TRPC4/TRPC5
ML204 has a 19-fold coupling to muscarinic receptor-coupled TRPC6 channel activation and inhibits TRPC4β-mediated intracellular Ca2+ rise with an IC50 value of 0.96 μM (HEK293 cells) [1]. The activation of Gq/11 by the M2 muscarinic receptor or endogenous M3-like muscarinic receptor, u-opioid, 5HT1A hematin, Gi/o, and TRPC4β is blocked by ML204[1]. ML204 inhibits TRPC5 channel activity that is triggered by LPS [3].

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ML204 was identified as a novel TRPC4 channel inhibitor following a high throughput fluorescent screen of the MLSMR library and SAR analysis of active compounds. ML204 inhibited calcium influx through TRPC4 channels activated by μ-opioid receptor stimulation with an IC50 value of 0.96 μM and exhibited 19-fold selectivity against TRPC6 channels in similar fluorescent assays. ML204 blocked TRPC4 channels in an electrophysiological assay with an IC value of 2.6 μM and was also active in fluorescent and electrophysiological assays in which TRPC4 channels were activated by different mechanisms, indicating direct block of TRPC4 channels. Selectivity for block of TRPC4 channels was examined in fluorescent and electrophysiological experiments against closely related TRPC channels and more distantly related TRPV, TRPA and TRPM channels, and against non-TRP ion channels. ML204 afforded good selectivity (19-fold) against TRPC6 channels and more modest selectivity against TRPC3 and TRPC5 (9-fold) channels. Little or no block of TRPV, TRPA, TRPM or voltage-gated ion channels was observed. ML204 exhibited properties useful for a variety of in vitro investigations[2].

ML204 与毒蕈碱受体偶联 TRPC6 通道激活有 19 倍耦合，并抑制 TRPC4β 介导的细胞内 Ca2+ 升高，IC50 值为 0.96 μM（HEK293 细胞）[1]。 M2 毒蕈碱受体或内源性 M3 样毒蕈碱受体、u-阿片类药物、5HT1A 血红素、Gi/o 和 TRPC4β 对 Gq/11 的激活被 ML204 阻断[1]。 ML204 抑制由 LPS 触发的 TRPC5 通道活动 [3]。

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在MLSMR文库的高通量荧光筛选和活性化合物的SAR分析后，ML204被鉴定为一种新型TRPC4通道抑制剂。ML204抑制了μ阿片受体刺激激活的TRPC4通道的钙内流，IC50值为0.96μM，在类似的荧光检测中对TRPC6通道表现出19倍的选择性。ML204在电生理学检测中阻断了TRPC4通道，IC值为2.6μM，在荧光和电生理检测中也表现活跃，其中TRPC4信道由不同机制激活，表明直接阻断了TRPCV4信道。在荧光和电生理实验中，针对密切相关的TRPC通道和较远相关的TRPV、TRPA和TRPM通道，以及非TRP离子通道，检查了TRPC4通道阻断的选择性。ML204对TRPC6通道具有良好的选择性（19倍），对TRPC3和TRPC5通道具有更温和的选择性（9倍）。很少或没有观察到TRPV、TRPA、TRPM或电压门控离子通道的阻断。ML204表现出可用于各种体外研究的特性[2]。

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ML204 在共表达 TRPC4β 和 μ-阿片受体的 HEK293 细胞中，阻断 TRPC4β 介导的细胞内 Ca²⁺ 升高，IC₅₀ 为 0.96 ± 0.26 µM。
在全细胞膜片钳记录中，抑制由 μ-OR 刺激（IC₅₀ ≈ 2.9–3.55 µM）或细胞内灌注 GTPγS（IC₅₀ ≈ 2.85 µM）激活的 TRPC4β 电流。
在豚鼠回肠平滑肌细胞中，阻断毒蕈碱受体激活的阳离子电流（mIₐₐₜ），10 µM 时抑制卡巴胆碱诱导的电流约 86%，抑制 GTPγS 诱导的电流约 65%。
10–20 µM 浓度下对 TRPV1、TRPV3、TRPM8、TRPA1 或小鼠背根神经节神经元中的电压门控离子通道无显著抑制（≤20%）。[1]

