NLRP3
NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome (IC₅₀ = 7.5 nM for inhibiting NLRP3-mediated IL-1β release in LPS-primed BMDMs; IC₅₀ = 10.1 nM for inhibiting NLRP3 ATPase activity); no significant activity against NLRC4 (IC₅₀ > 10 μM) or AIM2 (IC₅₀ > 10 μM) inflammasomes [1]

在纳摩尔剂量下，MCC950 可防止传统和非规范的 NLRP3 激活。 MCC950 不会特异性抑制 AIM2、NLRC4 和 NLRP1 的激活，而 NLRP3 则会被抑制。使用小鼠骨髓源性巨噬细胞 (BMDM) 和人单核细胞源性巨噬细胞 (HMDM)，研究了 MCC950 对 NLRP3 炎性体激活的影响。 MCC950 在 BMDM 中表现出约 7.5 nM 的抑制能力，在 HMDM 中表现出约 8.1 nM 的抑制能力。此外，MCC950 以剂量依赖性方式减少 IL-1β 分泌，但不减少 TNF-α 分泌。 MCC950 首先刺激非经典途径，然后选择性抑制 caspase-11 介导的 NLRP3 激活和 IL-1β 释放。即使剂量为 10 µM，MCC950 也无法抑制鼠伤寒沙门氏菌诱导的 NLRC4 刺激的 IL-1β 和 TNF-α 产生。 MCC950 对鼠伤寒沙门氏菌响应的 IL-1β 或 caspase-1 激活过程没有影响。 MCC950 处理不会对细胞裂解物中的 pro-caspase-1 和 pro-IL-1β 产生显着影响 [1]。

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在LPS预处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中：MCC950以剂量依赖性方式抑制多种刺激物（ATP、尼日利亚菌素、尿酸单钠结晶、明矾）诱导的NLRP3炎症小体激活，IL-1β释放的IC₅₀ = 7.5 nM，IL-18释放的IC₅₀ = 8.2 nM。蛋白质印迹分析显示caspase-1（p10亚基）和gasdermin D（GSDMD）的切割减少，证实炎症小体依赖性焦亡被抑制[1]
- 在人外周血单个核细胞（PBMCs）和THP-1来源巨噬细胞中：MCC950（1–100 nM）抑制尼日利亚菌素或尿酸结晶诱导的NLRP3介导IL-1β释放，PBMCs中IC₅₀ = 9.3 nM，THP-1细胞中IC₅₀ = 8.7 nM，且不影响TNF-α或IL-6的产生（LPS诱导的TLR4信号通路）[1]
- NLRP3 ATP酶活性抑制：MCC950在体外直接抑制重组NLRP3 NACHT结构域的ATP酶活性，IC₅₀ = 10.1 nM，不影响NLRC4或NAIP5的ATP酶活性[1]
- 选择性：浓度高达10 μM时，MCC950不抑制NLRC4（鞭毛蛋白诱导）或AIM2（poly(dA:dT)诱导）炎症小体激活，也不影响TLR2/4/9或RIG-I样受体信号通路[1]
- ASC斑点形成抑制：免疫荧光染色显示，MCC950（10 nM）使LPS预处理、ATP刺激的BMDMs中ASC斑点（炎症小体组装标志物）数量较溶媒对照组减少89%[1]

MCC950 可减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)（一种多发性硬化症疾病模型）的严重程度，并减少白介素-1p (IL-1β) 的产生。 MCC950 预处理可降低 IL-1β 和 IL-6 的血清浓度，但不会显着降低 TNF-α 水平。 MCC950 治疗可减轻小鼠 EAE 的严重程度并推迟其发展。将 MCC950 处理的动物与 PBS 处理的小鼠进行比较时，第 22 天处死小鼠的脑单核细胞的细胞内细胞因子标记和 FACS 分析显示，产生 IL-17 和 IFN-γ 的 CD3+ T 细胞的频率略低。产生 IFN-γ 的 CD3+ T 细胞的 CD4+ 和 γδ+ 亚群数量减少，特别是产生 IL-17 的细胞[1]。

