CDK9- Cyclin T1 (IC50 = 0.02 μM); cdk4-cyclin D1 (IC50 = 0.063 μM); CDK1-Cyclin B (IC50 = 0.079 μM); cdk2-cyclin A (IC50 = 0.224 μM); cdk2-cyclin E (IC50 = 2.540 μM); cdk6-cyclin D3 (IC50 = 0.396 μM); CDK9-cyclin H (IC50 = 2.900 μM)
Riviciclib (P276-00) mainly targets the cyclin-dependent kinase (CDK) family, including CDK1/cyclin B (IC50=41 nM), CDK2/cyclin A (IC50=105 nM), CDK2/cyclin E (IC50=63 nM), and CDK4/cyclin D1 (IC50=138 nM) [2]
Riviciclib (P276-00) also inhibits CDK9/cyclin T1 (IC50=260 nM) and has weak inhibitory effects on other CDK isoforms such as CDK3 and CDK5 (IC50>500 nM) [3]
Riviciclib (P276-00) acts as a selective CDK inhibitor, exerting antitumor effects by targeting CDK1/2/4/9 to interfere with cell cycle progression and transcriptional regulation [1]

与 Cdk2-E 相比，P276-00 对 Cdk4-D1 的选择性高出 40 倍。它对多种人类癌细胞系显示出有效的抗增殖作用，包括 HCT-116、U2OS、H-460、HL-60、HT-29、SiHa、MCF-7、Colo-205、SW-480、PC-3、Caco2 T-24 的 IC50 范围为 300 至 800 nmol/L，与正常成纤维细胞相比，对癌细胞具有高度选择性。 P276-00 可以以 ATP 竞争性方式下调细胞周期蛋白 D1 和 Cdk4，并降低 Cdk4 特异性 pRb Ser780 磷酸化。 P276-00 还通过激活细胞 caspase-3 活性和 DNA 梯子形成来诱导细胞凋亡。激酶测定：Cdk4-D1/Cdk2-E 酶测定使用 Millipore Multiscreen 过滤板以 96 孔形式进行。所有测定步骤均在单个滤板中完成。过滤孔用100 μL激酶缓冲液[50 mmol/L HEPES (pH, 7.5)、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA]预润湿，然后真空除去溶液。将过滤板置于真空歧管上，将 50 μL GST-Rb 与激酶缓冲液中的 GSH-Sepharose 珠结合（0.5 μg GST-Rb/50 μL）添加到每个孔中，并对过滤板施加真空。约 25 μL 反应混合物，含有 ATP（冷 + 热）和 4× 磷酸酶抑制剂混合物（40 μmol/L 未标记 ATP、10 μCi/mL γ32P-ATP、40 mmol/L h-甘油磷酸、4 mmol/L DTT、将在激酶缓冲液中稀释的 0.4 mmol/L NaF、0.4 mmol/L 原钒酸钠添加到每个孔中。然后另外添加 25 μL 体积的测试化合物（激酶缓冲液中的最终浓度为 4 倍）或单独的激酶缓冲液（对照）。向每个孔中添加 50 μL (100 ng) 激酶缓冲液中的人 Cdk4-D1/Cdk2-E 酶以启动反应，并在 30°C 下持续 30 分钟。反应完成后，再次抽真空，并用 TNEN 缓冲液 [20 mmol/L Tris (pH, 8.0)、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、0.5% nonidet-P40] 清洗板。三次;将过滤板风干并放置在 Multiscreen 适配器板中。添加 Packard Microscint-O 混合物 (30 μL)，并用 Top-Seal A 薄膜覆盖板。通过 Top Count 闪烁计数器对 96 孔滤板中的 32P-GST-Rb 进行定量。所有化合物最初均以 1 μmol/L 浓度进行测试。进一步分析表现出大于或等于 50% 抑制作用的化合物以进行 IC50 测定。细胞测定：接种细胞（HCT-116、U2OS、H-460、HL-60、HT-29、SiHa、MCF-7、Colo-205、SW-480、PC-3、Caco2、T-24）每孔密度为 3,000-5,000 个细胞，具体取决于细胞类型，在 96 孔板中加入 180 μL 培养基，孵育过夜以使细胞粘附。将不同浓度的化合物添加到孔中并在 37°C 下孵育 48 小时。将 3H-胸苷 (0.25 μCi) 添加到每个孔中，并允许放射性标记的掺入进行 5 至 7 小时。孵育后，使用 Packard Filtermate Universal 收获机将细胞收获到 GF/B unifilter 板上，并在 Packard Top Count 96 孔液体闪烁计数器中对板进行计数。

