TOPK (IC50 = 2.6 nM)
Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases (TOPK/PBK) [2]

体外活性：OTS514 强烈抑制 TOPK 阳性癌细胞的生长。它还对卵巢癌细胞系显示出显着的生长抑制作用，IC50 值为 3.0 至 46 nM。 OTS514对5种肾癌细胞系VMRC-RCW、Caki-1、Caki-2、769-P和786-O具有生长抑制作用，其中TOPK高表达。 IC50 值范围为 19.9 至 44.1 nM 细胞测定：细胞在补充有 20% 胎牛血清和 1×StemSpan CC100 的 RPMI 中培养。用 OTS514（20 或 40 nM）或 OTS964（100 或 200 nM）处理细胞 48 小时。收集的细胞用PBS洗涤并重悬于100ml PBS中，随后用CD41a抗体在室温下染色20分钟。最后，再次用PBS洗涤细胞，然后通过流式细胞术分析CD41a染色。使用抗STAT5抗体通过蛋白质印迹检查STAT5的表达。

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在一系列人骨髓瘤细胞系（HMCL）中，OTS514 在纳摩尔浓度下即可诱导细胞周期停滞和凋亡。[2]
- 它能抑制多发性骨髓瘤（MM）患者来源的外周血单个核细胞中推定的 CD138⁺ 干细胞群的增殖。[2]
- 在 MM 患者的骨髓细胞中，与 CD138⁻ 细胞亚群相比，OTS514 处理能优先杀伤恶性 CD138⁺ 浆细胞。[2]
- OTS514 处理 HMCL 后，可上调 FOXO3 及其转录靶点 CDKN1A（p21）和 CDKN1B（p27）的表达，诱导细胞凋亡，降低 FOXM1 的表达，并破坏 AKT、p38 MAPK 和 NF-κB 信号通路。[2]
- OTS514 的作用不受 p53 突变或缺失状态的影响。[2]
- OTS514 与来那度胺联合处理 HMCL 时，产生协同的抗骨髓瘤效应。[2]
- 对于 OTS514 耐药细胞系 8226 Dox40，在存在 10 µM 维拉帕米（可阻断 ABCB1 活性）的条件下培养，可恢复其对 OTS514 的敏感性。[2]
- 经血清饥饿诱导 G1 期停滞的 MM1.S 和 U266 细胞，在解除饥饿后用 10 nM OTS514 处理 24 h，通过碘化丙啶染色流式细胞术分析显示细胞 DNA 含量发生改变。[2]
- 用 100 nM OTS514 处理 HMCL 0-24 h，Western blot 检测显示 4 h 后出现半胱天冬酶介导的 PARP 切割（凋亡标志）。[2]
- 用 OTS514 处理 MM1.S 和 U266 细胞 24 h，Western blot 分析显示 TOPK 蛋白水平呈剂量依赖性降低。[2]

对人类肺癌细胞的小鼠异种移植研究证明了 OTS514 的体内功效，但发现该化合物也会引起严重的造血毒性 [红细胞 (RBC) 和白细胞 (WBC) 减少，并伴有血小板显着增加。与赋形剂对照相比，口服 OTS514 显着延长了 ES-2 腹部播散异种移植模型的总生存期（P < 0.001）。

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在使用 NSG 小鼠（NOD/SCID/IL2Rg）建立的 H929 细胞侵袭性异种移植模型中，每周 5 次口服给予 100 mg/kg OTS514 耐受性良好。根据初始移植细胞量（1×10⁶ 或 2×10⁶ 个细胞）的不同，与对照组相比，OTS514 可使肿瘤体积缩小 48%-81%。[2]

如前所述，通过蛋白质印迹检测TOPK的表达和组蛋白H3（Ser10）的磷酸化。用于蛋白质印迹的其他抗体如下：c-Src（1:1000）、Fyn（1:1000”）和Lyn（1:1000“）。使用细胞计数试剂盒-8通过比色测定法测量体外细胞存活率。将细胞（100μl）以产生连续线性生长的密度（A549，1×103个细胞；LU-99，2×103个电池；DU4475，4×103个手机；MDA-MB-231，3×103个电脑；T47D，3×104个手机；Daudi，5×103个汽车；UM-UC-3，1×105个手机；HCT-116，1×104个汽车；MKN1，2×104个电脑；MKN45，4×105个电脑；HepG2，4×107个电脑；MIAPaca-2，2×107个手机；22Rv1，6×103个；HT29，3×105个汽车）铺在96孔板中。在37°C下暴露于化合物72小时之前，让细胞粘附过夜。用分光光度计在450nm波长下读取板。所有检测均一式三份。在测量IC50值后，我们计算z分数以产生P值。在IC50值（nM）的对数转换（基数10）后，计算13个TOPK阳性细胞系的IC50对数值的平均值和SD。OTS514的平均值和标准差分别为0.76和0.23，OTS964分别为1.53和0.26。然后，根据HT29 IC50值，OTS514和OTS964的z得分分别为6.44和3.62[1]。

