MLL1-WDR5 PPI (IC50 = 2.4 nM)
MM-102 TFA: MLL1/WDR5 protein-protein interaction (Ki < 1 nM) [1]

在携带 MLL1-AF9 融合基因的白血病细胞中，MM-102（HMTase 抑制剂 IX）可降低 MLL1 甲基转移酶活性以及 MLL-1 诱导的 HoxA9 和 Meis-1 基因表达。含有 MLL1 融合蛋白的白血病细胞也经历了细胞增殖减少和死亡。在 HMT 实验中，MM-102 (TFA) 的 IC50 为 0.4-0.9 μM，对 WDR5 表现出最强的抑制作用和最高的结合亲和力[1]。分别携带 MLL1-AF4 和 MLL1-ENL 融合蛋白 MV4;11 和 KOPN8 的白血病细胞系的增殖能力被 MM-102（HMTase 抑制剂 IX）以剂量依赖性方式抑制 [1]。 MM-102，也称为 HMTase Inhibitor IX，在 75 μM 浓度下完全抑制这些细胞系中的细胞生长，IC50 为 25 μM[1]。 MM-102（HMTase 抑制剂 IX）可有效、选择性地抑制白血病细胞的增殖并诱导其凋亡。 MLL1融合蛋白或野生型MLL1蛋白对白血病细胞没有显着影响[1]。

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1. 在完全重组的体外H3K4甲基转移酶活性检测体系中，MM-102 TFA可强效拮抗MLL1的酶活性[1]
2. 小鼠肾近端小管上皮细胞（RPTCs）暴露于20 μM顺铂环境中时，先采用50 μM的MM-102 TFA预处理1 h再给予顺铂作用24 h，该药物可抑制细胞凋亡、降低p53磷酸化水平、维持E-钙黏蛋白的表达、下调MLL1、WDR5及H3K4me3的蛋白水平，同时还能阻断顺铂诱导的DNA损伤应答（DDR），具体表现为ATM、ATR、Chk1、Chk2蛋白去磷酸化、γ-H2AX表达受抑，且可抑制细胞周期停滞（p21及磷酸化组蛋白H3第10位丝氨酸表达降低）[2]
3. 对于携带MLL1融合蛋白的白血病细胞，MM-102 TFA可特异性抑制其增殖并诱导细胞凋亡[1]

MM-102减轻小鼠顺铂给药后AKI [2]
为了研究MLL1/WDR5在顺铂诱导AKI中的作用，小鼠在顺铂给药前2小时用MLL1/WDR5复合物抑制剂MM102或载药（20 mg/kg，腹腔注射）治疗。然后每天给予MM102，连续三天。注射顺铂后72h采集血液和肾脏组织。血尿素氮（BUN）和血清肌酐（SCr）作为肾功能指标。如图1A所示，顺铂组BUN水平明显高于对照组（6.217±0.374 vs. 2.420±0.470 mmol/L） （***P < 0.001）；MM102治疗使顺铂组BUN降低至3.172±0.114 mmol/L （**P < 0.01）。单用顺铂组SCr为68.126±10.217 μmol/L（图1B），高于对照组（10.322±2.135 μmol/L） （**P < 0.01）；MM102处理显著降低SCr为20.922±4.016 μmol/L (**P < 0.01)；单独使用MM102对BUN或SCr的影响很小。

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MM-102可减少细胞凋亡，同时降低p53磷酸化水平，保留E-cadherin在体内的表达[2]
IF染色显示，相对于假手术肾脏，暴露于顺铂的肾脏中中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白（中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白，AKI的早期生物标志物）增加。给药MM102显著降低了顺铂损伤肾脏中NGAL的表达（图2A， B）。与此一致，tdt介导的dUTP-X镍端标记（TUNEL）染色显示损伤肾脏中凋亡细胞数量增加，MM102在很大程度上抑制了这种反应（图2A， C）。此外，通过免疫印迹分析检测到顺铂给药后肾脏中NGAL表达增加，caspase-3 （C-cas3，一种公认的细胞凋亡标志物）的切割；MM102治疗使这些变化恢复到基础水平。