在注射 LPS 的小鼠中，ML204（1 mg/kg；皮下注射；每天两次；持续 5 天）产生与体温降低和腹膜白细胞和细胞因子数量减少相关的活性。ML204对TRPC4/TRPC5的双重阻断增加了硫氧还蛋白处理的LPS小鼠的死亡率和低温，但保留了巨噬细胞的吞噬能力。TRPC5缺失不会改变体温，但会促进硫氧还蛋白给药LPS小鼠腹膜白细胞的额外积聚和炎症介质的释放。硫氧还蛋白减少了野生型巨噬细胞介导的吞噬作用，但没有减少TRPC5敲除动物的吞噬作用。TRPC5消融不影响LPS诱导的反应。然而，在注射LPS的小鼠中，ML204导致了与低温加剧和腹膜白细胞数量和细胞因子减少相关的死亡率。这些结果表明，LPS刺激下的细菌硫氧还蛋白效应是由TRPC4和TRPC5介导的，从而揭示了细菌毒力的其他机制以及这些受体的病理生理作用。 [4]

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值得注意的是，ML204灌注的小鼠免受PS诱导的FPE的影响（图7A）。通过计算TEM图像中GBM测量长度上的FP数量（每组n=90-105张图像），以盲法量化这些结果。通过这一分析，ML204灌注小鼠对PS的影响显示出显著的保护作用（图7B）。这些结果与我们在Trpc5 KO小鼠中的观察结果一致。[3]
接下来，我们测试了ML204在LPS模型中的作用。在注射LPS后，每隔12小时注射两次ML204（20mg/kg/d i.p.）。对照组注射PBS的小鼠没有可观察到的结构变化，也没有蛋白尿（图7，C-E）。LPS注射导致FPE（图7D），尽管这比PS诱导的FPE更温和。重要的是，经ML204处理的小鼠免受LPS诱导的FPE和蛋白尿的影响[3]。

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在 PS 灌注模型中，与单独使用 PS 相比，在 WT 小鼠中共同灌注 10 µM ML204 与 PS 保留了足突，显著防止了足突融合。[3]
在 LPS 诱导的白蛋白尿模型中，腹腔注射 ML204（20 mg/kg/天，在 LPS 后 12 和 24 小时注射两次）减轻了 LPS 诱导的足突融合，并显著降低了 WT 小鼠的白蛋白尿。[3]

Rac1激活试验。[3]
Rac1活化试验如前所述进行，但有一些修改。足细胞用300μg/ml PS处理1小时，然后进行收获和Rac1下拉实验。在ML204实验中，在施加PS之前，用30μMML204预处理细胞20分钟。根据制造商的说明，使用与人PAK-1的p21结合结构域（PBD；残基67-150）相对应的GST标记的融合蛋白，用商业Rac1活化测定试剂盒 分析活化的Rac1。下拉后，使用小鼠单克隆Rac1抗体通过免疫印迹检测洗脱的活性Rac1。在用于下拉研究的细胞裂解物中测量总Rac1和GADPH，并作为负载对照。

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电生理学。[3]
膜片钳电生理学是在全细胞结构或外向贴片上进行的。用P-97拉拔器从硼硅酸盐玻璃中拉出电阻为3-4MΩ的贴片移液管，并填充含有135 mM CH3SO3Cs、10 mM CsCl、3 mM MgATP、0.2 mM NaGTP、0.2 mM EGTA、0.13 mM CaCl2和10 mM HEPES（pH 7.3）的CsOH溶液。浴液含有135 mM CH3SO3Na、5 mM CsCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES和10 mM葡萄糖（pH 7.4）以及NaOH。将血管紧张素II（500 nM）、LPS（100μg/ml）和ML204（10μM）应用于浴液。在400毫秒内记录了从-100 mV到+100 mV的全细胞电流，电压斜坡为-60 mV。对于外向配置的单通道记录，我们使用了以20 mV的间隔和0 mV的保持电位进行的-100 mV到+100 mV的电压阶跃协议。填充有移液管溶液的平均移液管电阻为3-5 MΩ。数据以10kHz采样，以5kHz滤波。在分析之前，单通道数据在500Hz下进一步离线滤波。在单通道迹线中，使用手动定义的振幅标准对电流进行理想化，以分配离子通道的打开和关闭过渡。集合平均值表示为Po（平均电流除以单位电流振幅和每个斑块的通道数），并绘制为直方图。所有数据均在室温下采集，并使用pClamp 10进行分析。

