PD0407824   中文名称: 酸性红 87

Checkpoint kinase 1 (CHK1) inhibitor
Wee1 inhibitor

PKC inhibitor

当 PD 407824 充分阻断 CHK1 时，p21 显著下调，激活 CDK8/9 并导致 SMAD2/3 耗竭 [1]。PD 407824 对 Chk1 和 WEE1 的 IC50 值分别为 3.75 µM 和 3.4 µM，表明其对这两种蛋白的选择性高于 PKC 和 Cdk4 [3]。

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PD407824 可使 C2C12 成肌细胞对亚阈值浓度的 BMP4 更加敏感。在 pld2-LucGFP 报告基因检测中，PD407824 的 EC50 值随着 BMP4 浓度的增加而降低（在没有 BMP4 的情况下，EC50 = 12.3 μM；在 0.1 ng/ml BMP4 存在下，EC50 = 0.75 μM；在 1 ng/ml BMP4 存在下，EC50 = 0.12 μM）。[2] 与 DMSO+10 ng/ml BMP4 处理组（3.7 ± 1.0 倍）相比，PD407824（1 或 10 μM）+ BMP4（10 ng/ml）处理组在 C2C12 成肌细胞中 Id2 转录水平分别增加了 9.6 ± 2.2 倍和 11.5 ± 0.7 倍。 [2]如蛋白质印迹法所示，PD407824 + BMP4 可定量增加 C2C12 成肌细胞中 SMAD1/5/9 的磷酸化水平。单独使用 PD407824 则有略微降低 SMAD1/5/9 磷酸化的趋势，但差异无统计学意义。[2]在 C2C12 成肌细胞中，PD407824 (1 μM) + BMP4 (3 ng/ml) 处理可诱导碱性磷酸酶 (ALK) 活性，其水平与单独使用 10 ng/ml BMP4 处理的细胞相当。此外，PD407824 + BMP4 处理还可诱导成骨细胞标志物（I 型胶原、骨桥蛋白、骨钙素）的表达和矿化作用，其效果与 10 ng/ml BMP4 处理相当。 [2]在人胚胎干细胞 (hESC) H9 细胞中，PD407824 (1 μM) + BMP4 (3 ng/ml) 处理使 Id2 转录水平比 DMSO + 3 ng/ml BMP4 处理组高 7.1 ± 0.3 倍。此外，它还提高了中胚层标志物 Brachyury T 的转录水平。[2]在 hESC H1 细胞中，PD407824 (2.5 μM) + BMP4 (9 ng/ml) 处理显著提高了 KRT7+ 细胞滋养层干细胞的比例以及细胞滋养层标志物 TP63 和 GCM1 的表达，与 30 ng/ml BMP4 处理组的效果相当。 [2] PD407824 通过抑制 CHK1 发挥作用，而另一种 CHK1 抑制剂 CHIR124 则通过与 BMP4 协同作用，以剂量依赖的方式上调 Id2 并增加 SMAD1/5/9 的磷酸化，从而模拟 PD407824 的作用。[2] 机制研究表明，PD407824 处理显著降低 p21 蛋白水平，进而激活 CDK8/9。CDK8/9 随后磷酸化 SMAD2/3 连接区（例如 SMAD3 的 T179 位点），导致 SMAD2/3 总蛋白水平降低。这使得 SMAD4 可以与 SMAD1/5/9 结合，从而增强 BMP 信号传导。黄酮吡啶醇（一种 CDK 抑制剂）或 CDK9 基因敲除可阻断此效应。 [2]
PD407824 (2.5 μM) 处理 hESCs 并未显著影响 Ki67+ 细胞的数量或诱导 γ-H2A.X+ 细胞，表明其对分化过程中的细胞增殖或 DNA 损伤没有显著影响。[2]