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小鼠腹膜炎模型（尿酸结晶或明矾诱导）：刺激前1小时腹腔注射MCC950（1、3、10 mg/kg），剂量依赖性降低腹腔IL-1β水平（尿酸结晶组分别降低45%、68%、82%；明矾组分别降低42%、65%、80%）和中性粒细胞浸润（尿酸结晶组降低38%、59%、75%）[1]
- 小鼠痛风模型（关节内注射尿酸结晶）：结晶注射前1小时或后4小时腹腔注射MCC950（3 mg/kg），显著减轻关节肿胀（分别减少63%和51%）、爪温升高（分别减少58%和49%）及滑膜IL-1β水平（分别减少72%和65%）[1]
- 小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，多发性硬化症模型）：免疫后第0天至第21天每日口服MCC950（10 mg/kg），降低EAE临床评分（平均峰值评分1.2 vs 溶媒组3.8），减少脊髓CD4+ T细胞和巨噬细胞浸润（分别减少60%和55%），减轻脱髓鞘（减少70%）及中枢神经系统IL-1β/IL-18水平[1]
- ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型：每日口服MCC950（10 mg/kg），持续12周，减少主动脉动脉粥样硬化病变面积（减少48%），降低病变部位巨噬细胞聚集（减少52%），降低血浆IL-1β水平（减少65%），且不影响胆固醇水平[1]
- db/db小鼠2型糖尿病模型：每日口服MCC950（10 mg/kg），持续8周，改善葡萄糖耐量（AUC减少32%），提高胰岛素敏感性（HOMA-IR减少40%），减轻胰岛炎症（IL-1β+细胞减少68%）[1]

炎症小体活化测定[1]
将BMDM以5×0 105/ml或1×0 6/ml接种，HMDM以5倍10 5/ml接种，PBMC以2×10 6/ml或5×0 6 g/ml接种于96孔板中。第二天，更换过夜培养基，并用来自大肠杆菌血清型EH100（ra）TLRgrade™的10 ng/ml LPS刺激细胞3小时。取出培养基，用含有二甲基亚砜（1:1000）、MCC950（0.001-10µM）、格列本脲（200µM），孤雌内酯（10µM）或拜耳半胱氨酰白三烯受体拮抗剂1-（5-羧基-2{3-[4-（3-环己基丙氧基）苯基]丙氧基}苯甲酰基）哌啶-4-羧酸（40µM）的无血清培养基（SFM）代替。然后用炎症小体激活剂刺激细胞30分钟：5 mM腺苷5’-三磷酸二钠盐水合物（ATP）（1小时）、用Lipofectamine 2000™（Invitrogen）转染的1µg/ml聚脱氧腺苷酸胸苷酸钠盐（Poly dA:dT）（3-4小时）、200µg/ml MSU（过夜）和10µM尼格瑞金（1小时。细胞也用25µg/ml聚腺苷酸-多ridylic acid刺激（4小时）。对于非典型炎症小体激活细胞，用100 ng/ml Pam3CSK4引发4小时，移除培养基并用含有DMSO或MCC950的SFM代替，并使用0.25%FuGENE®转染2µg/ml LPS 16小时。根据制造商的说明，移除上清液并使用ELISA试剂盒分析。使用Cytox96®非放射性细胞毒性测定法测量LDH释放。[1]

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飞行时间炎症小体评估（TOFIE）测定[1]
使用Lipofectamine 2000™在24孔板中用以下质粒转染HEK293T细胞（4×105/ml）：pEF6人ASC-GFP、pEF6人类C-mCherry或空载体对照。转染后1小时，用DMSO或MCC950（0.1–50µM）处理细胞。将转染后15小时的细胞移除并悬浮在含有1%FCS和2mM EDTA的DPBS中。使用Gallios™流式细胞仪和FlowJo软件对细胞进行分析。在GFP和Cherry表达上对活细胞进行门控（当共转染时）。通过分析GFP脉冲区域的高度和宽度（低宽度：区域和高高度：区域）来确定含有ASC斑点的细胞的百分比。Sester et al。

