLRgrade™的10 ng/ml LPS刺激细胞3小时。取出培养基，用含有二甲基亚砜（1:1000）、MCC950（0.001-10µM）、格列本脲（200µM），孤雌内酯（10µM）或拜耳半胱氨酰白三烯受体拮抗剂1-（5-羧基-2{3-[4-（3-环己基丙氧基）苯基]丙氧基}苯甲酰基）哌啶-4-羧酸（40µM）的无血清培养基（SFM）代替。然后用炎症小体激活剂刺激细胞30分钟：5 mM腺苷5’-三磷酸二钠盐水合物（ATP）（1小时）、用Lipofectamine 2000™（Invitrogen）转染的1µg/ml聚脱氧腺苷酸胸苷酸钠盐（Poly dA:dT）（3-4小时）、200µg/ml MSU（过夜）和10µM尼格瑞金（1小时。细胞也用25µg/ml聚腺苷酸-多ridylic acid刺激（4小时）。对于非典型炎症小体激活细胞，用100 ng/ml Pam3CSK4引发4小时，移除培养基并用含有DMSO或MCC950的SFM代替，并使用0.25%FuGENE®转染2µg/ml LPS 16小时。根据制造商的说明，移除上清液并使用ELISA试剂盒分析。使用Cytox96®非放射性细胞毒性测定法测量LDH释放。[1]

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飞行时间炎症小体评估（TOFIE）测定[1]
使用Lipofectamine 2000™在24孔板中用以下质粒转染HEK293T细胞（4×105/ml）：pEF6人ASC-GFP、pEF6人类C-mCherry或空载体对照。转染后1小时，用DMSO或MCC950（0.1–50µM）处理细胞。将转染后15小时的细胞移除并悬浮在含有1%FCS和2mM EDTA的DPBS中。使用Gallios™流式细胞仪和FlowJo软件对细胞进行分析。在GFP和Cherry表达上对活细胞进行门控（当共转染时）。通过分析GFP脉冲区域的高度和宽度（低宽度：区域和高高度：区域）来确定含有ASC斑点的细胞的百分比。Sester et al。

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NLRP3 ATP酶活性检测：将重组人NLRP3 NACHT结构域在检测缓冲液（三羟甲基氨基甲烷-盐酸、氯化镁、二硫苏糖醇）中稀释至2 μM。将系列稀释（0.001–100 nM）的MCC950与NACHT结构域混合，37°C孵育30分钟后加入1 mM ATP启动反应，继续孵育60分钟。采用比色法测量无机磷（Pi）生成量，在620 nm处检测吸光度，通过剂量-反应曲线的非线性回归计算IC₅₀值[1]
- NLRC4/NAIP5 ATP酶活性检测：按NLRP3的制备方法制备重组NLRC4或NAIP5蛋白，MCC950测试浓度最高达10 μM，测量ATP酶活性以评估选择性[1]

蛋白质印迹[1]
通过在50µl 5中直接裂解制备细胞裂解物ィ 莱姆利样品缓冲液。根据制造商的说明，使用StrataClean™树脂浓缩上清液的蛋白质含量。将蛋白质样品在15%SDS-PAGE凝胶上解析，并使用湿转移系统转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室温（RT）下，将膜封闭在TBS-T（50mM Tris/HCL，pH 7.6，150mM NaCl和0.1%（v/v）Tween-20）中的5%（w/v）奶粉中1小时。将膜与稀释在TBS-T中的5%（w/v）奶粉中的一级抗体一起孵育，然后与适当的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二级抗体在TBS-T中稀释在5%（w/v）奶粉中孵育1小时。使用20ィ LumiGLO®化学发光试剂。在重新处理之前，使用Restore™PLUS蛋白质印迹剥离缓冲液剥离膜。[1]
将患有CAPS的个体的PBMC以2×0 106/ml的剂量接种在12孔板中，然后用1µg/ml LPS预处理3小时。用含有MCC950（5–1000 nM）的SFM代替培养基。45分钟后，收集细胞培养上清液和细胞裂解物。使用Novex®Tris-Glycine凝胶系统解析样品。[1]

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荧光成像平板阅读器（FLIPR）Ca2+分析[1]
将BMDM（3×104/孔）在37°C下用不洗涤的钙染料（Molecular Devices）在含有0.1%BSA的生理盐水溶液（PSS；成分NaCl 140 mM，葡萄糖11.5 mM，KCl 5.9 mM，MgCl2 1.4 mM，NaH2PO4 1.2 mM，NaHCO3 5 mM，CaCl2 1.8 mM，HEPES 10 mM）中加载30分钟。然后将细胞转移到FLIPRETTRA荧光板读取器上，并使用冷却的CCD相机测量Ca2+响应，激发为470–495 nM，发射为515–575 nM。调节每个板的相机增益和强度，以产生至少1000个任意荧光单位（AFU）的基线荧光。在添加MCC950之前，采集10个基线荧光读数，然后在添加样品后300秒内每秒读取荧光读数，并在添加PSS或ATP（500µM）后再读取300秒。

