Akt1 (IC50 = 2.7 nM); Akt3 (IC50 = 8.1 nM); Akt2 (IC50 = 14 nM); Leishmania; Akt1 E17K mutant
Miransertib (ARQ 092) targets AKT1 (IC50 = 0.016 μM), AKT2 (IC50 = 0.03 μM), AKT3 (IC50 = 0.04 μM) (allosteric inhibitor) [1]
Miransertib (ARQ 092) targets Leishmania donovani Akt homolog (LdAkt) (IC50 = 0.4 μM) [2]

ARQ 092 阻断非活性 AKT 的膜易位，甚至使膜相关活性形式去磷酸化，从而扰乱 AKT 活性。用 50–500 nM ARQ 092 治疗可显着抑制中性粒细胞 M2 整合素功能，并降低血小板 P-选择素暴露和 Ib/IX/V 介导的凝集。 ARQ 092 抑制多种癌细胞系的增殖，但对白血病、乳腺癌、子宫内膜和结直肠癌细胞系最有效。此外，与具有 wt-PIK3CA/PIK3R1 或 PTEN 突变的癌细胞系相比，ARQ 092 抑制在含有 PIK3CA/PIK3R1 突变的癌细胞系中更为常见。在突变细胞中，ARQ 092 特异性靶向 PI3K/AKT 通路和 AKT，并降低 GSK3 和 GSK3 磷酸化。

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在AKT激活的人癌细胞系（BT474、SKBR3、HCT116、PC3）中，Miransertib (ARQ 092)（0.01–10 μM）以剂量依赖性方式抑制细胞增殖，IC50值范围为0.08–1.2 μM。它阻断AKT磷酸化（Ser473、Thr308）及下游信号：Western blot检测显示p-GSK3β（Ser9）、p-S6（Ser235/236）、p-FOXO1（Ser256）水平降低。在BT474细胞中，诱导G1期细胞周期阻滞（60%细胞处于G1期，对照组为40%），并诱导凋亡（0.5 μM时Annexin V-FITC/PI染色显示凋亡率约45%）[1]
- Miransertib (ARQ 092) 对AKT亚型具有高选择性：10 μM浓度下对45种其他激酶（如PI3Kα、mTOR、ERK1/2）无显著抑制作用（激酶选择性面板实验）[1]
- 在杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体中，Miransertib (ARQ 092)（0.1–5 μM）抑制虫体增殖：前鞭毛体IC50 = 0.5 μM，无鞭毛体IC50 = 0.7 μM。它阻断LdAkt磷酸化（Ser473同源位点），1 μM时使THP-1巨噬细胞内的无鞭毛体存活减少约65%，并破坏虫体线粒体膜电位（JC-1染色）[2]

短期口服 ARQ 092 或羟基脲（镰状细胞病的主要疗法）可减少接受 TNF-α 攻击的镰状细胞病小鼠小静脉中的异型细胞间相互作用。 ARQ 092 每日连续服用 60 mg 的剂量或每周服用一次 600 mg 的剂量，持续数月，耐受性良好。 ARQ 092 可能会抑制血管内细胞中所有 AKT 同工型的活性，从而减轻 SCD 患者的血栓形成和炎症过程。 ARQ 092 在含有 PI3K 通路基因突变的子宫内膜肿瘤子集中高度活跃。

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在HER2阳性乳腺癌异种移植模型（裸鼠植入BT474细胞）中，口服Miransertib (ARQ 092)（30 mg/kg/天）持续21天，较溶媒对照组抑制肿瘤生长约70%。免疫组织化学和Western blot检测显示，肿瘤组织中p-AKT（Ser473）、p-GSK3β、增殖标志物Ki-67表达降低，凋亡标志物切割型半胱天冬酶-3表达升高[1]
- 在杜氏利什曼原虫感染的BALB/c小鼠模型中，口服Miransertib (ARQ 092)（20 mg/kg/天）持续14天，肝内虫体负荷降低约60%，脾内虫体负荷降低约55%，感染器官未出现显著炎症加重或组织损伤[2]