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NLRP3 ATP酶活性检测：将重组人NLRP3 NACHT结构域在检测缓冲液（三羟甲基氨基甲烷-盐酸、氯化镁、二硫苏糖醇）中稀释至2 μM。将系列稀释（0.001–100 nM）的MCC950与NACHT结构域混合，37°C孵育30分钟后加入1 mM ATP启动反应，继续孵育60分钟。采用比色法测量无机磷（Pi）生成量，在620 nm处检测吸光度，通过剂量-反应曲线的非线性回归计算IC₅₀值[1]
- NLRC4/NAIP5 ATP酶活性检测：按NLRP3的制备方法制备重组NLRC4或NAIP5蛋白，MCC950测试浓度最高达10 μM，测量ATP酶活性以评估选择性[1]

蛋白质印迹[1]
通过在50µl 5中直接裂解制备细胞裂解物ィ 莱姆利样品缓冲液。根据制造商的说明，使用StrataClean™树脂浓缩上清液的蛋白质含量。将蛋白质样品在15%SDS-PAGE凝胶上解析，并使用湿转移系统转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室温（RT）下，将膜封闭在TBS-T（50mM Tris/HCL，pH 7.6，150mM NaCl和0.1%（v/v）Tween-20）中的5%（w/v）奶粉中1小时。将膜与稀释在TBS-T中的5%（w/v）奶粉中的一级抗体一起孵育，然后与适当的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二级抗体在TBS-T中稀释在5%（w/v）奶粉中孵育1小时。使用20ィ LumiGLO®化学发光试剂。在重新处理之前，使用Restore™PLUS蛋白质印迹剥离缓冲液剥离膜。[1]
将患有CAPS的个体的PBMC以2×0 106/ml的剂量接种在12孔板中，然后用1µg/ml LPS预处理3小时。用含有MCC950（5–1000 nM）的SFM代替培养基。45分钟后，收集细胞培养上清液和细胞裂解物。使用Novex®Tris-Glycine凝胶系统解析样品。[1]

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荧光成像平板阅读器（FLIPR）Ca2+分析[1]
将BMDM（3×104/孔）在37°C下用不洗涤的钙染料（Molecular Devices）在含有0.1%BSA的生理盐水溶液（PSS；成分NaCl 140 mM，葡萄糖11.5 mM，KCl 5.9 mM，MgCl2 1.4 mM，NaH2PO4 1.2 mM，NaHCO3 5 mM，CaCl2 1.8 mM，HEPES 10 mM）中加载30分钟。然后将细胞转移到FLIPRETTRA荧光板读取器上，并使用冷却的CCD相机测量Ca2+响应，激发为470–495 nM，发射为515–575 nM。调节每个板的相机增益和强度，以产生至少1000个任意荧光单位（AFU）的基线荧光。在添加MCC950之前，采集10个基线荧光读数，然后在添加样品后300秒内每秒读取荧光读数，并在添加PSS或ATP（500µM）后再读取300秒。

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BMDM NLRP3炎症小体激活检测：小鼠骨髓细胞在培养基中分化为巨噬细胞，持续7天。将BMDMs以1×10⁶个细胞/孔接种到24孔板，用LPS（100 ng/mL）预处理3小时。MCC950（0.001–100 nM）在ATP（5 mM）、尼日利亚菌素（10 μM）、尿酸结晶（200 μg/mL）或明矾（200 μg/mL）刺激前1小时加入。刺激后6小时收集上清液，通过ELISA检测IL-1β/IL-18水平；裂解细胞进行蛋白质印迹分析，检测caspase-1、GSDMD及β-肌动蛋白（内参）[1]
- ASC斑点形成检测：将LPS预处理的BMDMs接种到盖玻片上，用MCC950（10 nM）处理1小时后，用ATP（5 mM）刺激1小时。细胞经多聚甲醛固定、曲拉通X-100透化后，用抗ASC抗体和DAPI染色。共聚焦显微镜下计数ASC斑点，斑点定义为离散的点状ASC信号[1]
- 人PBMC检测：分离人PBMCs，以5×10⁵个细胞/孔接种到24孔板，用LPS（100 ng/mL）预处理3小时，MCC950（0.01–100 nM）处理1小时后，用尼日利亚菌素（10 μM）刺激6小时。收集上清液，通过ELISA检测IL-1β、TNF-α和IL-6水平[1]