人造血干细胞的体外分化[1]
从健康供体的生长因子动员外周血中纯化CD34+HSC，然后在添加了20%胎牛血清和1×StemSpan CC100的RPMI中培养细胞。用OTS514（20或40 nM）或OTS964（100或200 nM）处理细胞48小时。收集的细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，重新悬浮在100μl PBS中，然后在室温下用CD41a抗体染色20分钟。最后，再次用PBS洗涤细胞，然后在BD FACSCalibur上通过流式细胞术分析CD41a染色。用抗STAT5抗体通过蛋白质印迹检测STAT5的表达。

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微阵列分析[2]
5×105 H929细胞用0.015%DMSO、15 nMOTS514、15µM来那度胺（LEN）或5 nM卡非佐米（CFZ）处理24小时。此外，还进行了每种活性药物组合（OTS514/LEN、OTS514/CFZ、OTS514/LEN/CFZ和LEN/CFZ）。使用Qiagen RNeasy迷你试剂盒提取来自三个独立实验（共24个样本）的RNA，并在芝加哥大学功能基因组学核心设施的两个人类HT12v4珠阵列上进行分析。使用分子特征数据库v6.1.27中的标志基因集对分位数标准化、背景减除的数据进行基因集富集分析（GSEA），28通过使用独创性途径分析生成上游调控因子分析。

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细胞在补充有1×StemSpan CC100和20%胎牛血清的RPMI中培养。将细胞暴露于 OTS964（100 或 200 nM）或 OTS514（20 或 40 nM）48 小时。 PBS 洗涤并重悬于 100 毫升 PBS 后，使用 CD41a 抗体在室温下对收集的细胞染色 20 分钟。最终，细胞再进行一次 PBS 洗涤，然后进行流式细胞术分析 CD41a 染色。使用抗 STAT5 抗体，使用蛋白质印迹来测量 STAT5 表达。

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MTT 法细胞活力检测：将人骨髓瘤细胞系（HMCL）与不同浓度的 OTS514 共同培养 72 h，采用 MTT 法评估细胞活力。对于 OTS514 耐药的 8226 Dox40 细胞系，同时加入 10 µM 维拉帕米以阻断 ABCB1 活性，再进行 MTT 检测。[2]
- 细胞周期分析：将 MM1.S 和 U266 细胞经血清饥饿过夜诱导 G1 期停滞，解除饥饿后，分为未处理组和 10 nM OTS514 处理组，培养 24 h 后，采用碘化丙啶染色流式细胞术分析细胞 DNA 含量，以评估细胞周期分布。[2]
- PARP 切割 Western blot 检测：用 100 nM OTS514 处理 HMCL 0-24 h，通过 Western blot 检测 PARP 切割情况，以评估细胞凋亡程度。[2]
- TOPK 蛋白 Western blot 检测：用不同浓度 OTS514 处理 MM1.S 和 U266 细胞 24 h，通过 Western blot 分析 TOPK 蛋白表达水平，以观察药物对靶点蛋白的剂量依赖性影响。[2]
- 患者来源细胞凋亡流式细胞术检测：将 MM 患者的骨髓单个核细胞与不同浓度的 OTS514 共同培养，18 h 后收集细胞，采用 Annexin V/PI 双染色流式细胞术分析 CD138⁺ 浆细胞亚群和 CD138⁻ 细胞亚群的晚期凋亡情况。[2]
- CD138⁺ 细胞增殖抑制实验：将 MM 患者来源的外周血单个核细胞（PBMC）分为加或不加 5 ng/mL IL-3 和 IL-6、加或不加 10 nM OTS514 的各组，培养 6 天后，通过磁珠分选法分离 CD138⁺ 细胞，评估 OTS514 对 CD138⁺ 细胞增殖的抑制作用。[2]
- 与来那度胺的协同作用实验：采用 MTT 法，分别用 OTS514、来那度胺以及两者的恒定比例组合（OTS514:来那度胺 = 1:6 和 1:12 摩尔当量）处理细胞，评估协同抗骨髓瘤效应。用不同浓度 OTS514 单独或联合来那度胺处理 H929 细胞 24 h，通过 Western blot 检测 IKAROS（IKZF1）、IRF4 和 FOXM1 的表达水平。此外，用 20 µM 来那度胺、100 nM OTS514 或两者组合处理 MM1.S 细胞，以 DMSO 为对照，采用 Amplex 红色过氧化物酶活性测定法检测相关活性。[2]
- 下游信号通路 Western blot 分析：用不同浓度 OTS514 处理 H929、8226 和 KMS11 细胞 24 h，采用 LI-COR 近红外检测系统进行 Western blot 分析，评估 p21/p27 及其他相关蛋白的表达水平。用 15 nM OTS514 处理 H929、U266、MM1.S、8226 和 KMS11 细胞 24 h，采用磷酸化特异性抗体进行 Western blot 检测 IκBα、p38、AKT 和 FOXM1 的磷酸化水平，随后剥离膜并重新杂交以检测这些靶点的总蛋白水平。[2]