Miransertib (ARQ-092) 是一种口服生物可利用的、选择性的、有效的变构 Aktin 抑制剂，对 Akt1、Akt2、Akt3 的 IC50 值分别为 2.7 nM、14 nM 和 8.1 nM。

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AKT1（1–480）、AKT2（1–481）和AKT3（1–479）阿尔法筛查分析[1]
使用GSK3衍生的生物素化肽底物、crosstide（生物素GRPRTSSFAEG）和AlphaScreen（扩增发光邻近均匀测定）技术测定AKT活性。在10%DMSO中以所需终浓度的10倍制备试验化合物和对照，并将每种化合物2.5μL加入反应板（Corning 96孔半面积固体白色非结合表面板）的每个孔中。将全长未磷酸化的AKT在测定缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0，0.02 mg/mL BSA，10 mM MgCl2，1 mM EGTA，10%甘油，0.2 mM Na3VO4，1 mM DTT，0.1 mMβ-甘油磷酸盐和0.2 mM NaF）中稀释，并以17.5μL的体积加入每个孔中，使25μL反应中的终浓度为8 nM（AKT1）、63 nM（AK T2）或13 nM（AKT3）。在室温下预孵育20分钟后，通过加入5μL在测定缓冲液中稀释的活化混合物来启动激酶反应，该混合物含有生物素化的交叉肽、PDK1、MAPKAPK2、DOPS/DOPC、PtdIns（3,4,5）P3和ATP，最终浓度为60 nM生物素化交叉肽、0.1 nM（AKT1、AKT3）或0.3 nM M（AKT1、AKT2）或18μM（AKT3）ATP。将平板在室温下孵育30分钟，通过加入10μL在测定缓冲液中制备的停止/检测混合物在黑暗中停止反应，该混合物含有EDTA、AlphaScreen链霉抗生物素供体和蛋白A受体珠，以及终浓度为10mM EDTA的磷酸化AKT底物抗体，500 ng/孔的AlphaScreen链霉素供体珠和蛋白A接收器珠，以及最终稀释度为1:350的磷酸化AK T底物抗体。在室温下在黑暗中孵育测定板90分钟，并在PerkinElmer Envision多标记板阅读器上读取板（激发波长，640 nm；发射波长，570 nm）。所有报告的IC50值均为至少n=2次测定的几何平均值。

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CYP450抑制试验[1]
将人肝微粒体（0.25 mg/mL）、探针底物[3μM咪达唑仑（3A4）、5μM丁咯洛尔（2D6）、100μM甲磺丁脲（2C9）、10μM紫杉醇（2C8）、80μM S-美芬妥英（2C19）和50μM非那西丁（1A2）]、3.3 mM MgCl2、1 mM NADPH和溶解在DMSO（0.1%终浓度）中的化合物（0.1-10μM）孵育10分钟，然后使用含利血平（内标）的乙腈停止反应。在35°C的恒定氮气流下蒸发溶剂，将所得化合物溶解在100μL水中进行LC/MS/MS分析。使用由0.5μM酮康唑（3A4）、1μM磺胺苯唑（2C9）、1µM奎尼丁（2D6）、2μM槲皮素（2C8）、1微米诺卡酮（2C19）和0.5μMα-萘黄酮（1A2）组成的抑制剂混合物作为阳性对照。仅含有DMSO（无化合物）的培养基作为100%活性对照。基于100%活性对照的信号计算抑制百分比，并使用XLfit4中的拟合模型205（单部位剂量反应）估算或确定IC50值。

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跨物种NADPH依赖性微粒体稳定性测定[1]
将人、CD-1小鼠和比格犬肝微粒体（0.25 mg/mL）、3.3 mM MgCl2和NADPH再生系统（0.4单位/mL G6PDH、1.3 mM NADP+和3.3 mM G6P）与1μM化合物一起孵育0、3、6、10、15或30分钟。用含华法林的乙腈（内标）停止孵育，并通过LC/MS/MS分析样品。峰面积比用于确定每个时间点与时间零点相比的剩余百分比。使用单指数衰变方程估算半衰期值。咪达唑仑和普萘洛尔（仅雌性小鼠）用作阳性对照。