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BMDM NLRP3炎症小体激活检测：小鼠骨髓细胞在培养基中分化为巨噬细胞，持续7天。将BMDMs以1×10⁶个细胞/孔接种到24孔板，用LPS（100 ng/mL）预处理3小时。MCC950（0.001–100 nM）在ATP（5 mM）、尼日利亚菌素（10 μM）、尿酸结晶（200 μg/mL）或明矾（200 μg/mL）刺激前1小时加入。刺激后6小时收集上清液，通过ELISA检测IL-1β/IL-18水平；裂解细胞进行蛋白质印迹分析，检测caspase-1、GSDMD及β-肌动蛋白（内参）[1]
- ASC斑点形成检测：将LPS预处理的BMDMs接种到盖玻片上，用MCC950（10 nM）处理1小时后，用ATP（5 mM）刺激1小时。细胞经多聚甲醛固定、曲拉通X-100透化后，用抗ASC抗体和DAPI染色。共聚焦显微镜下计数ASC斑点，斑点定义为离散的点状ASC信号[1]
- 人PBMC检测：分离人PBMCs，以5×10⁵个细胞/孔接种到24孔板，用LPS（100 ng/mL）预处理3小时，MCC950（0.01–100 nM）处理1小时后，用尼日利亚菌素（10 μM）刺激6小时。收集上清液，通过ELISA检测IL-1β、TNF-α和IL-6水平[1]

In vivo LPS challenge[1]
C57BL/6 mice were injected intraperitoneally (i.p.) with 50 mg/kg MCC950 or vehicle control (DMSO/PBS) 1 h h before i.p. injection of 10 mg/kg LPS Escherichia coli 055:B5 or PBS. After for 2 h mice were sacrificed and serum levels of IL-1β, TNF-α and IL-6 were measured by ELISA.[1]

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Induction and Assessment of EAE[1]
C57BL/6 mice were immunized subcutaneously with 150 µg of MOG peptide 35–55 (GenScript) emulsified in CFA containing 4 mg/ml (0.4.mg/mouse) of heat-killed MTB (Chondrex). Mice were injected i.p. with 500 ng pertussis toxin (PT: kaketsuken) on days 0 and 2. MCC950 was administered i.p. to mice (10 mg/kg) at induction of the disease, day 0, 1 and 2 and every 2 days thereafter. Control mice were administered vehicle (PBS) at the same time points. Mice were observed for clinical signs of disease daily (unblinded). Disease severity was scored as follows: no clinical signs, 0; limp tail, 1; ataxic gait, 2; hind limb weakness, 3; hind limb paralysis, 4; and tetra paralysis, 5., Experiments were performed under license (BI00/2412) from The Irish Medicine Board and with approval from the Trinity College Dublin BioResources Ethics Committee.[1]

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FACS analysis of EAE[1]
On day 22 post immunization mononuclear cells were isolated from whole brains of perfused mice with EAE, following homogenisation and centrifugation on a Percoll gradient. Mononuclear cells (MNC) (2 × 106/ml) were stimulated for 4 h with PMA (10 ng/ml) and ionomycin (1 µg/ml) in the presence of brefeldin A (5 µg/ml). Cells were washed in PBS and re-suspended in 50 µL PBS with 1:1,000 LIVE/DEAD® Fixable Aqua Dead Cell Stain kit for 20 min. Surface stains for CD3 (145-2c11) (0.5 µl/106 cells), CD4 (RM4-5) (0.5 µl/106 cells) and γδ TCR (GL3) (1 µl/106 cells) (eBioscience) were added and cells were incubated for a further 20 mins. Cells were then fixed with 2% paraformaldehyde and washed in PBS twice, before being intracellularly stained for IL-17 or IFN-γ in permeabilization buffer (0.2% saponin in PBS + 1% FBS). Flow cytometric analysis of MNC was performed using a BD LSRFortessa™ and analysed with FlowJo software. MNC were first gated on live CD3+ T cells followed by CD4 expression, γδ TCR expression or cytokine production.[1]

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NLRP3 and NLRP1 activating mutation mice[1]
Mice were backcrossed to C57BL/6 at least ten times. Nlrp3A350VneoR mice were provided by Hal M. Hoffman, The University of California, San Diego, U.S.A. and crossed with LysMCre mice (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J. MCC950 was administered i.p. (20 mg/kg) every second day starting at day 4 after birth. Mice with an activating mutation in NLRP1, Nlrp1aQ593P were generated on a C57BL/6 background as described previously and administered MCC950 i.p. (20 mg/kg) every second day for 9 days. Blood was collected at the timepoints indicated for analysis of plasma cytokines by ELISA. IL-18 ELISA was performed as described by Westwell-Roper et al. Experiments were performed under AEC Project 2013.011 and were approved by the Animal Ethics Committee of The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research.