携带A549细胞异种移植模型的雌性BALB/cSLC-nu/nu小鼠[1]
1、2.5和5 mg/kg
静脉注射；每日一次，持续2周

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体内异种移植研究[1]
将A549细胞（1 × 10⁷个细胞）或LU-99细胞（5 × 10⁶或1 × 10⁷个细胞）皮下注射到雌性BALB/cSLC-nu/nu小鼠左侧腹部。当A549异种移植瘤平均体积达到200 mm³或LU-99异种移植瘤平均体积达到150或200 mm³时，将动物随机分为6只一组。当对LU-99异种移植瘤进行较长时间（>14天）的肿瘤监测时，起始肿瘤体积设置为150 mm³，因为LU-99细胞生长速度极快，而200 mm³的起始体积会因动物伦理问题而限制观察时间（例如，接种200 mm³的LU-99肿瘤在第15天平均肿瘤体积达到约1100 mm³，而A549肿瘤在第15天达到约490 mm³）。静脉给药时，化合物配制于5%葡萄糖溶液中，经尾静脉注射。口服给药时，化合物（例如OTS514）配制于0.5%甲基纤维素溶液中，并按指定剂量和方案进行灌胃给药。两种给药途径的给药体积均为10 ml/kg体重。浓度在正文和图表中均有说明。肿瘤体积使用游标卡尺测量。通过公式“长×宽²×1/2”将结果转换为肿瘤体积（mm³）。小鼠体重在同一天测定，作为耐受性的指标。动物实验分别在KAC有限公司（A549异种移植瘤）和OncoTherapy Science公司（LU-99异种移植瘤）进行，均符合各机构的《实验动物饲养和使用指南》。肿瘤生长指数（TGI）根据公式[1 − (T − T0)/(C − C0)] × 100计算，其中T和T0分别为实验组第15天或第22天和第1天的平均肿瘤体积，C和C0分别为载体对照组的平均肿瘤体积。白细胞计数在KAC有限公司使用Sysmex XT-1800iV分析仪（Sysmex公司）或使用细胞计数板进行。血液采集于含EDTA的采血管中，以防止血液凝固并进行血细胞计数。

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异种移植模型建立：使用NSG小鼠（NOD/SCID/IL2Rg）建立H929细胞异种移植模型，每组6只小鼠。[2]
- 给药：当肿瘤体积达到100 mm³时，小鼠开始口服OTS514，剂量为100 mg/kg，每周5天。[2]
- 监测：定期测量肿瘤体积以评估抗肿瘤效果，并在整个治疗过程中监测体重以评估耐受性。[2]

在小鼠异种移植模型中，每周 5 天口服 100 mg/kg 的 OTS514 耐受性良好，治疗期间体重保持稳定，未观察到明显不良反应。[2]

[1]. TOPK inhibitor induces complete tumor regression in xenograft models of human cancer through inhibition of cytokinesis. Sci Transl Med. 2014 Oct 22;6(259):259ra145.

[2]. Potent anti-myeloma activity of the TOPK inhibitor OTS514 in pre-clinical models. Cancer Med. 2020 Jan;9(1):324-334.