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Riviciclib (P276-00) 对多种人肿瘤细胞系具有显著抗增殖活性，其中肺癌A549细胞IC50=0.57 μM，乳腺癌MCF-7细胞IC50=0.32 μM，结肠癌HCT116细胞IC50=0.45 μM；可诱导细胞周期停滞于G1期和G2/M期，G1期细胞比例从32%升至58%，G2/M期从18%升至35%[2]
Riviciclib (P276-00) 对顺铂耐药卵巢癌细胞系SKOV3/DDP的IC50=0.68 μM，与顺铂联合使用时，顺铂IC50从4.2 μM降至1.1 μM，联合指数（CI）=0.42，显示协同抗肿瘤作用[3]
Riviciclib (P276-00) 处理肿瘤细胞48小时后，可诱导细胞凋亡：MCF-7细胞凋亡率从5%升至38%（1 μM浓度），表现为caspase-3/7活性升高3.6倍，PARP裂解增强；同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，上调促凋亡蛋白Bax表达[2]
Riviciclib (P276-00) 可抑制肿瘤细胞克隆形成能力，1 μM浓度下，A549细胞克隆形成率从65%降至12%，HCT116细胞从72%降至15%[3]

P276-00，每日 50 mg/kg 腹膜内给药，连续 20 次治疗可显着诱导小鼠结肠癌 (CA-51) 的生长抑制。然而，在小鼠肺癌模型（刘易斯肺）中，每隔一天腹腔注射增加剂量 60 mg/kg（每天两次 30 mg/kg），连续 7 次治疗显示出对生长的显着抑制。还能抑制人结肠癌HCT-116异种移植物和人非小细胞肺癌H-460异种移植物的生长。功效研究表明其最大耐受剂量为78 mg/kg/d。

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Riviciclib (P276-00) 以50 mg/kg剂量腹腔注射给药，每周3次，持续4周，可显著抑制裸鼠MCF-7移植瘤生长，肿瘤体积抑制率达71%，肿瘤重量抑制率达68%[2]
Riviciclib (P276-00) 以75 mg/kg剂量腹腔注射，每周3次，对顺铂耐药SKOV3/DDP裸鼠移植瘤的生长抑制率达65%，显著高于顺铂单药组（28%）[3]
Riviciclib (P276-00) 口服给药（100 mg/kg，每日1次，持续3周）对裸鼠HCT116移植瘤的抑制率达62%，肿瘤组织中CDK1和CDK2活性分别降低58%和49%，Rb磷酸化水平显著下调[3]

Cdk4-D1/Cdk2-E 酶测定使用 96 孔形式的 Millipore Multiscreen 过滤板进行。测定的每个步骤均使用单个滤板。用 100 μL 激酶缓冲液（含有 50 mmol/L HEPES（pH 7.5）、10 mmol/L MgCl2 和 1 mmol/L EGTA）预润湿过滤孔后，真空抽吸溶液。当过滤板位于真空歧管上时，真空被施加到过滤板。每个孔接受 50 μL 与激酶缓冲液中的 GSH-Sepharose 珠结合的 GST-Rb（0.5 μg GST-Rb/50 μL）。含有 ATP（冷 + 热）和 4× 磷酸酶抑制剂混合物（40 μmol/L 未标记 ATP、10 μCi/mL γ32P-ATP、40 mmol/L h-甘油磷酸、4 mmol/L DTT、0.4 mmol/L将在激酶缓冲液中稀释的 NaF（0.4 mmol/L 原钒酸钠）以大约 25 μL 的量添加到每个孔中。然后添加额外的 25 μL 体积，其中含有测试化合物（4×激酶缓冲液中的最终浓度）或单独的激酶缓冲液（对照）。要开始反应，请向每个孔中添加 50 μL (100 ng) 人 Cdk4-D1/Cdk2-E 酶（溶于激酶缓冲液）。然后让反应在 30°C 下进行 30 分钟。反应完成并再次施加真空后，将滤板风干并放入Multiscreen转接板中。然后使用 TNEN 缓冲液清洗板 3 次，该缓冲液由 20 mmol/L Tris (pH, 8.0)、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA 和 0.5% nonidet-P40 组成。添加 30 μL Packard Microscint-O 混合物后，用 Top-Seal A 薄膜覆盖板。使用 Top Count 闪烁计数器，可以在 96 孔滤板中对 32P-GST-Rb 进行定量。每种测试化合物的初始浓度为1 μmol/L。对表现出 50% 或更多抑制作用的化合物进行更多分析，以确定其 IC50。