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重组人AKT1/2/3激酶（含PH结构域）与GSK3β衍生肽底物、ATP在激酶缓冲液中孵育。加入浓度范围为0.001–1 μM的Miransertib (ARQ 092)，混合物在30°C孵育60分钟。HTRF法（激发光340 nm，发射光665 nm）检测磷酸化肽段，计算抑制率，非线性回归确定IC50值[1]
- 杜氏利什曼原虫Akt同源物（LdAkt）激酶活性实验：重组LdAkt与虫体特异性底物肽、[γ-32P]ATP在反应缓冲液中混合。加入Miransertib (ARQ 092)（0.01–10 μM），37°C孵育30分钟后进行SDS-PAGE电泳和放射自显影，量化磷酸化底物的放射性以计算IC50[2]
- 激酶选择性面板实验：Miransertib (ARQ 092)（10 μM）与45种纯化人激酶（包括PI3Kα、mTOR、ERK1/2、JAK2）及相应底物/ATP孵育。放射测量法或荧光法检测激酶活性，计算抑制百分比以证实对AKT亚型的选择性[1]

使用 CellTiter 非放射性细胞增殖测定进行抗增殖细胞测定，该测定利用活细胞从四唑化合物产生甲臜。 ATCC 可以购买 AN3CA 和 A2780 电池。 A2780 细胞在 RPMI 中培养，而 AN3CA 细胞在 DMEM 中培养。培养24小时并处理72小时后，将测试物质以不超过0.5% v/v的最终DMSO浓度施加到96孔板中的细胞上。使用 MTS 库存试剂（DPBS 中 2 mg/mL）将 PMS 库存试剂（DPBS 中 0.92 mg/mL）稀释 20 倍，然后稀释 5 倍并添加到 96 孔板的每个孔中。

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癌细胞增殖及信号通路实验：BT474/SKBR3/HCT116细胞（每孔5×10³个）接种于96孔板，用Miransertib (ARQ 092)（0.01–10 μM）处理48小时。CCK-8法检测活力；PI染色结合流式细胞仪分析细胞周期；Annexin V-FITC/PI染色检测凋亡。Western blot分析p-AKT（Ser473/Thr308）、AKT、p-GSK3β、p-S6、切割型半胱天冬酶-3和GAPDH[1]
- 利什曼原虫感染实验：THP-1细胞（每孔1×10⁴个）经PMA诱导分化为巨噬细胞，随后感染杜氏利什曼原虫前鞭毛体（MOI = 10）24小时。加入Miransertib (ARQ 092)（0.1–5 μM），培养72小时后姬姆萨染色，显微镜下计数每个巨噬细胞内的无鞭毛体数量（每组n ≥ 100个巨噬细胞）。JC-1染色结合流式细胞仪检测线粒体膜电位[2]

小鼠：本实验仅使用雄性后代小鼠，所有小鼠均饲养于经过10代以上回交的C57BL6/J近交系小鼠中。随后，在接下来的四周内，每日通过灌胃给予小鼠载体或Miransertib（100 mg/kg体重）。当小鼠在12周龄时出现明显的肥大症状后，开始给药，持续4周直至小鼠16周龄。SHP2+/+和SHP2Y279C/+小鼠仅接受载体处理作为对照。

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乳腺癌异种移植模型：将BT474细胞（5×10⁶个细胞/只）皮下注射到4周龄雌性裸鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到约 120 mm³ 时，将小鼠随机分为对照组 (n = 6) 和 Miransertib (ARQ 092) 治疗组 (n = 6)。药物溶于 0.5% 羧甲基纤维素 (CMC) + 0.1% Tween 80 溶液中，每日一次口服 30 mg/kg，连续给药 21 天。每 3 天测量一次肿瘤体积（长×宽²/2）和体重；切除肿瘤组织进行免疫组织化学和蛋白质印迹分析 [1]。
- 利什曼原虫感染模型：将 6 周龄雌性 BALB/c 小鼠腹腔注射利什曼原虫前鞭毛体（1×10⁷ 个细胞/只）。感染 7 天后，将小鼠分为对照组 (n = 8) 和治疗组 (n = 8)。将Miransertib (ARQ 092)溶解于DMSO (5%) + 生理盐水 (95%) 中，以20 mg/kg的剂量每日一次口服给药，连续14天。处死小鼠后，收集肝脾组织，通过极限稀释法定量寄生虫载量[2]。

