ML 145

GPR35 ( IC50 = 20.1 nM ); GPR55 ( EC50 = 21.7 μM )

ML-145(10 μM) 还可完全阻断人 FLAG-GPR35-eYFP 对不同浓度的扎普司特、色甘酸二钠和双羟萘酸盐的内化[2]。 ML 145 对啮齿动物直系同源物要么没有作用（小鼠），要么仅显示出很小且明显非竞争性的抑制作用（大鼠）[2]。 ML 145 作为多种人 GPR35 激动剂的竞争性拮抗剂，对各种 GPR35 激动剂的 EC80 浓度的 IC50 值在 20 nM 范围内[1]。

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在β-arrestin依赖性高含量筛选中鉴定出的ML-145也被描述为GPR35的拮抗剂（Heynen Genel等人，2010）。与CID-2745687一样，ML-145以浓度依赖的方式完全抑制了EC80浓度的扎普利司特（图6A）、色甘酸二钠（图6B）和双羟萘酸盐（图6C）对人GPR35的激动作用。与报道的ML-145的更高亲和力一致（Heynen Genel等人，2010），在每种情况下，该配体显示出比CID-2745687更高的效力（表2）。然而，ML-145在啮齿动物直系同源物上要么没有效果（小鼠），要么只显示出很小且明显非竞争性的抑制作用（大鼠）（图6，a和B）。 [2]

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CID2745687和ML-145也可以防止激动剂诱导的人GPR35内化。[2]
值得注意的是，CID-2745687和ML-145（1×10-5M）也完全阻断了人FLAG-GPR35-eYFP的内化，以应对不同浓度的扎普利司特、色甘酸二钠和双羟萘酸盐（图7，A-C）。当在大鼠FLAG-GPR35-eYFP上对扎普利司特进行测试时，CID2745687或ML-145的情况并非如此（图7D）。在小鼠FLAG-GPR35-eYFP中，尽管ML-145对扎普利司特的效力或效果没有影响（图7E），但在1×10−5 M CID-2745687下，效力持续略有下降，但没有统计学意义，但扎普利司t的效果不是最大（图7E）。为了更全面地探索这一点，评估了不同浓度的ML-145或CID-2745687在应答EC80浓度的扎普利司特时防止人或小鼠GPR35直系同源物内化的能力。在这里，ML-145（图8A）和CID-2745687（图8B）在人类直系同源物上都是扎普利司特的有效抑制剂，但在小鼠直系同源物中都没有产生实质性影响（图8，C和D）。当使用EC80浓度的色甘酸二钠（人和小鼠GPR35）或双羟萘酸盐（人直系同源）时，ML-145（图8，A和C）和CID-2745687（图8、B和D）的结果是等效的。

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正如其他试验所预期的那样，在IP1积累试验中，ML-145抑制了EC80浓度的扎普利司特（3×10-7M）、色甘酸二钠（3×10-16M）和双羟萘酸盐（1×10-8M）对人GPR35的影响，在这些条件下pIC50接近7.4（图10A）。此外，ML-145还以浓度依赖的方式降低了基础IP1的产生（图10A），这与该配体作为反向激动剂并抑制人GPR35的组成活性是一致的。相比之下，在该试验中，ML-145对小鼠或大鼠GPR35的EC80浓度的扎普利司特的激动作用几乎没有抑制作用（图10A）。尽管有必要使用3×10-6M的双羟萘酸盐通过大鼠GPR35产生大量信号，但ML-145在高达1×10-5M的浓度下完全没有效果（图10A）。CID-2745687也以浓度依赖的方式抑制了扎普利司特、色甘酸二钠和双羟萘酸对人GPR35的作用，但其效力比ML-145低10倍以上（图10B）。对于ML-145，CID-2745687也作为反向激动剂，能够以浓度依赖的方式减少基础IP1的产生（图10B）。如ML-145所示，在这些试验中，CID-2745687对大鼠或小鼠GPR35没有显著影响（图10B）[2]。