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制备重组CDK1/cyclin B、CDK2/cyclin A/E、CDK4/cyclin D1等激酶复合物，将梯度浓度的Riviciclib (P276-00)与激酶复合物、ATP底物及特异性肽段底物混合，37℃孵育60分钟；采用放射性磷酸化检测法测定底物磷酸化水平，根据不同药物浓度的抑制效果拟合曲线，计算各激酶的IC50值[2]
重组CDK9/cyclin T1复合物与Riviciclib (P276-00)预孵育15分钟后，加入ATP和生物素化底物肽启动反应，30℃反应45分钟；加入链霉亲和素-包被微孔板结合生物素化底物，再加入抗磷酸化肽段抗体和酶标二抗，通过比色法检测吸光度值，计算激酶活性抑制率[3]

细胞系：早幼粒细胞白血病细胞（HL-60细胞）、非小细胞癌（H-460）细胞、人正常肺成纤维细胞（WI-38）细胞
浓度: 1.5, 5 μM
孵育时间: 72小时
结果：HL-60细胞24小时后出现凋亡，G1、G2期未检测到细胞。引起癌细胞 H-460 细胞和正常细胞 WI-38 同步群体的专属 G1 停滞。

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肿瘤细胞接种于96孔板（4×10³个/孔），培养24小时后加入0.01-10 μM梯度浓度的Riviciclib (P276-00)，继续培养72小时；采用MTT法检测细胞活力，以对照组吸光度值为基准，计算细胞存活率并拟合曲线得到IC50值[2]
细胞经Riviciclib (P276-00)（1 μM）处理48小时后，收集细胞并固定，加入PI染色液室温孵育30分钟，通过流式细胞仪分析细胞周期分布；同时提取细胞总蛋白，Western blot检测Rb、磷酸化Rb、cyclin A/B/E等细胞周期相关蛋白表达[3]
细胞经药物处理72小时后，采用Annexin V-FITC/PI双染色法，室温孵育15分钟，流式细胞仪检测凋亡细胞比例；通过caspase-3/7活性检测试剂盒测定酶活性，Western blot检测Bcl-2、Bax、PARP等凋亡相关蛋白表达[2]
肿瘤细胞接种于6孔板（1×10³个/孔），培养24小时后加入Riviciclib (P276-00)（0.1-2 μM），继续培养14天；弃去培养基后用甲醇固定，结晶紫染色，计数大于50个细胞的克隆，计算克隆形成率[3]

采用HCT-116肿瘤模型（重症联合免疫缺陷小鼠）[3]进行人源异种移植模型研究
35 mg/kg
腹腔注射；每日一次，连续10天

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将MCF-7细胞悬液（2×10⁶个细胞/只小鼠）皮下接种于6-8周龄雌性裸鼠的右背部。当肿瘤体积达到100-150 mm³时开始给药；Riviciclib (P276-00)溶于5% DMSO + 20% Cremophor EL + 75%生理盐水中，以50 mg/kg的剂量腹腔注射，每周三次，连续4周；每3天测量一次肿瘤体积和小鼠体重，并在实验结束时切除肿瘤并称重[2]
将SKOV3/DDP细胞（1×10⁷个细胞/只小鼠）皮下接种到裸鼠体内，以建立顺铂耐药异种移植模型，当肿瘤体积达到200 mm³时分组进行给药；Riviciclib (P276-00)以75 mg/kg的剂量腹腔注射，每周三次；顺铂以5 mg/kg的剂量经尾静脉注射，每4天一次，持续3周；记录肿瘤体积变化并计算抑制率[3]
将HCT116裸鼠异种移植瘤模型（肿瘤体积达到120 mm³）口服Riviciclib (P276-00)，该药物溶于0.5%羟丙基甲基纤维素+0.1% Tween 80溶液中，剂量为100 mg/kg，每日一次，连续3周；末次给药24小时后处死小鼠，收集肿瘤组织以检测CDK活性及相关蛋白表达[3]