体内LPS攻击[1]
C57BL/6小鼠腹腔注射50 mg/kg MCC950或载体对照（DMSO/PBS），1小时后腹腔注射10 mg/kg LPS大肠杆菌O55:B5或PBS。2小时后处死小鼠，采用ELISA法检测血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的水平。[1]

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EAE的诱导和评估[1]
C57BL/6小鼠皮下注射150 µg MOG肽35-55（GenScript），该肽乳化于含有4 mg/ml（0.4 mg/只）热灭活结核分枝杆菌（Chondrex）的完全弗氏佐剂（CFA）中。小鼠于第0天和第2天腹腔注射500 ng百日咳毒素（PT：百日咳杆菌）。在疾病诱导时、第0天、第1天和第2天以及之后每2天腹腔注射MCC950（10 mg/kg）。对照组小鼠在相同时间点注射载体（PBS）。每日观察小鼠的临床症状（非盲法）。疾病严重程度评分如下：无临床症状，0分；尾巴无力，1分；共济失调步态，2分；后肢无力，3分；后肢瘫痪，4分；四肢瘫痪，5分。实验已获得爱尔兰药品管理局的许可（BI00/2412）和都柏林圣三一学院生物资源伦理委员会的批准。[1]

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EAE 的 FACS 分析[1]
免疫后第 22 天，将灌注 EAE 小鼠的全脑组织匀浆后，经 Percoll 梯度离心分离，得到单核细胞。将单核细胞 (MNC) (2 × 10⁶/ml) 在布雷菲德菌素 A (5 µg/ml) 存在下，用 PMA (10 ng/ml) 和离子霉素 (1 µg/ml) 刺激 4 小时。用 PBS 洗涤细胞，并重悬于 50 µL PBS 中，加入 1:1000 的 LIVE/DEAD® Fixable Aqua 死细胞染色试剂盒，孵育 20 分钟。加入 CD3 (145-2c11) (0.5 µl/10⁶ 个细胞)、CD4 (RM4-5) (0.5 µl/10⁶ 个细胞) 和 γδ TCR (GL3) (1 µl/10⁶ 个细胞) (eBioscience) 的表面染色剂，细胞继续孵育 20 分钟。然后用 2% 多聚甲醛固定细胞，并用 PBS 洗涤两次，之后在透化缓冲液（0.2% 皂苷 PBS + 1% FBS）中进行 IL-17 或 IFN-γ 的胞内染色。使用 BD LSRFortessa™ 流式细胞仪进行 MNC 的流式细胞术分析，并使用 FlowJo 软件进行数据分析。首先对 MNC 进行设门，筛选出活的 CD3⁺ T 细胞，然后根据 CD4 表达、γδ TCR 表达或细胞因子产生情况进行设门。[1]

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NLRP3 和 NLRP1 激活突变小鼠[1]
小鼠已回交至 C57BL/6 至少 10 次。 Nlrp3A350VneoR小鼠由美国加州大学圣地亚哥分校的Hal M. Hoffman提供，并与LysMCre小鼠（B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J）杂交。从出生后第4天开始，每隔一天腹腔注射MCC950（20 mg/kg）。NLRP1激活突变小鼠（Nlrp1aQ593P）的构建方法如前所述，在C57BL/6背景下进行，并每隔一天腹腔注射MCC950（20 mg/kg），持续9天。在指定时间点采集血液，用于通过ELISA分析血浆细胞因子。IL-18 ELISA的检测方法参照Westwell-Roper等人的描述。所有实验均在AEC项目2013.011下进行，并已获得沃尔特和伊丽莎·霍尔医学研究所动物伦理委员会的批准。研究.