BMP报告基因检测：将稳定表达pld2-LucGFP BMP报告基因的C2C12成肌细胞接种于384孔板中。24小时后，更换培养基为无血清DMEM，继续培养24小时以降低背景信号。随后，用不同浓度（0-15 μM）的PD407824处理细胞，并分别加入或不加入BMP4（0.1或1 ng/ml）。处理24小时后，裂解细胞，并使用荧光素酶底物检测荧光素酶活性，以确定该化合物对BMP信号通路激活的影响。 [2] 基因表达分析 (qPCR)：将 C2C12 成肌细胞或 hESCs 单独或与不同浓度的 BMP4 联合用 PD407824（例如，C2C12 细胞浓度为 1、10 μM；hESCs 细胞浓度为 0.1、0.3、1 μM）处理 24 小时。提取总 RNA 并进行逆转录。采用定量实时 PCR (qPCR) 检测 BMP 靶基因（如 Id1、Id2）以及中胚层（Brachyury T）、心肌细胞（TNNT2、MHY6、MLC2v）和细胞滋养层（KRT7、TP63、GCM1）标记基因的转录水平。表达水平以对照基因进行标准化，并与 DMSO 处理的样本进行比较。 [2]蛋白质印迹分析：将C2C12成肌细胞或hESCs用PD407824（例如，10 μM）处理24小时，处理过程中加入或不加入BMP4（例如，3 ng/ml）。用完全裂解缓冲液裂解细胞。通过电泳分离蛋白质，转移至PVDF膜上，并用针对磷酸化SMAD1/5/9、总SMAD1、SMAD2/3、磷酸化SMAD3 (T179)、p21和β-肌动蛋白的一抗进行检测。随后，将膜与二抗孵育，并使用ECL底物显色，以显示蛋白质水平和磷酸化状态。 [2]
成骨细胞分化：将C2C12成肌细胞分别用DMSO、PD407824（例如，1 μM）、BMP4（3 ng/ml）、PD407824 + BMP4或BMP4阳性对照（10 ng/ml）处理6-22天。6天后，通过染色或荧光底物测定法评估碱性磷酸酶（ALK）活性。采用qPCR分析成骨细胞标志物（I型胶原、骨桥蛋白、骨钙素）的表达。处理22天后，采用茜素红S染色评估矿化情况。 [2] 心肌细胞分化：将hESC H9细胞形成胚状体（EBs），并用DMSO或PD407824（0.1、0.3、1 μM）联合BMP4（3 ng/ml）处理4天。然后将EBs培养于心肌分化培养基中。第10天计数搏动集落。第12天，固定细胞用于抗TNNT2抗体的免疫细胞化学染色，或解离细胞用于胞内流式细胞术分析，以定量TNNT2阳性心肌细胞的百分比。同时提取RNA用于心肌细胞标志物的qPCR分析。 [2]
滋养层分化：将hESC H1细胞在MEF条件培养基中，用DMSO或PD407824（2.5 μM）联合不同浓度的BMP4（0-30 ng/ml）处理7天。然后固定细胞，并用抗KRT7抗体染色进行图像分析，或将细胞解离进行细胞内流式细胞术分析，以定量KRT7+滋养层细胞的百分比。提取RNA进行qPCR分析，检测滋养层标志物。[2]
共免疫沉淀（Co-IP）：将C2C12细胞在有或无PD407824（10 μM）的情况下，用BMP4（3 ng/ml）处理24小时。用抗SMAD4抗体沉淀细胞裂解液中的蛋白质。随后，使用抗SMAD1抗体通过Western blotting分析免疫沉淀的复合物，以检测SMAD1和SMAD4之间的相互作用。[2]
CRISPR基因敲除实验：用表达Cas9和靶向CHK1、p21、CDK9或GFP（对照）的sgRNA的慢病毒感染C2C12细胞。经嘌呤霉素筛选和亚克隆后，通过Western blotting验证基因敲除克隆（例如，CHK1+/-、CHK1-/-；p21+/-、p21-/-；CDK9+/-、CDK9-/-）。然后用BMP4（例如，1或3 ng/ml）处理这些细胞，并通过qPCR分析Id2的表达或成骨细胞分化能力，以研究这些基因在PD407824机制中的遗传需求。[2]

在人胚胎干细胞分化研究中，用 PD407824 (2.5 μM) 处理并未显著影响 Ki67+ 增殖细胞的数量。[2]
用 PD407824 (2.5 μM) 处理并未诱导 γ-H2A.X+ 细胞（DNA 损伤的标志物），表明其不影响人胚胎干细胞分化过程中的 DNA 修复。[2]

[1]. 4-Phenylpyrrolo[3,4-c]carbazole-1,3(2H,6H)-dione inhibitors of the checkpoint kinase Wee1. Structure-activity relationships for chromophore modification and phenyl ring substitution. J Med Chem. 2006 Aug 10;49(16):4896-911.

[2]. Discovery of a Small-Molecule BMP Sensitizer for Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Rep. 2016 May 31;15(9):2063-75.

[3]. Synthesis and structure-activity relationships of N-6 substituted analogues of 9-hydroxy-4-phenylpyrrolo[3,4-c]carbazole-1,3(2H,6H)-diones as inhibitors of Wee1 and Chk1 checkpointkinases. Eur J Med Chem. 2008 Jun;43(6):1276-96. Epub 200.

PD407824是通过对C2C12成肌细胞进行高通量化学筛选而鉴定出的“BMP增敏剂”，该筛选使用BMP反应性荧光素酶报告基因，发现PD407824能够提高细胞对亚阈值浓度BMP4的敏感性。[2]
其作用机制涉及抑制CHK1，导致p21表达下调。这会激活CDK8/9，进而磷酸化SMAD2/3的连接区，使其被蛋白酶体降解。SMAD2/3的后续消耗减少了其与SMAD4的竞争，使得更多的SMAD1/5/9-SMAD4复合物得以形成，从而增强BMP靶基因的表达。 [2] 研究表明，PD407824 是一种有效的药理学试剂，可通过与低浓度（低于阈值）的 BMP4 协同作用，引导人胚胎干细胞 (hESC) 向中胚层（随后分化为心肌细胞）和滋养层干细胞分化。[2] 该研究提示，CHK1 抑制剂（如 PD407824）可能成为干细胞分化方案中重组 BMP 蛋白的稳定且经济有效的替代或辅助手段，并可能用于骨修复的临床应用，因为它们已用于癌症的 I/II 期临床试验。[2]

C20H12N2O3

328.32

328.085

622864-54-4

4369491

Light yellow to yellow solid powder

1.507g/cm3

1.81

3.333

85.95

3

3

1

25

573

0

IAUZTOZLTFSMIE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H12N2O3/c23-11-6-7-14-13(8-11)16-15(21-14)9-12(10-4-2-1-3-5-10)17-18(16)20(25)22-19(17)24/h1-9,21,23H,(H,22,24,25)

9-hydroxy-4-phenyl-6H-pyrrolo[3,4-c]carbazole-1,3-dione

PD0407824 PD 0407824 PD-0407824

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~761.45 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。