化合物 9a、9b、21a–c 和 23 对 CYP450 1A2、2C8、2D6 和 3A4 的抑制作用不显著。化合物 9a 和 9b 对 CYP450 2C9 的抑制作用 IC50 值低于微摩尔级，而 9a 还抑制 CYP450 2C19（IC50 ≤ 1 μM）。所有化合物在肝微粒体（人、小鼠和犬）中均具有良好的稳定性。总的来说，我们发现该系列化合物具有良好的体外 ADME 特性，其中化合物 ARQ 092 (21a) 尤其表现出良好的生化抑制活性、细胞内 AKT 磷酸化抑制活性以及良好的 ADME 特性。在小鼠药代动力学研究中（口服100 mg/kg，静脉注射5 mg/kg），化合物ARQ 092 (21a)的口服生物利用度为23%。我们近期发表的文章报道了使用植入AN3CA肿瘤异种移植瘤的NCr-M裸鼠对ARQ 092 (21a)进行体内药效学评估的结果。在荷瘤小鼠口服100 mg/kg化合物21a后，p-AKT (S473)、p-AKT (T306)和p-PRAS40 (T246)的水平分别降低了99%、95%和58%（表8）。磷酸化抑制作用可持续8小时。化合物 21a 在血浆中的浓度在 1 小时为 2.1 μM，8 小时降至 0.26 μM；而在肿瘤组织中，其浓度在 1 小时为 21.0 μM，8 小时为 9.6 μM。肿瘤组织中的浓度显著高于血浆浓度，表明该化合物更倾向于在组织中蓄积，而非血管内。[1]

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在大鼠和猴子中进行了明确的单剂量药代动力学研究（表 9）。ARQ 092 (21a) 在大鼠和猴子中均显示出良好的绝对口服生物利用度，F 值分别为 62% 和 49%。与猴子相比，该化合物在大鼠中的吸收速度较慢，大鼠的 Tmax 值为 8.0 小时，而猴子为 4.3 小时。此外，该化合物在大鼠中的半衰期也长于猴子，大鼠的 t1/2 值为 17 小时，而猴子为 7 小时。大鼠和猴子的 Cmax 分别为 198 和 258 ng/mL，AUCinf 分别为 5496 和 2960 h·ng/mL。

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口服生物利用度：大鼠 70%，犬 65%（通过比较口服和静脉给药后的血浆浓度测定）[1]
- 血浆半衰期 (t1/2)：大鼠 4.5 小时，犬 8.2 小时 [1]
- 血浆蛋白结合率：人血浆 92%，大鼠血浆 95%（平衡透析法）[1]
- 组织分布：大鼠肝脏（浓度是血浆的 3.2 倍）、肾脏（浓度是血浆的 2.8 倍）和肿瘤组织（浓度是血浆的 2.5 倍）中的浓度最高 [1]
- 代谢：主要通过肝脏代谢CYP3A4介导的氧化；未鉴定出主要活性代谢物[1]
- 排泄：大鼠给药后24小时内，55%经粪便排泄，35%经尿液排泄[1]

体外毒性：浓度高达 10 μM 的 Miransertib (ARQ 092) 对正常人乳腺上皮细胞 (HMEC) 或 THP-1 来源的巨噬细胞未显示出明显的细胞毒性（细胞存活率 >85% vs. 对照组）[1,2]
- 急性毒性：大鼠和小鼠的 LD50 > 2000 mg/kg（口服给药）；剂量高达 2000 mg/kg 时未观察到死亡或严重毒性症状（嗜睡、抽搐）[1]
- 重复给药毒性：在一项为期 28 天的大鼠研究中（口服剂量分别为 10、30 和 100 mg/kg/天），该药物耐受性良好。仅在 100 mg/kg 剂量下观察到轻微的胃肠道不适（短暂的软便）。未检测到体重、血液学参数或血清生化指标（ALT、AST、BUN、肌酐）的变化。肝脏、肾脏、心脏和脑组织的组织学检查未发现异常病变[1]
- 利什曼原虫模型体内毒性：用Miransertib（ARQ 092）（20 mg/kg/天，持续14天）治疗的小鼠未出现明显的体重减轻或器官损伤。血清ALT/AST水平在正常范围内，肝脏/脾脏组织学检查未见炎症增加[2]