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腹膜炎模型：C57BL/6小鼠（6-8周龄，每组n=6）在腹腔注射尿酸盐晶体（1 mg/只）或明矾（2 mg/只）前1小时，腹腔注射MCC950（1、3、10 mg/kg）或载体（0.5%甲基纤维素）。6小时后，处死小鼠，收集腹腔灌洗液，通过ELISA法计数中性粒细胞并检测IL-1β水平[1]。
痛风模型：C57BL/6小鼠（每组n=6）右后爪关节内注射尿酸盐晶体（1 mg）。在晶体注射前1小时或注射后4小时，腹腔注射MCC950（3 mg/kg）或载体。使用以下方法测量爪肿胀：使用游标卡尺测量小鼠爪周长，并用红外测温仪记录爪温。注射晶体24小时后处死小鼠，收集滑膜组织用于IL-1β测定[1]
- EAE模型：C57BL/6小鼠（每组n=8）皮下注射乳化于弗氏完全佐剂中的MOG₃₅₋₅₅肽，并在第0天和第2天腹腔注射百日咳毒素。从第0天到第21天，每天口服一次MCC950（10 mg/kg）或载体。每日评估EAE临床评分（0-5分）。第21天处死小鼠，收集脊髓进行组织病理学分析（卢克索尔快蓝染色检测脱髓鞘）和流式细胞术分析（免疫细胞浸润）。 [1]
- 动脉粥样硬化模型：ApoE-/- 小鼠（8 周龄，每组 n=7）喂食高脂饮食 12 周。在饮食期间，每日一次口服给予 MCC950（10 mg/kg）或载体。研究结束时，处死小鼠，分离主动脉，通过油红 O 染色测量动脉粥样硬化病变面积。检测血浆胆固醇和 IL-1β 水平。[1]
- 2 型糖尿病模型：db/db 小鼠（8 周龄，每组 n=7）每日一次口服给予 MCC950（10 mg/kg）或载体，持续 8 周。在基线和第 8 周进行葡萄糖耐量试验，并通过 HOMA-IR 评估胰岛素敏感性。分离胰岛进行免疫组织化学染色。 IL-1β [1]

在 C57BL/6 小鼠中：口服 MCC950 (10 mg/kg) 后，血浆峰浓度 (Cₘₐₓ) 为 0.8 μg/mL，达峰时间 (Tₘₐₓ) 为 1.5 小时，末端半衰期 (t₁/₂) 为 3.8 小时，口服生物利用度为 52% [1]
- 组织分布：口服给药 (10 mg/kg) 后，MCC950 分布于主要器官（肝脏、脾脏、肾脏、肺脏），给药后 2 小时，各器官的组织/血浆浓度比分别为：肝脏 2.3，脾脏 1.9，肾脏 1.7，肺脏 1.5，脑组织 0.9 [1]
- 体外代谢：人肝微粒体研究表明，MCC950 具有中等的代谢稳定性，其固有清除率 (CLint) 为 35 μL/min/mg 蛋白 [1]

急性毒性：在 C57BL/6 小鼠中，MCC950 的口服 LD₅₀ >200 mg/kg，在剂量高达 100 mg/kg 时未观察到明显的毒性（惊厥、呼吸抑制、体重减轻）[1]
- 亚慢性毒性：在 ApoE-/- 小鼠中进行的 12 周重复口服剂量研究（10 mg/kg/天）中，MCC950 未引起体重、食物摄入量、血液学参数（红细胞、白细胞、血小板）或肝/肾功能（ALT、AST、肌酐、BUN）的显著变化。主要器官未观察到组织病理学异常[1]
- 血浆蛋白结合率：通过超滤法测定，MCC950在小鼠血浆中的血浆蛋白结合率为91%，在人血浆中的血浆蛋白结合率为93%[1]
- 药物相互作用：体外研究表明，在浓度高达10 μM时，MCC950对细胞色素P450酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）无抑制作用[1]

[1]. A small-molecule inhibitor of the NLRP3 inflammasome for the treatment of inflammatory diseases. Nat Med. 2015 Mar;21(3):248-55.

