human c-Met (Ki = 4.8 nM)

体外活性：PF-04217903 比星形孢菌素或 PF-02341066 更具选择性，对 208 种激酶组中的 c-Met 的选择性高出 1000 倍以上，但与 PF-04217903 相比，它更容易受到 c-Met 致癌突变的影响，从而减弱效力。 02341066。除了 WT c-Met 之外，PF-04217903 还表现出类似的抑制 c-Met-H1094R、c-Met-R988C 和 c-Met-T1010I 活性的效力，IC50 分别为 3.1 nM、6.4 nM 和 6.7 nM，分别，但对 c-Met-Y1230C 没有抑制活性，IC50 > 10 μM。 PF-04217903 与舒尼替尼联合显着抑制内皮细胞，但不抑制肿瘤细胞 B16F1、Tib6、EL4 和 LLC PF-04217903 显着抑制 LXFA 526L 和 LXFA 1647L 的克隆生长，IC50 值为 16 nM 和 13 nM，分别与西妥昔单抗联合使用时产生相加效应。 PF-04217903 有效抑制 c-Met 驱动的过程，例如各种肿瘤细胞的细胞生长、运动、侵袭和形态。 PF-04217903 处理 (2 μM) 会增加 GTL-16 细胞的细胞死亡，这涉及磷酸化 4E-BP1、ERK/MAPK 相关蛋白和 PI3K/AKT 通路的下调。激酶测定：将含有内源性人WT c-Met的A549细胞接种到96孔板的生长培养基中并培养过夜。在测定的第二天，将生长培养基更换为无血清培养基（含 0.04% BSA）。将 PF-04217903 的系列稀释液添加到每个孔中，并将细胞在 37°C 下孵育 1 小时。然后将 40 ng/mL HGF 添加到细胞中 20 分钟。用补充有 1 mM Na3VO4 的 HBSS 洗涤细胞一次，并使用裂解缓冲液从细胞中产生蛋白质裂解物。 c-Met 的磷酸化通过 ELISA 方法进行评估，该方法利用 c-Met 特异性的捕获抗体和磷酸化酪氨酸残基特异性的检测抗体。将抗体包被的板在蛋白质裂解物存在下于 4 °C 孵育过夜，并用 1% Tween 20 的 PBS 溶液清洗七次。 HRP-PY20（辣根过氧化物酶缀合的抗磷酸酪氨酸）在封闭缓冲液中按 1:500 稀释，并添加到每个板中 30 分钟。然后再次洗涤板，并添加 TMB 过氧化物酶底物以启动 HRP 依赖性比色反应，并通过添加 0.09 N H2SO4 终止反应。 ELISA 终点是使用分光光度计在 450 nm 处测量的吸光度。 IC50 值是利用基于 Microsoft Excel 的四参数分析方法通过浓度-响应曲线拟合来计算的。细胞测定：用不同浓度的 PF-04217903 处理细胞（B16F1、Tib6、EL4 和 LLC、HUVEC 和 C166 细胞）4 天。通过使用库尔特计数器对每个孔的内容物进行计数来评估细胞增殖。

尽管无法抑制舒尼替尼敏感的 B16F1 和 Tib6 肿瘤模型中的肿瘤生长，但与单独使用舒尼替尼或 PF-04217903 相比，PF-04217903 和舒尼替尼的组合可显着抑制舒尼替尼耐药的 EL4 和 LLC 肿瘤模型中的肿瘤生长。血管扩张，表明 HGF/c-Met 轴在舒尼替尼耐药肿瘤中发挥功能作用。

在 96 孔板中，将表达内源性人 WT c-Met 的 A549 细胞置于生长培养基中并生长整夜。实验第二天将生长培养基更换为无血清培养基（含 0.04% BSA）。每个孔接受 PF-04217903 的系列稀释液，并将细胞在 37°C 下孵育一小时。然后用 40 ng/mL 的 HGF 处理细胞 20 分钟。在补充有 1 mM Na3VO4 的 HBSS 中洗涤细胞一次后，使用裂解缓冲液从细胞中提取蛋白质。使用针对 c-Met 特异性的捕获抗体和针对磷酸化酪氨酸残基特异性的检测抗体的 ELISA 技术来测量 c-Met 的磷酸化。将蛋白质裂解物添加到抗体包被的板中，然后在 4°C 下孵育整夜，然后用 PBS 中的 1% Tween 20 清洗七次。每个板用 1:500 稀释的辣根过氧化物酶缀合的抗磷酸酪氨酸 (HRP-PY20) 处理 30 分钟。又一轮清洗板后，通过添加 TMB 过氧化物酶底物启动 HRP 依赖性比色反应，并通过添加 0.09 N H2SO4 停止。使用分光光度计，450 nm 处的吸光度用于确定 ELISA 终点。通过基于Microsoft Excel的四参数分析方法拟合浓度-响应曲线，确定IC50值。