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ML-145是人GPR35的竞争性拮抗剂。[2]
为了确定ML-145在人类GPR35上的作用模式，我们回到了基于BRET的β-arrestin-2相互作用测定，并在1至50 nM的 浓度下，对扎普利司特（图11A）、色甘酸二钠（图11B）和双羟萘酸盐（图11C）进行了一系列激动剂浓度反应曲线。在所有情况下，对数据的全球分析都与ML-145作为竞争性和可克服的拮抗剂是一致的，尽管色甘酸二钠的相对较低的效力意味着不能使用足够的激动剂来完全克服所使用的最高浓度ML-145的影响。这些研究得出了ML-145的pA2估计值在8.67到8.83之间（1.48-2.13×10-9M）。

细胞培养和转染。[2]
Flp-In-TREx 293细胞在不含丙酮酸钠的Dulbecco改良Eagle培养基中维持，在37°C、5%CO2加湿气氛中补充10%（v/v）胎牛血清、1%青霉素/链霉素混合物和10μg/ml杀芽素。HEK293T细胞在37°C的Dulbecco改良Eagle培养基中维持，该培养基补充了0.292克/升的l-谷氨酰胺和10%（v/v）的新生小牛血清，在5%的CO2加湿气氛中。使用1mg/ml PEI（线性MW-25000）进行转染。细胞被铺板至60%至80%融合，然后用5μg所需的质粒DNA和PEI（比例1:6DNA/PEI）转染，稀释在150 mM NaCl中，pH 7.4。在室温下孵育10分钟后，将混合物加入HEK293T细胞中。将细胞孵育24小时，然后转移到涂有聚-d-赖氨酸的96孔板上。在所有实验中，通过添加空表达载体pcDNA3，使构建体之间转染的DNA总量相等。

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在稳定表达GPR35形式的TREx 293细胞中产生Flp。[2]
为了产生能够诱导表达人FLAG-GPR3-eYFP、大鼠FLAG-GPR35-eYFP或小鼠FLAG-GPR5-eYFP的Flp-In-TREx 293细胞，根据制造商的说明，使用Effectene用pcDNA5/FRT/To载体和pOG44载体中含有所需cDNA的混合物（1:9）转染细胞。48小时后，将培养基改为添加200μg/ml潮霉素B的培养基，以启动稳定转染细胞的选择。分离耐药细胞后，用高达100ng/ml的强力霉素处理24小时，诱导Flp-In-TREx基因座的适当构建体的表达。

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布雷特。[2]
使用PEI将HEK293T细胞与标记有eYFP和β-arrestin-2-Renilla萤光素酶6（比例4:1）的FLAG-GPR35的所需直系同源物共转染。另一组转染仅使用Renilla荧光素酶构建体和空表达载体pcDNA3。从10cm培养皿中，将每孔50000个细胞接种到聚-d-赖氨酸涂覆的96孔板中。24小时后，用Hanks平衡盐溶液（pH 7.4）洗涤细胞两次，并加入coelentrazine-h至终浓度为5μM。在加入配体之前，细胞在37°C的黑暗中孵育10分钟。细胞在37°C下再孵育5分钟，然后在PHERAstar FS阅读器上读取。然后将BRET比计算为530nm/485nm的发射。净BRET定义为在同一实验中共表达Renilla荧光素酶和eYFP构建体的细胞的530/485nm比率减去仅表达Renilla-荧光素酶构建体的电池的BRET比率。将该值乘以1000，得到mBRET单位。

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内化和活细胞落射荧光显微镜。[2]
表达人或大鼠FLAG-GPR35-eYFP的细胞在涂有聚d-赖氨酸的盖玻片上生长。将盖玻片放入含有生理盐水溶液（130 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、20 mM HEPES和10 mM d-葡萄糖，pH 7.4）的显微镜室中。对于内化研究，将配体添加到显微镜室中，并使用连接到蔡司Axio Observer底部端口的旋转盘结构照明Viva Tome设备以5分钟的间隔获取荧光图像。Z1倒置显微镜。窄带490/20 nm激发光通过63×油浸平面复消色差物镜反射以激发eYFP，并使用Axiocam MRm电荷耦合器件相机在536/40 nm处检测到由此产生的发射光。