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1. 转导了MLL1-AF9融合基因的骨髓细胞经MM-102 TFA处理96 h后，MLL1融合蛋白介导白血病发生过程中的两个关键靶基因HoxA9和Meis-1的表达水平出现显著下调（以GAPDH为内参进行标准化）[1]
2. 在顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）小鼠模型中（顺铂给药剂量为20 mg/kg），于顺铂注射前2 h腹腔注射15 mg/kg的MM-102 TFA，之后连续3天每日给药1次，该药物可改善小鼠肾功能（降低血尿素氮（BUN）和血清肌酐（Scr）水平）、减轻肾小管损伤与细胞凋亡、抑制MLL1、WDR5及H3K4me3的表达、促进p53去磷酸化、维持E-钙黏蛋白的表达，同时还能抑制顺铂引发的DDR（使ATM、ATR、Chk1、Chk2去磷酸化，抑制γ-H2AX表达）并阻止细胞周期停滞（降低p21及磷酸化组蛋白H3第10位丝氨酸的表达）[2]

竞争结合试验[1]
采用基于荧光偏振（FP）的竞争结合法测定所有合成化合物的结合亲和力；这个实验的细节已经在前面描述过了。

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体外组蛋白甲基转移酶（HMT）测定[1]
HMT检测在50 mM HEPES pH 7.8、100 mM NaCl、1.0 mM EDTA和5%甘油中进行，温度为22°C。每个反应含有1.5 μCi的辅助因子3h - s -腺苷蛋氨酸。以h310 -残基肽为底物，深度为50 μM。加入浓度为0.125 ~ 128 μM的化合物，并与预组装好的WDR5/RbBP5/ASH2L复合物一起孵育，每个蛋白的终浓度为0.5 μM，孵育2-5分钟。加入终浓度为0.5 μM的MLL1蛋白开始反应，并允许进行30分钟，然后准备闪烁计数。为了对样品进行计数，将反应在P81滤纸 的单独正方形上进行标记，并将其浸入新鲜配制的pH为9.0的50 mM碳酸氢钠缓冲液中沉淀。洗涤和干燥后，样品在Ultima Gold闪烁液中旋转并计数。作为阴性对照，用0.5 μM MLL1/WDR5/RbBP5/ASH2L复合物与非相互作用突变体WDR5D107A组装进行检测。

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1. 针对重组MLL1核心复合物的H3K4甲基转移酶活性检测，采用闪烁计数器法来测定MM-102 TFA对MLL1酶活性的抑制作用，将该化合物加入检测体系中，评估其拮抗MLL1介导的组蛋白甲基化的能力[1]
2. 采用基于荧光偏振（FP）的结合实验来测定MM-102 TFA与WDR5的竞争性结合曲线，以此评估该化合物与靶蛋白的结合亲和力[1]

HOXA9和MEIS-1基因的qRT-PCR分析[1]
用MLL1-AF9致癌基因转染正常小鼠骨髓细胞，获得MLL1-AF9转化的小鼠骨髓细胞，方法由Tan等描述。 MM-102和C-MM-102溶解于DMSO中。转化后的细胞分别用MM-102 (25 μM, 50 μM)、C-MM-102 （50 μM）和Mock （0.2% DMSO）处理，所有样品的终浓度均为0.2% DMSO。用Trizol和RNEASY试剂盒按照前面描述的方法处理96小时后，从MLL1-AF9转导的小鼠骨髓细胞中分离总RNA利用SuperScript III试剂盒随机引物生成cDNA。在SYBR染料存在的情况下，用每种基因特异性引物对HoxA9、Meis1和GAPDH基因进行实时PCR扩增。每个基因转录物的相对定量按照我们之前的工作进行在归一化到内部负载控制（例如，GAPDH或总输入RNA）后，将结果呈现为模拟处理的相对表达。

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白血病细胞系细胞生长和凋亡的研究[1]
MV4;11， KOPN8和K562细胞是来自密歇根大学Jolanta Grembecka博士的慷慨馈赠。MV4；11、KOPN8和K562细胞在添加10%胎牛血清和100 U/L青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基（ATCC）中培养，在37℃、5% CO2下培养。将细胞以5 × 105 /孔（1ml）的密度接种于12孔板中悬浮，用载体对照（DMSO, 0.2%）或MM-102处理7天。每2天更换一次培养基，并补充化合物。

