MHY1485

mTORC1; mTORC2; mTORC1; Autophagy

MHY1485（10 μM；4 小时）表明，GCDC 诱导的自噬活性通过上调 HCC 细胞中的 p-mTOR 表达并下调 LC3 和 p62 表达来抑制[1]。 MHY1485（5 μM；6 小时）以剂量和时间依赖性方式增加 LC3I/LC3I 比率，因为它表面上抑制大鼠肝 Ac2F 细胞中的 LC3II 降解[2]。 MHY1485（0.5-2 μM；6 小时）可增加 Ac2F 细胞中 mTOR ser2448 的磷酸化，并以剂量依赖性方式上调 4E-BP1 的磷酸化水平 [2]。

MHY1485（腹膜内注射；10 mg/kg，2 天）抑制卵泡刺激素 (FSH) 诱导的自噬信号传导。虽然p-mTOR和p-S6K1表达水平上升，但LC3的表达与对照组没有明显差异[3]。
此外，mTOR激活剂MHY1485的作用，在FSH治疗前2天服用10mg/kg。结果表明，MHY1485阻断了FSH诱导的自噬信号。在MHY1485存在的情况下，p-mTOR和p-S6K1表达水平保持在高水平（图2d，底部，图2f），而LC3表达与对照组相比没有明显变化（图2d、顶部，图2e）。这些发现表明，FSH通过AKT-mTOR信号通路诱导MGCs自噬，并在治疗后12小时内启动一个动态过程[2]。

蛋白质印迹分析用于发现总蛋白水平以及 mTOR 和 4E-BP1 磷酸化形式的变化，这些是 mTOR 活性的指标。将不同浓度的 MHY1485 应用于 Ac2F 细胞 1 小时，同时使用雷帕霉素 (5 mM) 作为阳性对照。用冷 PBS 洗涤后收获细胞。 RIPA 缓冲液含有 50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1% NP-40、1 mM DTT、0.1 mM NaF、1 mM PMSF 以及胃酶抑素、亮抑酶肽和抑肽酶各 1 mg/mL，用于制备细胞裂解物。碳酸氢盐 (BCA) 分析用于测量蛋白质浓度。 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶用于分离完全相同量的蛋白质。然后将凝胶在 60-75 V 下电印迹 2 小时，将其转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后，膜在 5% 脱脂牛奶的 Tris 缓冲盐水 (TBS) 和 0.5% Tween-20 溶液中封闭后，与一抗一起孵育。为了确定分子量，使用预染色的蛋白质标记。

蛋白质印迹[2]
用冷PBS洗涤细胞并收获。使用含有50 mM Tris-HCl（pH）、150 mM NaCl、1%NP-40、1 mM DTT、0.1 mM NaF、1 mM PMSF、1µg/ml pepstatin、1µg/ml亮肽和1µg/ml抑肽酶的RIPA缓冲液制备细胞裂解物。使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准，通过二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度。在10-12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上分离出等量的蛋白质。随后，通过在60-75V下电印迹将凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜上2小时。将膜封闭在含有0.5%吐温-20的Tris缓冲盐水（TBS）中的5%脱脂乳溶液中，并与所示的一抗一起孵育。预染色的蛋白质标记用于分子量测定。

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GFP-LC3和共聚焦显微镜对自噬体的染色[2]
大约1×10？将5个细胞接种在盖玻片底皿中，孵育过夜，然后在DMEM中以1000个病毒颗粒/细胞的浓度用编码绿色荧光蛋白微管相关蛋白1轻链3的腺病毒转染。孵育24小时后，用化合物处理细胞或使其饥饿。为了观察溶酶体，将细胞与浓度为60 nM的LysoTracker®一起孵育1小时。用FV10i FLUOVIEW共聚焦显微镜获得共聚焦图像。

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将细胞暴露于指定浓度的药物中 24 小时。

4周龄雌性ICR小鼠[3]
10 mg/kg，2天
腹腔注射

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在激活剂和抑制剂实验中，于FSH给药前注射MHY1485（10 mg/kg，2天）和氯喹（20 mg/kg，5天）。HIF-1α抑制剂Px-478和AMPK抑制剂化合物C于FSH处理前注射，实验方案见补充图S2。[3]

[1]. Glycochenodeoxycholate promotes hepatocellular carcinoma invasion and migration by AMPK/mTOR dependent autophagy activation. Cancer Lett. 2019 Jul 10;454:215-223.

[2]. Inhibitory effect of mTOR activator MHY1485 on autophagy: suppression of lysosomal fusion. PLoS One. 2012;7(8):e43418.

[3]. Administration of follicle-stimulating hormone induces autophagy via upregulation of HIF-1α in mouse granulosa cells.Cell Death Dis. 2017 Aug 17;8(8):e3001.