将细胞暴露于不同浓度的 PF-04217903 四天。使用库尔特计数器对每个孔的内容物进行计数，评估细胞增殖。

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简而言之，将GTL-16细胞以每孔20000个细胞的速度铺在96孔板上，并用0.5、1或5μMPF-04217903处理。根据需要每3-5天补充一次化合物。细胞在药物存在下生长约4个月。PF-04217903的浓度每月以0.5μM的增量逐渐增加一次，最终浓度为2.5μM。在2.5μMPF-04217903中存活的细胞被扩增和亚克隆。由于其圆形表型，这些抗性细胞被称为R3克隆。 将亲本GTL16和R3细胞接种在添加了10%FBS的RPMI中的150 cm培养皿中，并在5%CO2的加湿气氛中保持在37°C。在70%融合时，GTL16细胞在RPMI/0.1%FBS中饥饿过夜。第二天，每个板在37°C下用DMSO对照或2μMPF-04217903处理6或24小时。用与抑制剂混合的改良RIPA缓冲液（150 mM NACl，50 mM Tris-HCl，pH 7.4；1%NP-40，0.25%脱氧胆酸钠，1 mM EDTA）裂解细胞，并在冰上孵育30分钟。通过5-8秒脉冲的超声波处理完成裂解。细胞裂解物在15000×g下离心20分钟（4°C）以去除细胞碎片。在将样品储存在-80°C下直至磷蛋白富集之前，通过BCA测定上清液的蛋白质产量[4]。

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细胞系，包括B16F1、Tib6、EL4和LLC，以及内皮细胞、HUVEC和C166，在24孔组织培养处理板的每个孔中接种104个细胞。如前所述，细胞在标准培养基中生长。细胞用不同浓度（2、0.2和0.02μmol/L）的舒尼替尼、PF-04217903和两种化合物的组合处理4天。通过在库尔特计数机 中计数细胞来测量化合物的功效。使用3种不同浓度（10、100和200 ng/mL）的每种配体，采用类似的方法评估HGF或VEGF对细胞增殖的作用[2]。

雌性裸鼠GTL-16异种移植模型
1、3、10、30 mg/kg
口服；每日一次，持续16天

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裸鼠的饲养遵循辉瑞公司IACUC提供的指南。本研究中使用的所有肿瘤细胞系（B16F1、EL4、LLC和Tib6）均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），并在添加了谷氨酰胺（2 mmol/L）和胎牛血清（FBS；10%）的RPMI 1640培养基中培养。本研究中使用的所有细胞系均经供应商鉴定。移植时，将肿瘤细胞（每只小鼠1 × 10⁶个细胞）重悬于100 μL培养基和100 μL低生长因子基质胶中，并皮下植入小鼠侧腹。荷瘤小鼠每日一次口服给予舒尼替尼苹果酸盐（80 mg/kg）、PF-04217903（45 mg/kg）或二者联合用药。采用游标卡尺测量肿瘤体积，具体方法见前文。HUVEC 和 C166 细胞分别购自 Lonza 公司和 ATCC。体外实验中，HUVEC 培养于添加了供应商提供的生长因子混合物的 EBM2 培养基中，C166 细胞培养于添加了 10% FBS 的 DMEM 培养基中。

[1]. Biochemistry. 2009 Jun 16;48(23):5339-49.

[2]. Cancer Res. 2010 Dec 15;70(24):10090-100.

[3]. Eur J Cancer. 2011 May;47(8):1231-43..

[4]. J Proteome Res. 2011 Nov 4;10(11):5084-94.