PS、LPS和Cch处理培养的足细胞。[3]
以>90%融合生长的分化培养足细胞与1-30μMML204一起孵育20分钟，然后根据需要暴露于300μg/ml PS、100μg/ml LPS或100μM Cch。对于PS实验，一旦通过光学显微镜观察到细胞形态的变化（70-90分钟），就用PBS中的4%多聚甲醛固定细胞15分钟，然后用0.1%Triton X-100透化10分钟。对于LPS和Cch实验，在处理后24小时如上所述固定细胞。为了进行免疫染色，足细胞与突触蛋白“NT”抗体一起孵育，并用Alexa Fluor 488偶联的二抗进行检测。如前所述，肌动蛋白结构用Alexa Fluor 594偶联的鬼笔环肽标记。分析了3项独立试验，每项试验中每种条件3个培养皿，每皿10张图像，细胞密度相当。PS/ML204实验共分析1600-2000个细胞，PS/KD实验共分析1400-1600个细胞。共分析了1000个细胞用于LPS实验，1400个细胞用于Cch实验。通过DAPI染色和ImageJ中的自动脚本分析细胞数量，随后手动校正。如前所述，受影响的细胞被定义为具有非常明亮、凝聚的肌动蛋白染色的塌陷细胞（用于PS实验），或没有明显可见应力纤维的细胞（用于LPS和Cch实验）。图像是用蔡司LSM510立式共聚焦显微镜采集的。使用蔡司Pascal软件采集3-4μm光学切片的图像。通过方差分析和Dunnett多重比较检验评估统计显著性。

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荧光 Ca²⁺ 检测：将稳定表达小鼠 TRPC4β 和 μ-阿片受体的 HEK293 细胞接种于 384 孔板，用 Fluo4-AM 负载，并用 DAMGO 刺激。在加入激动剂前添加化合物，使用荧光酶标仪监测细胞内 Ca²⁺ 变化。[1]
膜电位检测：表达 TRPC6 的 HEK293 细胞用膜电位染料负载，并用乙酰胆碱刺激。测量膜去极化以评估 TRPC6 活性及化合物作用。[1]
FlexStation Ca²⁺ 检测：表达各种 TRP 通道（TRPV1、TRPV3、TRPM8、TRPA1）的 HEK293 细胞接种于 96 孔板，用 Fluo4-AM 负载，并暴露于通道特异性激动剂。监测 Ca²⁺ 内流以评估化合物选择性。[1]

动物/疾病模型： 非禁食雄性 C57BL/6 小鼠（2-3 个月）[4]
剂量： 1 mg/kg
给药途径： 皮下注射，每日两次，持续 5 天（LPS 注射前）
实验结果： LPS 诱导小鼠体温降低可诱发全身炎症反应，并增加死亡率。

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LPS 诱导蛋白尿。[3]
采用先前描述的方法，并进行了一些修改，通过注射 LPS 诱导雄性 WT 和 Trpc5-KO 小鼠（体重 20-25 g）产生蛋白尿。在注射前 48 小时，在代谢笼中收集 24 小时的基础尿液。 LPS（15 μg/g，腹腔注射，1 mg/ml）分别在0小时和24小时时间点腹腔注射两次。PBS（磷酸盐缓冲液）分别在12小时和36小时腹腔注射两次，以防止脱水。ML204（20 mg/kg/d，腹腔注射）分别在12小时和24小时时间点腹腔注射。使用代谢笼收集LPS注射后24小时开始的24小时尿液。为了定量尿白蛋白水平，取10 μl尿液进行SDS-PAGE分析。牛血清白蛋白标准品（0.25、0.5、1.0、2.5和5.0 μg）在同一凝胶上进行电泳，用于鉴定和定量尿白蛋白条带。考马斯亮蓝染色信号使用ImageJ软件进行定量。所得数值（各白蛋白标准条带的面积大小与其平均灰度值的乘积）用于构建标准曲线及其相关的数学函数。随后，将样本条带的数值转换为白蛋白浓度，并外推至24小时总尿量。结果采用方差分析（ANOVA）和Bonferroni多重比较检验进行评估。
为制备用于Western blotting的肾小球裂解液，小鼠按上述方法处理，并在首次注射LPS后36小时处死。通过肾动脉灌注Dynabeads磁珠，以磁性分离高纯度肾小球。从分离的肾小球中提取蛋白质，进行SDS-PAGE和Western blotting分析，方法如前所述，并使用适当的一抗和二抗检测蛋白质。