转移和复发严重影响肝细胞癌（HCC）的治疗效果。合并胆汁淤积的HCC更易发生复发和转移。既往研究表明胆汁酸参与HCC的发病机制，但其潜在机制尚不明确。甘氨胆酸（GCDC）是胆汁酸（BA）的重要组成部分之一。本研究通过体外和体内实验检测了GCDC在HCC细胞侵袭中的作用。结果发现GCDC显著增强HCC细胞的侵袭能力；进一步研究表明，GCDC可诱导HCC细胞自噬激活并提高其侵袭能力。有趣的是，氯喹（CQ）抑制自噬可逆转这一现象。随后，本研究分析了HCC患者中总胆汁酸（TBA）表达水平与临床病理特征的相关性。临床研究发现，HCC组织中TBA水平升高与HCC患者的侵袭性增强和生存率降低相关。机制研究表明，胆汁酸通过靶向肝癌细胞中的AMPK/mTOR通路诱导自噬。因此，我们的结果提示胆汁酸可能通过激活自噬促进肝癌细胞的侵袭，而胆汁酸水平可能作为肝癌患者预后的潜在有用指标。[1]

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自噬是一种主要的降解过程，负责通过溶酶体途径清除细胞质蛋白和功能异常的细胞器。在自噬过程中，细胞形成双层膜囊泡，称为自噬体，自噬体包裹细胞质中的可降解物质，最终与溶酶体融合。在本研究中，我们使用Ac2F大鼠肝细胞培养系统，研究了合成化合物MHY1485对自噬的抑制作用。通过测量自噬通量来评估自噬活性。利用活细胞共聚焦显微镜观察了转染AdGFP-LC3的Ac2F细胞中的自噬体。此外，采用Western blot和AutoDock 4.2分子对接模拟评估了自噬主要调控蛋白mTOR的活性。结果表明，MHY1485处理抑制了基础自噬通量，且在饥饿（一种强烈的生理性自噬诱导剂）条件下，这种抑制作用得到了进一步证实。MHY1485处理后，p62和beclin-1的水平未见显著变化。共聚焦显微镜图像显示，自噬体和溶酶体的共定位减少，表明MHY1485抑制了饥饿诱导自噬过程中溶酶体的融合。MHY1485的这些作用导致LC3II的积累和自噬体的增大，且呈剂量和时间依赖性。此外，MHY1485 可诱导 mTOR 激活，并且在分子对接模拟中，其对接评分高于已知的 ATP 竞争性 mTOR 抑制剂 PP242。总之，MHY1485 通过抑制自噬体与溶酶体的融合，导致 LC3II 蛋白积累和自噬体增大，从而抑制自噬过程。MHY1485 还能诱导 mTOR 活性，这为 MHY 化合物调控自噬的另一种机制提供了可能。本研究的意义在于发现了一种具有 mTOR 激活作用的新型自噬抑制剂。[2] 近期研究报道了自噬在卵泡发育中的重要作用。然而，其潜在的分子机制仍不清楚。本研究探讨了卵泡刺激素 (FSH) 对小鼠颗粒细胞 (MGCs) 的影响。结果表明，卵泡刺激素（FSH）可诱导自噬，FSH是调节卵泡发育和颗粒细胞（GC）增殖的主要激素。在颗粒细胞自噬过程中，雷帕霉素靶蛋白（mTOR，一种自噬的关键调节因子）的激活受到抑制。此外，mTOR激动剂MHY1485通过激活mTOR显著抑制自噬信号通路。FSH处理后，缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达增加。阻断HIF-1α可减弱自噬信号通路。体外实验表明，在FSH存在的情况下，氯化钴（CoCl2）诱导的缺氧可增强细胞自噬，并影响beclin1和BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（Bnip3）的表达。敲低beclin1和Bnip3可抑制颗粒细胞中的自噬信号通路。此外，我们的体内研究表明，氯喹有效抑制自噬后，FSH诱导的体重增加显著降低，这与PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬不完全、细胞周期延迟以及细胞增殖速率降低有关。此外，氯喹处理降低了抑制素α亚基的表达，但增强了3β-羟类固醇脱氢酶的表达。阻断自噬导致FSH刺激后窦卵泡和排卵前卵泡的比例显著降低。总之，我们的结果表明，FSH通过HIF-1α诱导MGCs中的自噬信号通路。此外，我们的结果还提供了FSH诱导的自噬与卵泡发育和闭锁相关的证据。[3]

C17H21N7O4

387.39314

387.165

C, 52.71; H, 5.46; N, 25.31; O, 16.52

326914-06-1

326914-06-1

2834965

Off-white to yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

643.3±65.0 °C at 760 mmHg

259°C

342.9±34.3 °C

0.0±1.9 mmHg at 25°C

1.652

-0.98

122

1

10

4

28

476

0

O=[N+](C1=CC=C(NC2=NC(N3CCOCC3)=NC(N4CCOCC4)=N2)C=C1)[O-]

MSSXBKQZZINCRI-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H21N7O4/c25-24(26)14-3-1-13(2-4-14)18-15-19-16(22-5-9-27-10-6-22)21-17(20-15)23-7-11-28-12-8-23/h1-4H,5-12H2,(H,18,19,20,21)

4,6-dimorpholino-N-(4-nitrophenyl)-1,3,5-triazin-2-amine

MHY-1485; MHY 1485; mhy1485; 326914-06-1; 4,6-dimorpholino-N-(4-nitrophenyl)-1,3,5-triazin-2-amine; 4,6-dimorpholin-4-yl-N-(4-nitrophenyl)-1,3,5-triazin-2-amine; MHY 1485; 4,6-bis(morpholin-4-yl)-N-(4-nitrophenyl)-1,3,5-triazin-2-amine; MFCD00489974; MHY1485

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~33 mg/mL (85.2 mM)
Water: <1 mg/mL
Ethanol: <1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.77 mg/mL (1.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 7.7 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 0.77 mg/mL (1.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 7.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 5 mg/mL (12.91 mM) in 50% PEG300 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: 1 mg/mL (2.58 mM) in 20% HP-β-CD in Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。