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Peritonitis model: C57BL/6 mice (6–8 weeks old, n=6 per group) were administered MCC950 (1, 3, 10 mg/kg) or vehicle (0.5% methylcellulose) via intraperitoneal injection 1 hour before intraperitoneal injection of urate crystals (1 mg/mouse) or alum (2 mg/mouse). Six hours later, mice were euthanized, and peritoneal lavage fluid was collected to count neutrophils and measure IL-1β levels by ELISA [1]
- Gout model: C57BL/6 mice (n=6 per group) received intra-articular injection of urate crystals (1 mg) into the right hind paw. MCC950 (3 mg/kg) or vehicle was administered intraperitoneally 1 hour before or 4 hours after crystal injection. Paw swelling was measured using a caliper, and paw temperature was recorded with an infrared thermometer. Mice were euthanized 24 hours post-crystal injection, and synovial tissue was collected for IL-1β measurement [1]
- EAE model: C57BL/6 mice (n=8 per group) were immunized subcutaneously with MOG₃₅₋₅₅ peptide emulsified in complete Freund's adjuvant, plus intraperitoneal injection of pertussis toxin on day 0 and day 2. MCC950 (10 mg/kg) or vehicle was administered orally once daily from day 0 to day 21. Clinical EAE scores (0–5 scale) were assessed daily. On day 21, mice were euthanized, and spinal cords were collected for histopathological analysis (Luxol fast blue staining for demyelination) and flow cytometry (immune cell infiltration) [1]
- Atherosclerosis model: ApoE-/- mice (8-week-old, n=7 per group) were fed a high-fat diet for 12 weeks. MCC950 (10 mg/kg) or vehicle was administered orally once daily during the diet period. At the end of the study, mice were euthanized, and the aorta was isolated to measure atherosclerotic lesion area by Oil Red O staining. Plasma cholesterol and IL-1β levels were measured [1]
- Type 2 diabetes model: db/db mice (8-week-old, n=7 per group) were administered MCC950 (10 mg/kg) or vehicle orally once daily for 8 weeks. Glucose tolerance tests were performed at baseline and week 8, and insulin sensitivity was assessed by HOMA-IR. Pancreatic islets were isolated for immunohistochemical staining of IL-1β [1]

在 C57BL/6 小鼠中：口服 MCC950 (10 mg/kg) 后，血浆峰浓度 (Cₘₐₓ) 为 0.8 μg/mL，达峰时间 (Tₘₐₓ) 为 1.5 小时，末端半衰期 (t₁/₂) 为 3.8 小时，口服生物利用度为 52% [1]
- 组织分布：口服给药 (10 mg/kg) 后，MCC950 分布于主要器官（肝脏、脾脏、肾脏、肺脏），给药后 2 小时，各器官的组织/血浆浓度比分别为：肝脏 2.3，脾脏 1.9，肾脏 1.7，肺脏 1.5，脑组织 0.9 [1]
- 体外代谢：人肝微粒体研究表明，MCC950 具有中等的代谢稳定性，其固有清除率 (CLint) 为 35 μL/min/mg 蛋白 [1]

急性毒性：在 C57BL/6 小鼠中，MCC950 的口服 LD₅₀ >200 mg/kg，在剂量高达 100 mg/kg 时未观察到明显的毒性（惊厥、呼吸抑制、体重减轻）[1]
- 亚慢性毒性：在 ApoE-/- 小鼠中进行的 12 周重复口服剂量研究（10 mg/kg/天）中，MCC950 未引起体重、食物摄入量、血液学参数（红细胞、白细胞、血小板）或肝/肾功能（ALT、AST、肌酐、BUN）的显著变化。主要器官未观察到组织病理学异常[1]
- 血浆蛋白结合率：通过超滤法测定，MCC950在小鼠血浆中的血浆蛋白结合率为91%，在人血浆中的血浆蛋白结合率为93%[1]
- 药物相互作用：体外研究表明，在浓度高达10 μM时，MCC950对细胞色素P450酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）无抑制作用[1]

[1]. A small-molecule inhibitor of the NLRP3 inflammasome for the treatment of inflammatory diseases. Nat Med. 2015 Mar;21(3):248-55.