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1. 白血病细胞相关实验中，将携带MLL1融合蛋白的白血病细胞用MM-102 TFA处理后，连续7天监测细胞增殖情况以评估药物的抗增殖作用；处理96 h后检测细胞凋亡情况，明确药物的促凋亡活性[1]
2. 骨髓细胞实验中，将转导MLL1-AF9融合基因的骨髓细胞用MM-102 TFA处理96 h，通过PCR技术检测HoxA9和Meis-1的表达水平，并以GAPDH为内参进行标准化，以此评价药物对MLL1靶基因的调控作用[1]
3. RPTCs相关实验中，先以50 μM的MM-102 TFA预处理细胞1 h，再给予20 μM顺铂作用24 h；采用CCK8法检测细胞活力，TUNEL染色评估细胞凋亡，Western blot检测相关蛋白（活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、磷酸化p53、p53、E-钙黏蛋白、MLL1、WDR5、H3K4me3、ATM、ATR、Chk1、Chk2、p21、磷酸化组蛋白H3第10位丝氨酸）的表达；部分实验中，还会在给药及顺铂处理前，先转染靶向MLL1、WDR5、E-钙黏蛋白或p53的小干扰RNA，以进一步探究药物作用机制[2]

急性肾损伤（AKI）动物模型及治疗[2]
雄性C57BL/6J小鼠（6-8周龄，体重20-25 g）购自杰克逊实验室（Jackson Laboratory）。小鼠随机分为四组：（1）对照组，（2）MM-102组，（3）顺铂组，（4）MM-102联合顺铂组。顺铂以20 mg/kg的剂量腹腔注射。MM-102（15 mg/kg）溶于含10% DMSO和90%玉米油的溶剂中，于顺铂注射前2 h腹腔注射，之后连续3天每日一次。MM-102的剂量参考既往报道。对照组和顺铂组小鼠注射等量的溶剂。对照组和MM-102组小鼠均注射等体积的生理盐水。所有小鼠在顺铂注射后72小时处死。采集血液样本和肾脏组织进行进一步分析。所有实验方案均按照美国国立卫生研究院《实验动物饲养和使用指南》执行，并经Lifespan动物福利委员会批准。实验动物使用许可编号为5074-19。

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1. 在急性白血病相关的体内实验中，使用转导了MLL1-AF9融合构建体的骨髓细胞，该细胞模型的MM-102 TFA处理时间为96小时，以检测靶基因的表达[1]
2. 在顺铂诱导的AKI小鼠模型中，腹腔注射MM-102 TFA，剂量为15 mg/kg；在注射顺铂（20 mg/kg，腹腔注射）前 2 小时进行给药，然后连续三天每天给予相同剂量；所有小鼠在注射顺铂 72 小时后处死，并收集血液样本和肾脏组织，用于随后检测肾功能指标（BUN、Scr）、病理切片染色（PAS 染色）、相关蛋白的免疫印迹分析和靶蛋白的免疫荧光染色[2]。

[1]. High-affinity, small-molecule peptidomimetic inhibitors of MLL1/WDR5 protein-protein interaction. J Am Chem Soc. 2013, 135(2), 669-682.

[2]. Histone methyltransferase MLL1 drives renal tubular cell apoptosis by p53-dependent repression of E-cadherin during cisplatin-induced acute kidney injury. Cell Death Dis . 2022 Sep 6;13(9):770.