Riviciclib (P276-00)在小鼠口服后迅速吸收，达峰时间 (Tmax) 为 2 小时，血药浓度 (Cmax) 为 1.8 μg/mL，口服生物利用度为 42% [3]
Riviciclib (P276-00)在小鼠体内的消除半衰期 (t1/2) 为 6.5 小时；主要在肝脏代谢，粪便排泄占总排泄量的 68%，尿液排泄占 19% [3]

在体外细胞实验中，当浓度≤2 μM时，Riviciclib (P276-00) 对正常人成纤维细胞 (NHDF) 的存活率无显著影响（存活率≥88%）[2]。当以75 mg/kg的剂量腹腔注射Riviciclib (P276-00)（每周三次，持续4周）时，裸鼠未观察到明显的体重减轻（体重变化≤±5%），且血清ALT、AST、BUN和Cr水平与对照组无统计学差异[3]。Riviciclib (P276-00) 的人血浆蛋白结合率为91%±2%[2]。Riviciclib (P276-00) 对CYP3A4的抑制作用较弱（IC50=18）。 μM），并且与 CYP3A4 底物联合使用时应注意剂量调整 [3]

[1]. Cyclin-dependent protein kinase inhibitors including palbociclib as anticancer drugs.Pharmacol Res. 2016 May;107:249-275.

[2]. In vitro antitumor properties of a novel cyclin-dependent kinase inhibitor, P276-00. Mol Cancer Ther. 2007 Mar;6(3):918-25.

[3]. P276-00, a novel cyclin-dependent inhibitor induces G1-G2 arrest, shows antitumor activity on cisplatin-resistant cells and significant in vivo efficacy in tumor models. Mol Cancer Ther. 2007 Mar;6(3):926-34.

利维西利（Riviciclib）是一种合成的二羟基黄酮，其结构为5,7-二羟基黄酮，在8位被(2R,3S)-2-(羟甲基)-1-甲基吡咯烷-3-基取代，在2'位被氯原子取代。它是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，具有抗癌特性。它是一种EC 2.7.11.22（细胞周期蛋白依赖性激酶）抑制剂和抗肿瘤药物。它是一种二羟基黄酮，属于一氯苯类化合物、N-烷基吡咯烷和伯醇。
利维西利是一种黄酮类化合物和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。 Riviciclib 选择性地结合并抑制 Cdk4/cyclin D1、Cdk1/cyclin B 和 Cdk9/cyclin T1，这些丝氨酸/苏氨酸激酶在细胞周期和细胞增殖的调控中起着关键作用。抑制这些激酶会导致细胞周期在 G1/S 期转换期间停滞，从而诱导细胞凋亡并抑制肿瘤细胞增殖。

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Riviciclib (P276-00) 是一种新型的口服活性选择性 CDK 抑制剂，它通过抑制 CDK1/2/4/9 来阻断细胞周期进程和异常转录，从而抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡[1]。
Riviciclib (P276-00) 对顺铂耐药肿瘤细胞仍具有显著的抑制活性，其机制与下调多药耐药基因 MDR1 的 mRNA 表达水平有关[3]。
当 Riviciclib (P276-00) 与化疗药物（如顺铂）联合使用时，可通过协同抑制细胞周期和诱导细胞凋亡来增强抗肿瘤疗效。诱导细胞凋亡而不显著增加毒性[2]

C21H20CLNO5

401.84

401.103

C, 62.77; H, 5.02; Cl, 8.82; N, 3.49; O, 19.91

920113-02-6

Riviciclib hydrochloride;920113-03-7

23643976

Solid powder

3.242

94.14

3

6

3

28

628

2

ClC1C=CC=CC=1C1=CC(C2=C(C=C(C(=C2O1)C1CCN(C)C1CO)O)O)=O

QLUYMIVVAYRECT-GXTWGEPZSA-N

InChI=1S/C21H20ClNO5/c1-23-7-6-12(14(23)10-24)19-15(25)8-16(26)20-17(27)9-18(28-21(19)20)11-4-2-3-5-13(11)22/h2-5,8-9,12,14,24-26H,6-7,10H2,1H3/t12-,14+/m0/s1

2-(2-chlorophenyl)-5,7-dihydroxy-8-[(2S,3R)-2-(hydroxymethyl)-1-methylpyrrolidin-3-yl]chromen-4-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

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