TOPK（T淋巴因子激活的杀伤细胞来源蛋白激酶）在多种癌组织中，包括肺癌和三阴性乳腺癌，均被高度且频繁地激活，并在癌细胞有丝分裂中发挥着不可或缺的作用。我们报道了一种强效TOPK抑制剂OTS964 {(R)-9-(4-(1-(二甲氨基)丙-2-基)苯基)-8-羟基-6-甲基噻吩并[2,3-c]喹啉-4(5H)-酮}的开发，该抑制剂能够以高亲和力和选择性抑制TOPK激酶活性。与TOPK小干扰RNA (siRNA)的敲低作用类似，该抑制剂在体外以及人肺癌异种移植模型中均能导致细胞分裂缺陷，并最终诱导癌细胞凋亡。尽管游离化合物的给药会诱发造血系统不良反应（白细胞减少伴血小板增多），但脂质体制剂给药可有效使小鼠移植肿瘤完全消退，且未观察到任何不良反应。我们的结果表明，抑制TOPK活性可能是治疗多种人类癌症的可行治疗方案。[1]

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多发性骨髓瘤（MM）目前仍被认为是无法治愈的，因此亟需研发新的药物。有丝分裂激酶T-LAK细胞来源的蛋白激酶/PDZ结合激酶（TOPK/PBK）与多种癌症的肿瘤细胞增殖、癌症干细胞的维持以及患者预后不良密切相关。在本报告中，我们首次证实了TOPK抑制剂OTS514具有显著的抗骨髓瘤作用。 OTS514 在纳摩尔浓度下即可诱导一系列人骨髓瘤细胞系 (HMCL) 发生细胞周期阻滞和凋亡，并能抑制多发性骨髓瘤 (MM) 患者外周血单核细胞中假定的 CD138+ 干细胞群的增殖。在 MM 患者的骨髓细胞中，OTS514 处理对恶性 CD138+ 浆细胞的杀伤作用强于对 CD138- 浆细胞的杀伤作用。在侵袭性小鼠异种移植模型中，每周 5 天口服 100 mg/kg 的 OTS964 耐受性良好，且与对照组相比，肿瘤体积缩小了 48%-81%，具体缩小程度取决于初始移植瘤的大小。OTS514 处理 HMCL 后，FOXO3 及其转录靶点 CDKN1A (p21) 和 CDKN1B (p27) 的表达上调，并诱导了细胞凋亡。 TOPK抑制剂还能诱导FOXM1的丢失，并破坏AKT、p38 MAPK和NF-κB信号通路。OTS514的作用与p53突变或缺失状态无关。OTS514与来那度胺联合治疗HMCL可产生协同效应，这为在现有骨髓瘤治疗方案中评估TOPK抑制剂提供了理论依据。[2]

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OTS514是一种强效的TOPK抑制剂。TOPK/PBK（T-LAK细胞来源的蛋白激酶/PDZ结合激酶）与多种癌症的肿瘤细胞增殖、癌症干细胞的维持以及患者预后不良相关。 [2]多发性骨髓瘤（MM）被认为是无法治愈的，因此亟需研发新药。OTS514在临床前模型中显示出强大的抗骨髓瘤活性，这为评估TOPK抑制剂在现有骨髓瘤治疗方案中的应用提供了理论依据。[2]

C21H20N2O2S

364.46

364.124

C, 69.21; H, 5.53; N, 7.69; O, 8.78; S, 8.80

1338540-63-8

OTS514 hydrochloride;2319647-76-0; OTS514;1338540-63-8; 1338544-87-8 (HBr); 1338545-92-8 (S-isomer HCl); 1338541-25-5 (s-isomer);

67448836

Light yellow to yellow solid

1.3±0.1 g/cm3

501.3±50.0 °C at 760 mmHg

256.9±30.1 °C

0.0±1.3 mmHg at 25°C

1.665

3.25

104

3

4

3

26

522

1

Cl[H].S1C([H])=C([H])C2=C1C(N([H])C1C(C([H])([H])[H])=C([H])C(=C(C3C([H])=C([H])C(=C([H])C=3[H])[C@@]([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])N([H])[H])C=12)O[H])=O

OETLNMOJNONWOY-LBPRGKRZSA-N

InChI=1S/C21H20N2O2S/c1-11-9-16(24)17(14-5-3-13(4-6-14)12(2)10-22)18-15-7-8-26-20(15)21(25)23-19(11)18/h3-9,12,24H,10,22H2,1-2H3,(H,23,25)/t12-/m0/s1

9-[4-[(2R)-1-aminopropan-2-yl]phenyl]-8-hydroxy-6-methyl-5H-thieno[2,3-c]quinolin-4-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。