混合谱系白血病1 (MLL1) 是一种组蛋白H3赖氨酸4 (H3K4) 甲基转移酶，靶向MLL1酶活性已被提出作为治疗携带MLL1融合蛋白的急性白血病的新型治疗策略。MLL1/WDR5蛋白-蛋白相互作用对MLL1酶活性至关重要。在本研究中，我们基于MLL1的最小结合基序-CO-ARA-NH-，设计了大量靶向MLL1/WDR5相互作用的肽模拟物。我们的研究设计出了高亲和力肽模拟物，这些肽模拟物与WDR5的结合亲和力（K_i < 1 nM）在完全重组的体外H3K4甲基转移酶活性测定中表现出对MLL1活性的强效拮抗作用。两种强效肽模拟物与WDR5复合物的共晶结构测定，揭示了它们与WDR5高亲和力结合的结构基础。其中一种肽模拟物MM-102在转染了MLL1-AF9融合构建体的骨髓细胞中的评估结果表明，该化合物能有效降低HoxA9和Meis-1的表达，这两个基因是MLL1融合蛋白介导的白血病发生过程中的关键靶基因。MM-102还能特异性抑制携带MLL1融合蛋白的白血病细胞的生长并诱导其凋亡。我们的研究首次验证了设计WDR5/MLL1蛋白-蛋白相互作用小分子抑制剂作为治疗携带MLL1融合蛋白的急性白血病的新型治疗方法的概念。[1]混合谱系白血病1 (MLL1) 是一种组蛋白H3赖氨酸4 (H3K4) 甲基转移酶，它与WD重复结构域5 (WDR5) 相互作用，从而调节细胞存活、增殖和衰老。MLL1在急性肾损伤 (AKI) 发病机制中的作用尚不清楚。在本研究中，我们发现顺铂诱导的小鼠AKI肾小管细胞中MLL1、WDR5和三甲基化H3K4 (H3K4me3) 表达上调，同时p53磷酸化水平升高，E-钙黏蛋白表达降低。选择性MLL1/WDR5复合物抑制剂MM102的给药可改善肾功能，减轻肾小管损伤和细胞凋亡，同时抑制MLL1、WDR5和H3K4me3的表达，使p53去磷酸化，并维持E-钙黏蛋白的表达。在培养的小鼠肾近端小管细胞（RPTCs）中，用顺铂处理后，MM102治疗或转染MLL1或WDR5的siRNA均可抑制细胞凋亡和p53磷酸化，同时维持E-钙黏蛋白的表达；用Pifithrin-α抑制p53可降低顺铂诱导的细胞凋亡，但不影响MLL1、WDR5和H3K4me3的表达。有趣的是，沉默E-钙黏蛋白可抵消MM102的细胞保护作用，但对p53磷酸化没有影响。这些研究结果表明，MLL1/WDR5激活p53，进而抑制E-钙黏蛋白，最终导致顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）期间的细胞凋亡。进一步研究表明，MM102能有效抑制顺铂诱导的DNA损伤反应（DDR），表现为共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ATM）和ATM及Rad-3相关蛋白（ATR）的去磷酸化、检查点激酶1和2（Chk1和Chk2）的去磷酸化、γ-H2AX的抑制以及细胞周期阻滞的抑制（表现为体外和体内p21表达降低以及丝氨酸10位点磷酸化组蛋白H3的减少）。总体而言，我们发现 MLL1 是一种新型的 DDR 调节因子，它通过调节 MLL1/WDR5/ATR/ATM-Chk-p53-E-cadherin 轴驱动顺铂诱导的 RPTC 细胞凋亡和 AKI。靶向 MLL1/WDR5 复合物可能具有治疗 AKI 的潜力。[2]

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1. MM-102 TFA 是一种高亲和力小分子肽模拟抑制剂，其设计基于源自 MLL1 的最小结合基序 -CO-ARA-NH-，旨在靶向 MLL1/WDR5 蛋白-蛋白相互作用；MM-102 TFA 与 WDR5 复合物的共晶体结构阐明了其与 WDR5 高亲和力结合的结构基础。[1]
2.在顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）中，MM-102 TFA 通过调节 MLL1/WDR5-/ATR/ATM-Chk-p53-E-cadherin 轴发挥其保护作用。其中，MLL1/WDR5 激活 p53 以抑制 E-cadherin，从而导致细胞凋亡。MM-102 TFA 可以阻断该通路，从而减少肾小管细胞凋亡[2]。3. MM-102 TFA 的相关技术已授权给亚盛集团；研究人员之一王少萌是亚盛集团的联合创始人，持有该公司股份并担任顾问[1]。

C37H50F5N7O6

783.828226566315

783.374

C, 56.70; H, 6.43; F, 12.12; N, 12.51; O, 12.25

1883545-52-5

MM-102;1417329-24-8

71520620

White to off-white solid powder

218

7

12

16

55

1170

1

CCC(CC)(C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC1(CCCC1)C(=O)NC(C2=CC=C(C=C2)F)C3=CC=C(C=C3)F)NC(=O)C(C)C.C(=O)(C(F)(F)F)O

ZRKTWBXVGMHWHM-YCBFMBTMSA-N

InChI=1S/C35H49F2N7O4.C2HF3O2/c1-5-34(6-2,43-29(45)22(3)4)31(47)41-27(10-9-21-40-33(38)39)30(46)44-35(19-7-8-20-35)32(48)42-28(23-11-15-25(36)16-12-23)24-13-17-26(37)18-14-24;3-2(4,5)1(6)7/h11-18,22,27-28H,5-10,19-21H2,1-4H3,(H,41,47)(H,42,48)(H,43,45)(H,44,46)(H4,38,39,40);(H,6,7)/t27-;/m0./s1

N-[bis(4-fluorophenyl)methyl]-1-[[(2S)-5-(diaminomethylideneamino)-2-[[2-ethyl-2-(2-methylpropanoylamino)butanoyl]amino]pentanoyl]amino]cyclopentane-1-carboxamide;2,2,2-trifluoroacetic acid

MM-102 TFA; MM-102 trifluoroacetic acid; MM-102; MM 102; MM102;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 100 mg/mL (~127.58 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.19 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.19 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.19 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。