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PS模型。[3]
成年野生型（WT，n = 15）和Trpc5-KO（n = 7）同窝小鼠用戊巴比妥麻醉，置于37°C的加热垫上，并通过肾动脉以约240 mmHg的压力和9 ml/min的灌注速率对肾脏进行原位灌注，方法如前所述(58)，并进行了一些修改。首先，用HBSS或HBSS加10 μM ML204在37°C下冲洗肾脏2分钟，然后用2 mg/ml PS的HBSS溶液或PS加ML204在37°C下灌注15分钟。在整个实验过程中，所有血管灌注液均保持在 37°C。

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药物治疗[4]
在诱导 SIRS 前 3 天，C57BL/6、TRPC5+/+ 和 TRPC5−/− 小鼠接受皮下注射含有细菌 Trx（20 μg/150 μl/只，每日两次；来自大肠杆菌）的磷酸盐缓冲液 (PBS)。为了评估 TRPC4 和 TRPC5 复合物在 LPS 诱导反应中的作用，C57BL/6 小鼠接受 ML204 [16, 21]（1 mg/kg，150 μl/只，每日两次）治疗 5 天，然后注射 LPS。在另一组实验中，C57BL/6小鼠单独接受ML204（1 mg/kg，每日两次；溶于6%二甲基亚砜（DMSO）的PBS溶液中）治疗2天，然后在LPS攻击前3天，将该药物与细菌Trx（20 μg/只，每日两次）共同注射。载体处理的小鼠作为对照。PS灌注模型：成年野生型小鼠麻醉后，通过肾动脉进行原位肾脏灌注。用HBSS（含或不含10 µM ML204）冲洗2分钟后，继续用2 mg/ml PS的HBSS溶液（含或不含10 µM ML204）在37°C下灌注15分钟。然后固定肾脏进行TEM分析。 [3]LPS诱导的蛋白尿模型：雄性野生型小鼠腹腔注射LPS（15 µg/g），分别于0小时和24小时注射两次。于12小时和36小时注射PBS以防止脱水。在首次注射LPS后12小时和24小时腹腔注射ML204（20 mg/kg/天）。从首次注射LPS后24小时开始收集尿液，持续24小时，用于白蛋白定量。取出肾脏进行肾小球分离和透射电镜（TEM）观察。[3]

[1]. Identification of ML204, a novel potent antagonist that selectively modulates native TRPC4/C5 ion channels. J Biol Chem. 2011 Sep 23;286(38):33436-46.

[2]. Novel Chemical Inhibitor of TRPC4 Channels. Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program [Internet].

[3]. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J Clin Invest. 2013 Dec 2; 123(12): 5298–5309.

[4]. Transient Receptor Potential Canonical Channels 4 and 5 Mediate Escherichia coli-Derived Thioredoxin Effects in Lipopolysaccharide-Injected Mice. Oxid Med Cell Longev. 2018 Jun 10;2018:4904696.

瞬时受体电位经典（TRPC）通道是钙离子（Ca²⁺）通透性非选择性阳离子通道，参与多种生理功能，包括平滑肌收缩和突触传递。然而，由于缺乏高效的选择性TRPC通道药理抑制剂，限制了对这些通道在生理系统中作用的深入研究。本文报道了一种新型高效选择性TRPC4通道抑制剂ML204的鉴定和表征。我们对分子库小分子库（Molecular Libraries Small Molecule Repository）中的305,000个化合物进行了高通量荧光筛选，以寻找能够阻断小鼠TRPC4β通道被μ-阿片受体刺激后细胞内Ca²⁺升高的抑制剂。ML204以0.96 μM的IC₅₀值抑制TRPC4β介导的细胞内Ca²⁺升高，并且对毒蕈碱受体偶联的TRPC6通道激活具有19倍的选择性。在全细胞膜片钳记录中，ML204阻断了由μ-阿片受体刺激或胞内透析鸟苷5'-3-O-(硫代)三磷酸(GTPγS)激活的TRPC4β电流，表明ML204与TRPC4通道直接相互作用，而非干扰信号转导通路。选择性研究表明，10-20 μM ML204对小鼠背根神经节神经元中的TRPV1、TRPV3、TRPA1和TRPM8，以及KCNQ2和天然电压门控钠、钾、钙通道均无明显阻断作用。在分离的豚鼠回肠肌细胞中，ML204阻断了由灌注卡巴胆碱或胞内灌注GTPγS激活的毒蕈碱阳离子电流，证明其对天然TRPC4电流有效。因此，ML204 是一种研究 TRPC4 通道功能的优秀新型工具，并可能促进靶向 TRPC4 的治疗药物的开发。[1]