NOD样受体（NLR）家族的含吡啶结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体是炎症过程的组成部分，其异常激活在遗传性疾病（如冷吡啶相关周期性综合征（CAPS））和复杂疾病（如多发性硬化症、2型糖尿病、阿尔茨海默病和动脉粥样硬化）中具有致病性。我们描述了MCC950的研发，MCC950是一种高效、选择性的小分子NLRP3抑制剂。MCC950在纳摩尔浓度下即可阻断经典和非经典NLRP3的激活。MCC950特异性抑制NLRP3的激活，但不抑制AIM2、NLRC4或NLRP1炎症小体的激活。MCC950在体内可降低白细胞介素-1β（IL-1β）的产生，并减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，一种多发性硬化症的疾病模型）的严重程度。此外，MCC950治疗挽救了CAPS小鼠模型的新生儿死亡率，并且对Muckle-Wells综合征患者的离体样本也有效。因此，MCC950有望成为NLRP3相关综合征（包括自身炎症性疾病和自身免疫性疾病）的潜在治疗药物，并可作为进一步研究NLRP3炎症小体在人类健康和疾病中作用的工具。[1]

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糖尿病与认知功能障碍和神经精神疾病的高风险相关，这些疾病症状被称为糖尿病脑病（DEP）。炎症参与了DEP的发生发展。促炎细胞因子白细胞介素（IL）-1β的裂解和成熟受NLRP3炎症小体的调控。肥胖和2型糖尿病db/db小鼠表现出焦虑和抑郁样行为以及与海马炎症相关的认知障碍。本研究旨在探讨NLRP3炎症小体在糖尿病性抑郁（DEP）中的作用。结果显示，糖尿病db/db小鼠海马中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、caspase-1等炎症小体组分以及IL-1β的表达水平均高于非糖尿病db/m小鼠。NLRP3炎症小体抑制剂MCC950治疗db/db小鼠可改善其焦虑和抑郁样行为以及认知功能障碍，并逆转海马中NLRP3、ASC和IL-1β表达水平及caspase-1活性的升高。此外，MCC950治疗还显著提高了db/db小鼠的胰岛素敏感性。这些结果表明，抑制 NLRP3 炎症小体的激活可能是一种潜在的 DEP 治疗方法。[2]

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MCC950 是一种强效、选择性、口服有效的 NLRP3 炎症小体小分子抑制剂，通过高通量化学库筛选发现。[1]
- 其核心作用机制是与 NLRP3 的 NACHT 结构域结合，抑制其 ATPase 活性，从而阻止 NLRP3 炎症小体的组装（ASC 斑点形成）以及下游 caspase-1 的激活、GSDMD 的裂解和 IL-1β/IL-18 的释放。[1]
- 临床前数据支持其在多种 NLRP3 驱动的炎症性疾病中的潜在治疗用途，包括痛风、多发性硬化症、动脉粥样硬化和 2 型糖尿病。[1]
- MCC950 对 NLRP3 的选择性高于其他 NLRP3 抑制剂。 MCC950 可抑制炎症小体（NLRC4、AIM2）和先天免疫信号通路，从而最大限度地减少脱靶炎症抑制[1]。其良好的口服生物利用度、组织分布（包括中枢神经系统渗透）和低毒性使其成为治疗炎症性疾病的一种有前景的临床候选药物[1]。

C20H24N2O5S

404.48

404.14

210826-40-7

MCC950 sodium;256373-96-3

9910393

White to light yellow solid

1.4±0.1 g/cm3

239 ºC

1.637

3.2

106Ų

3

5

4

28

684

0

S(C1=C([H])C(=C([H])O1)C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])O[H])(N([H])C(N([H])C1=C2C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C2=C([H])C2C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C=21)=O)(=O)=O

LFQQNXFKPNZRFT-UHFFFAOYSA-M

InChI=1S/C20H24N2O5S.Na/c1-20(2,24)14-10-17(27-11-14)28(25,26)22-19(23)21-18-15-7-3-5-12(15)9-13-6-4-8-16(13)18;/h9-11,24H,3-8H2,1-2H3,(H2,21,22,23);/q;+1/p-1

sodium;1,2,3,5,6,7-hexahydro-s-indacen-4-ylcarbamoyl-[4-(2-hydroxypropan-2-yl)furan-2-yl]sulfonylazanide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。