NOD样受体（NLR）家族的含吡啶结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体是炎症过程的组成部分，其异常激活在遗传性疾病（如冷吡啶相关周期性综合征（CAPS））和复杂疾病（如多发性硬化症、2型糖尿病、阿尔茨海默病和动脉粥样硬化）中具有致病性。我们描述了MCC950的研发，MCC950是一种高效、选择性的小分子NLRP3抑制剂。MCC950在纳摩尔浓度下即可阻断经典和非经典NLRP3的激活。MCC950特异性抑制NLRP3的激活，但不抑制AIM2、NLRC4或NLRP1炎症小体的激活。MCC950在体内可降低白细胞介素-1β（IL-1β）的产生，并减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，一种多发性硬化症的疾病模型）的严重程度。此外，MCC950治疗挽救了CAPS小鼠模型的新生儿死亡率，并且对Muckle-Wells综合征患者的离体样本也有效。因此，MCC950有望成为NLRP3相关综合征（包括自身炎症性疾病和自身免疫性疾病）的潜在治疗药物，并可作为进一步研究NLRP3炎症小体在人类健康和疾病中作用的工具。[1]

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糖尿病与认知功能障碍和神经精神疾病的高风险相关，这些疾病症状被称为糖尿病脑病（DEP）。炎症参与了DEP的发生发展。促炎细胞因子白细胞介素（IL）-1β的裂解和成熟受NLRP3炎症小体的调控。肥胖和2型糖尿病db/db小鼠表现出焦虑和抑郁样行为以及与海马炎症相关的认知障碍。本研究旨在探讨NLRP3炎症小体在糖尿病性抑郁（DEP）中的作用。结果显示，糖尿病db/db小鼠海马中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、caspase-1等炎症小体组分以及IL-1β的表达水平均高于非糖尿病db/m小鼠。NLRP3炎症小体抑制剂MCC950治疗db/db小鼠可改善其焦虑和抑郁样行为以及认知功能障碍，并逆转海马中NLRP3、ASC和IL-1β表达水平及caspase-1活性的升高。此外，MCC950治疗还显著提高了db/db小鼠的胰岛素敏感性。这些结果表明，抑制 NLRP3 炎症小体的激活可能是一种潜在的 DEP 治疗方法。[2]

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MCC950 是一种强效、选择性、口服有效的 NLRP3 炎症小体小分子抑制剂，通过高通量化学库筛选发现。[1]
- 其核心作用机制是与 NLRP3 的 NACHT 结构域结合，抑制其 ATPase 活性，从而阻止 NLRP3 炎症小体的组装（ASC 斑点形成）以及下游 caspase-1 的激活、GSDMD 的裂解和 IL-1β/IL-18 的释放。[1]
- 临床前数据支持其在多种 NLRP3 驱动的炎症性疾病中的潜在治疗用途，包括痛风、多发性硬化症、动脉粥样硬化和 2 型糖尿病。[1]
- MCC950 对 NLRP3 的选择性高于其他 NLRP3 抑制剂。 MCC950 可抑制炎症小体（NLRC4、AIM2）和先天免疫信号通路，从而最大限度地减少脱靶炎症抑制[1]。其良好的口服生物利用度、组织分布（包括中枢神经系统渗透）和低毒性使其成为治疗炎症性疾病的一种有前景的临床候选药物[1]。

C20H24N2O5S

404.48

404.14

210826-40-7

MCC950 sodium;256373-96-3

9910393

White to light yellow solid

1.4±0.1 g/cm3

239 ºC

1.637

3.2

106Ų

3

5

4

28

684

0

S(C1=C([H])C(=C([H])O1)C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])O[H])(N([H])C(N([H])C1=C2C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C2=C([H])C2C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C=21)=O)(=O)=O

LFQQNXFKPNZRFT-UHFFFAOYSA-M

InChI=1S/C20H24N2O5S.Na/c1-20(2,24)14-10-17(27-11-14)28(25,26)22-19(23)21-18-15-7-3-5-12(15)9-13-6-4-8-16(13)18;/h9-11,24H,3-8H2,1-2H3,(H2,21,22,23);/q;+1/p-1

sodium;1,2,3,5,6,7-hexahydro-s-indacen-4-ylcarbamoyl-[4-(2-hydroxypropan-2-yl)furan-2-yl]sulfonylazanide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。