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ML204 是通过对 MLSMR 化合物库进行高通量荧光筛选和活性化合物的构效关系分析而鉴定出的新型 TRPC4 通道抑制剂。ML204 能抑制 μ-阿片受体激活的 TRPC4 通道的钙离子内流，IC50 值为 0.96 μM，并且在类似的荧光检测中对 TRPC6 通道表现出 19 倍的选择性。ML204 在电生理检测中能阻断 TRPC4 通道，IC50 值为 2.6 μM，并且在 TRPC4 通道被不同机制激活的荧光和电生理检测中也具有活性，表明其能直接阻断 TRPC4 通道。通过荧光和电生理实验，我们检测了 ML204 对 TRPC4 通道阻断的选择性，并将其与密切相关的 TRPC 通道、亲缘关系较远的 TRPV、TRPA 和 TRPM 通道以及非 TRP 离子通道进行了比较。 ML204 对 TRPC6 通道具有良好的选择性（19 倍），对 TRPC3 和 TRPC5 通道的选择性稍低（9 倍）。未观察到对 TRPV、TRPA、TRPM 或电压门控离子通道的阻断作用。ML204 具有适用于多种体外研究的特性。[2]

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完整的肾脏滤过功能对于血液中必需蛋白质的保留和体内废物的清除至关重要。滤过屏障的损伤会导致尿液中白蛋白的丢失，这是心血管疾病和肾衰竭的标志。我们发现离子通道 TRPC5 介导了滤过屏障的损伤。利用 Trpc5 敲除小鼠、TRPC5 小分子抑制剂、分离肾小球中的 Ca2+ 成像以及足细胞肌动蛋白动态的活体成像，我们确定 TRPC5 的缺失或其抑制会阻断足细胞骨架的重塑。抑制或缺失TRPC5可阻止小GTP结合蛋白Rac1的激活并稳定突触蛋白。重要的是，TRPC5的基因缺失或药理学抑制可保护小鼠免受蛋白尿的侵害。这些数据表明，钙离子通透性通道TRPC5是蛋白尿的重要决定因素，并确定TRPC5抑制可作为预防或治疗蛋白尿性肾病的一种治疗策略。[3]硫氧还蛋白在细菌抗氧化机制和毒力中发挥着至关重要的作用；然而，其在宿主中的调节作用尚不完全清楚。人硫氧还蛋白（Trx）的减少可激活炎症中的瞬时受体电位经典5（TRPC5），但尚无证据表明这些受体是否介导细菌硫氧还蛋白在宿主中的作用。重要的是，TRPC5可以与其他亚基（例如TRPC4）形成功能性复合物。本文中，大肠杆菌来源的硫氧还蛋白可诱导脂多糖（LPS）注射小鼠死亡，并伴有白细胞聚集减少、细胞因子释放入腹膜的调节以及腹膜巨噬细胞介导的吞噬作用受损。[4]

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ML204是从分子库小分子库中305,000个化合物的高通量筛选中发现的。
它是一种新型、高效且相对选择性的TRPC4和TRPC5通道拮抗剂，与现有的TRPC阻滞剂（如SKF96365和2-APB）相比，具有更优异的选择性。
该化合物有望成为研究天然组织中TRPC4/C5功能的有效药理学工具，并可能促进靶向这些通道的治疗药物的开发。[1]

C15H18N2

226.32

226.147

5465-86-1

ML204 hydrochloride;2070015-10-8

230710

Light yellow to yellow ointment

1.1±0.1 g/cm3

404.4±33.0 °C at 760 mmHg

198.4±25.4 °C

0.0±0.9 mmHg at 25°C

1.617

3.92

16.13

0

2

1

17

247

0

N1(C2C([H])=C(C([H])([H])[H])C3=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C3N=2)C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H]

USYRQXDHKXGTCK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H18N2/c1-12-11-15(17-9-5-2-6-10-17)16-14-8-4-3-7-13(12)14/h3-4,7-8,11H,2,5-6,9-10H2,1H3

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (11.05 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (11.05 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (11.05 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。