2-[4-[3-(6-喹啉甲基)-5-三唑并[4,5-b]吡嗪基]-1-吡唑基]乙醇属于喹啉类化合物。
PF-04217903 已用于肿瘤治疗研究的临床试验。
MET 酪氨酸激酶抑制剂 PF-04217903 是一种口服生物利用度高的小分子酪氨酸激酶抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。MET 酪氨酸激酶抑制剂 PF-04217903 选择性地结合并抑制 c-Met，从而破坏 c-Met 信号通路，这可能导致抑制肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭，并诱导表达 c-Met 的肿瘤细胞死亡。受体酪氨酸激酶 c-Met，又称肝细胞生长因子 (HGF) 受体，在多种肿瘤细胞类型中过度表达或发生突变，在肿瘤细胞增殖、存活、侵袭、转移和血管生成中发挥重要作用。

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c-Met 受体酪氨酸激酶 (RTK) 是癌症的关键调控因子，部分是通过致癌突变实现的。我们采用生物化学、生物物理和细胞学方法对八种具有临床意义的突变体进行了表征。c-Met 催化结构域在未磷酸化状态下具有高活性 (k(cat) = 1.0 s(-1))，激活后催化效率 (k(cat)/K(m)) 提高了 160 倍，达到 425000 s(-1) M(-1)。 c-Met突变体的基础酶活性(k(cat))比野生型高2-10倍，但其最大活性与野生型c-Met相似，Y1235D突变体的最大活性则有所降低。基础活性的微小提升即可显著促进酶活性的获得，而这种获得是通过加速自身磷酸化速率实现的。c-Met突变体的生物物理分析显示，其熔解温度差异极小，表明这些突变并未改变蛋白质的稳定性。本文提出了一个RTK激活模型，用以描述RTK反应如何通过酶学特性与生物学环境相匹配。研究了两种分别来自氨基吡啶和三唑并吡嗪类化合物的c-Met临床候选药物（PF-02341066和PF-04217903）。在生物化学方面，每个系列均产生了对多种激酶具有高度选择性的分子，其中PF-04217903（对208种激酶的选择性超过1000倍）的选择性高于PF-02341066。尽管这些原型抑制剂对野生型c-Met的效力相似（K_i = 6-7 nM），但在生物化学和细胞学条件下评估的临床相关突变体中，观察到效力存在显著差异。特别是，PF-02341066对Y1230C突变型c-Met的活性比PF-04217903高180倍。这些高度优化的抑制剂表明，对于易受活性位点突变影响的激酶，抑制剂设计可能需要在整体激酶选择性和抑制多种突变体激酶的能力（外显率）之间取得平衡。[1]