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GPR35内化的ArrayScan高含量分析。[2]
Flp在携带人FLAG-GPR35-eYFP、大鼠FLAG-GPR3-eYFP或小鼠FLAG-GPR5-eYFP的T-Rex 293细胞中，以每孔60000个细胞的密度接种到聚d-赖氨酸涂层的清晰可见96孔板中，并用高达100ng/ml的强力霉素处理以诱导受体构建体表达。24小时后，用Hanks平衡盐溶液洗涤细胞两次，并在37°C下与配体一起孵育1小时。然后将细胞与配体和10μg/ml Hoechst核染色在37°C下再孵育30分钟。使用Cellomics ArrayScan II高含量成像仪立即获取图像，并使用专有算法对内化受体进行定量，该算法旨在识别每个细胞的内体循环室的数量。

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肌醇磷酸盐积累测定。[2]
使用PEI将HEK293T细胞与FLAG-GPR35-eYFP和嵌合G蛋白（Gαqi5或Gαq135）的人、大鼠或小鼠直系同源物瞬时共转染。在37°C+5%CO2下孵育16至24小时后，将细胞重新悬浮在IP One刺激缓冲液（10 mM HEPES、1 mM CaCl2、0.5 mM MgCl2、4.2 mM KCl、146 mM NaCl、5.5 mM葡萄糖和50 mM LiCl，pH 7.4）中，并以10000个细胞/孔的速度接种在白色实心底部384孔板上。根据制造商的说明，配体在IP-One刺激缓冲液中稀释。在加入激动剂之前，拮抗剂化合物在37°C下与细胞预孵育15分钟。细胞在37°C下与激动剂一起孵育2小时，然后根据制造商的说明加入d2结合的肌醇一磷酸（IP1）和稀释在裂解缓冲液中的抗IP1 Lumi4-Tb密码盐。在室温下孵育1小时后，使用PHERAstar FS平板读数器测量均匀的时间分辨荧光。

[1]. Selective GPR35 Antagonists - Probes 1 & 2. National Center for Biotechnology Information (US); 2010-2010 Feb 28.

[2]. Antagonists of GPR35 display high species ortholog selectivity and varying modes of action. J Pharmacol Exp Ther. 2012 Dec;343(3):683-95.

尽管许多已知的成瘾调控受体已在药理学和生物化学方面得到充分表征，但一些与已知滥用受体具有同源性的孤儿受体（例如GPR35）仍未被阐明。GPR35是一种G蛋白偶联受体，于1998年通过对人类基因组文库的筛选首次被发现。近期RT-PCR研究证实了GPR35存在于背根神经节、小脑和大脑中，此外还发现了GPR35b，后者是从人类全脑cDNA文库中克隆出来的。因此，GPR35的调控似乎具有深远的生理和病理生理意义。根据本项目的具体目标，已鉴定的探针ML-145 (CID-2286812) 和 ML144 (CID-1542103) 是 GPR35 的选择性拮抗剂，但并非相关孤儿受体 GPR55 的拮抗剂，这支持了以下假设：它们不会对 β-arrestin 信号通路或其下游的信号传导产生非特异性干扰。这些探针将作为新型工具，用于阐明 GPR35 的生物化学特性，并有望成为选择性靶向疼痛相关通路以及加深我们对成瘾分子基础理解的潜在治疗药物。[1]