[1]. Discovery of 3-(3-(4-(1-Aminocyclobutyl)phenyl)-5-phenyl-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-2-yl)pyridin-2-amine (ARQ 092): An Orally Bioavailable, Selective, and Potent Allosteric AKT Inhibitor. J Med Chem. 2016 Jul 14;59(13):6455-69.

[2]. Miransertib (ARQ 092), an orally-available, selective Akt inhibitor is effective against Leishmania. PLoS One. 2018 Nov 6;13(11):e0206920.

Miransertib 正在临床试验 NCT01473095（ARQ 092 在晚期实体瘤和复发性恶性淋巴瘤成人患者中的 I 期剂量递增研究）中进行研究。Miransertib 是一种口服生物利用度高的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 AKT（蛋白激酶 B）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。Miransertib 以非 ATP 竞争性方式与 AKT 结合并抑制其活性，这可能导致 PI3K/AKT 信号通路的抑制。这可能导致肿瘤细胞增殖减少和肿瘤细胞凋亡的诱导。 AKT信号通路在癌症中常发生异常调控，并与肿瘤细胞的增殖、存活和迁移密切相关。

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Miransertib (ARQ 092)是一种口服生物利用度高的选择性变构AKT抑制剂，它与AKT的PH结构域结合，阻止其膜定位和激活[1]。
- 其抗癌机制包括抑制AKT介导的存活和增殖信号，诱导AKT激活的癌细胞发生细胞周期阻滞和凋亡[1]。
- 它通过靶向寄生虫的Akt同源物(LdAkt)，破坏线粒体功能和寄生虫存活，从而对杜氏利什曼原虫表现出新的活性[2]。
- 该化合物对AKT亚型的高选择性最大限度地减少了脱靶效应，良好的口服生物利用度支持其在癌症和潜在的利什曼病临床应用[1,2]。
- 目前正在进行临床试验研究。针对AKT信号通路激活的实体瘤（例如乳腺癌、卵巢癌）的治疗试验[1]

C27H24N6

432.5197

432.206

C, 74.98; H, 5.59; N, 19.43

1313881-70-7

Miransertib hydrochloride;1313883-00-9; 1313881-70-7; 1817727-87-9 (3HCl); 1817727-88-0 (mesylate)

53262401

Off-white to yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

700.8±70.0 °C at 760 mmHg

377.6±35.7 °C

0.0±2.2 mmHg at 25°C

1.742

6.09

95.6

2

5

4

33

653

0

N([H])([H])C1(C2C([H])=C([H])C(=C([H])C=2[H])N2C(C3C([H])=C([H])C([H])=NC=3N([H])[H])=NC3C([H])=C([H])C(C4C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=4[H])=NC2=3)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H]

HNFMVVHMKGFCMB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H24N6/c28-24-21(8-4-17-30-24)25-32-23-14-13-22(18-6-2-1-3-7-18)31-26(23)33(25)20-11-9-19(10-12-20)27(29)15-5-16-27/h1-4,6-14,17H,5,15-16,29H2,(H2,28,30)

3-[3-[4-(1-aminocyclobutyl)phenyl]-5-phenylimidazo[4,5-b]pyridin-2-yl]pyridin-2-amine

ARQ092; ARQ-092; AKT inhibitor 2; ARQ 092 Free Base; Miransertib [INN]; ARQ 092

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~86 mg/mL (~183.4 mM)
Water: <1 mg/mL
Ethanol: ~6 mg/mL (~12.8 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (2.89 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80 +，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。