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抗血管生成化合物耐药/低反应性的分子和细胞机制正在被广泛研究。肿瘤细胞和基质（非肿瘤成分）似乎都与抗血管生成疗法的固有耐药/获得性耐药有关。本研究在实验模型中研究了舒尼替尼的体内疗效，从而鉴定出对该疗法耐药/敏感的肿瘤。肿瘤蛋白裂解物的分析表明，耐药肿瘤中肝细胞生长因子（HGF）的浓度高于敏感肿瘤。此外，流式细胞术分析发现，内皮细胞中c-Met的表达显著高于肿瘤细胞，这表明HGF可能靶向耐药肿瘤中的血管内皮细胞。在耐药肿瘤中，舒尼替尼联合选择性c-Met抑制剂显著抑制了肿瘤生长，优于单独使用舒尼替尼或c-Met抑制剂。组织学和体外分析表明，联合治疗主要靶向耐药肿瘤的血管系统。相反，在敏感肿瘤模型中全身注射HGF可通过维持肿瘤血管生成而赋予舒尼替尼耐药性。总之，我们的研究表明HGF/c-Met通路在抗血管生成治疗耐药性的发展中发挥作用，并提示了一种在临床上克服血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性的潜在策略。[2] 西妥昔单抗（爱必妥®）靶向表皮生长因子受体（EGFR），已获批用于治疗结直肠癌和头颈癌。尽管EGFR广泛表达，但只有一部分癌症患者对西妥昔单抗治疗有效。在本研究中，我们评估了源自五种肿瘤组织类型的79例人源异种移植瘤在体内对西妥昔单抗的反应。我们分析了肿瘤的基本特征，包括EGFR的表达和激活、KRAS、BRAF和NRAS的突变状态、EGFR配体的表达以及HER3（ErbB3）和肝细胞生长因子受体MET的激活。基于这些结果，我们提出了一种包含影响治疗反应的阳性和阴性因素的西妥昔单抗反应评分。阳性因素是EGFR及其配体表皮调节素或双调蛋白的高表达和激活，阴性因素是与EGFR无关的下游通路激活的标志物。在西妥昔单抗耐药的非小细胞肺癌腺癌LXFA 526和LXFA 1647中，我们发现了由于基因扩增导致的MET过表达和MET的强激活。在相应的细胞系中，通过siRNA敲低MET基因表明，非锚定依赖性生长和迁移依赖于MET。MET敲低使LXFA 526L和LXFA 1647L细胞对EGF更加敏感。MET抑制剂与西妥昔单抗联合治疗具有叠加效应。因此，在部分肺癌患者中，西妥昔单抗联合MET抑制剂的治疗可能具有重要的临床意义。[3] 近年来，抗癌药物的研发取得了显著进展，其中包括靶向蛋白酪氨酸激酶（如c-Met受体）的药物。c-Met受体与多种癌症的发生发展密切相关。然而，尽管取得了这些进展，耐药性仍然是癌症治疗失败的最主要原因，而理解耐药机制仍然是治疗复发性疾病患者的主要挑战。 PF-04217903 是一种小分子 c-Met 激酶抑制剂，能够有效抑制 c-Met 驱动的多种肿瘤细胞的生长（增殖和存活）、迁移、侵袭和形态等过程。在 GTL-16 胃癌细胞系中观察到了对 PF-04217903 的耐药性，该细胞系具有组成型激活的 c-Met 受体。本研究采用基于质谱 (MS) 的定量磷酸化蛋白质组学分析，旨在确定亲代细胞在 c-Met 抑制后信号通路的变化，并研究亲代细胞和 PF-04217903 耐药 (R3) 克隆在 c-Met 抑制后蛋白质水平及相关经典通路的变化。定量质谱工作流程包括对六种处理条件下的细胞裂解液进行磷酸化蛋白富集：溶液内酶解、使用一组六重同位素串联质谱标签（TMT）对肽段进行化学标记、亲水相互作用色谱（HILIC）分离、磷酸化肽段富集，以及在LTQ-Orbitrap质谱仪上进行纳升液相色谱-串联质谱（nano LC-MS/MS）分析。利用Ingenuity Pathways Analysis（IPA）软件对这些定量数据集进行分析，揭示了不同处理条件下通路的变化，这些变化与先前观察到的转录组和表型变化相一致。蛋白质组学分析还显示R3克隆中B-Raf表达增加。表达谱分析证实B-Raf基因拷贝数上调，并表明存在B-Raf突变体。采用自下而上的质谱分析方法，鉴定出SND-1为B-Raf融合伴侣。这种新型 B-Raf 融合蛋白的发现，为治疗对 c-Met 抑制剂耐药的患者提供了一个新的靶点，具有潜在的临床意义。[4]

C20H20N8O4S

468.492

468.132

C, 51.28; H, 4.30; N, 23.92; O, 13.66; S, 6.84

956906-93-7

PF-04217903;956905-27-4;PF-04217903 phenolsulfonate;1159490-85-3

24852079

White to off-white solid powder

2.258

170.18

2

10

5

33

617

0

O=S(C)(O)=O.OCCN1C=C(C2C=NC3N=NN(C=3N=2)CC2C=C3C(N=CC=C3)=CC=2)C=N1

HBEMHKVWZJTVOC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H16N8O.CH4O3S/c28-7-6-26-12-15(9-22-26)17-10-21-18-19(23-17)27(25-24-18)11-13-3-4-16-14(8-13)2-1-5-20-16;1-5(2,3)4/h1-5,8-10,12,28H,6-7,11H2;1H3,(H,2,3,4)

methanesulfonic acid;2-[4-[3-(quinolin-6-ylmethyl)triazolo[4,5-b]pyrazin-5-yl]pyrazol-1-yl]ethanol

PF04217903 mesylate; PF 04217903; PF-04217903; PF-04217903 methanesulfonate; PF-04217903 mesylate; PF 04217903 Mesylate; PF-04217903.MsOH; PF-04217903 (methanesulfonate); CHEMBL2170804; 956906-93-7 (mesylate); PF4217903 mesylate; PF-4217903; PF 4217903 mesylate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 3 mg/mL (6.40 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 30.0 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL 生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 3 mg/mL (6.40 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 30.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 1% DMSO+30% polyethylene glycol+1% Tween 80: 30 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。