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物种同源受体的配体药理学和功能差异可能会干扰我们对特征不明确的受体的生物学特性和作用的理解。此前已有研究表明，多种 GPR35 激动剂在人类和鼠类 G 蛋白偶联受体的同源受体之间存在显著的效力选择性差异。通过基于生物发光共振能量转移的GPR35与β-arrestin-2相互作用诱导分析，将小鼠同源物加入到相关研究中，结果表明，与大鼠同源物类似，小鼠GPR35对帕莫酸的效力极低，而对参考GPR35激动剂扎普司特的效力则介于大鼠和人同源物之间。受体内化和G蛋白激活分析也证实了这一模式。本研究考察了两种近期报道的GPR35拮抗剂——5-[(叔丁基氨基甲酰肼基亚甲基)甲基]-1-(2,4-二氟苯基)吡唑-4-羧酸甲酯 (CID2745687) 和2-羟基-4-[4-(5Z)-5-[(E)-2-甲基-3-苯基丙-2-烯基]-4-氧代-2-硫代亚甲基-1,3-噻唑烷-3-基]丁酰氨基)苯甲酸 (ML-145) 的有效性和作用机制。CID-2745687 和 ML-145 均能竞争性抑制色甘酸钠和扎普司特（两种具有重叠结合位点的激动剂）在人GPR35上的作用。相比之下，尽管ML-145也能竞争性拮抗帕莫酸盐的作用，但CID-2745687的作用方式却是非竞争性的。ML-145和CID-2745687均不能有效拮抗扎普司特或色甘酸钠在啮齿动物GPR35同源物上的激动剂作用。这些研究表明，GPR35配体的显著物种选择性并非仅限于激动剂，因此在研究GPR35在非人细胞和组织中的功能时，需要格外谨慎地选择合适的配体。 [2]

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尽管非受体辅助蛋白也可能以物种依赖的方式改变GPR35的药理学特性，但目前的研究再次强调，需要进行标准但深入的药理学分析，以充分了解通过各种筛选方法鉴定出的新型配体的潜力和潜在局限性，以及它们详细的作用机制。目前的研究表明，尽管CID2745687和ML-145对人GPR35具有高亲和力，但它们都不是用于研究小鼠或大鼠生理和疾病模型中GPR35功能的有效药理学拮抗剂，而帕莫酸盐也不是啮齿动物同源受体的高效激动剂。[2]

C24H22N2O5S2

482.571883678436

482.097

C, 59.74; H, 4.60; N, 5.81; O, 16.58; S, 13.29

1164500-72-4

2286812

Yellow to brown solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.719

4.38

164

3

7

8

33

835

0

C1=CC=C(/C=C(/C=C2\SC(=S)N(CCCC(NC3=CC=C(C(=O)O)C(O)=C3)=O)C\2=O)\C)C=C1

COFMYJWNXSFLKQ-QIROLCGISA-N

InChI=1S/C24H22N2O5S2/c1-15(12-16-6-3-2-4-7-16)13-20-22(29)26(24(32)33-20)11-5-8-21(28)25-17-9-10-18(23(30)31)19(27)14-17/h2-4,6-7,9-10,12-14,27H,5,8,11H2,1H3,(H,25,28)(H,30,31)/b15-12+,20-13-

2-hydroxy-4-[4-[(5Z)-5-[(E)-2-methyl-3-phenylprop-2-enylidene]-4-oxo-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-3-yl]butanoylamino]benzoic acid

ML145; ML-145; ML 145; 1164500-72-4; 2-hydroxy-4-[4-[(5Z)-5-[(E)-2-methyl-3-phenylprop-2-enylidene]-4-oxo-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-3-yl]butanoylamino]benzoic acid; MLS000575039; CHEMBL1384502; SMR000208964; 2-hydroxy-4-({4-[5-(2-methyl-3-phenyl-2-propen-1-ylidene)-4-oxo-2-thioxo-1,3-thiazolidin-3-yl]butanoyl}amino)benzoic acid; ML 145

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~50 mg/mL (~103.6 mM)

配方 1 中的溶解度: 5 mg/mL (10.36 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 50.0 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80 +，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。