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PF-477736 2HCl

别名: PF-477736;PF-736 diHCl; PF00477736;PF-00477736 dihydrochloride;PF-00477736; PF 00477736 dihydrochloride; PF 477736; PF477736
目录号: V4423 纯度: ≥98%
COA 产品数据 产品说明书 SDS
PF-477736 di-HCl（也称为 PF-736 diHCl、PF-00477736）是 PF477736 的二盐酸盐，是一种新型、选择性、有效的 ATP 竞争性 Chk1 抑制剂，在无细胞测定中 Ki 为 0.49 nM还抑制 VEGFR2、Aurora-A、FGFR3、Flt3、Fms (CSF1R)、Ret 和 Yes。
PF-477736 2HCl CAS号: 1247874-19-6
产品类别: New9
产品仅用于科学研究，不针对患者销售
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纯度: ≥98%

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产品说明书
产品描述
PF-477736 二盐酸盐（也称为 PF-736 二盐酸盐、PF-00477736）是 PF477736 的二盐酸盐，是一种新型、选择性强、高效且 ATP 竞争性的 Chk1 抑制剂，在无细胞实验中 Ki 值为 0.49 nM，并且还能抑制 VEGFR2、Aurora-A、FGFR3、Flt3、Fms (CSF1R)、Ret 和 Yes。它对 Chk1 的选择性比 Chk2 高约 100 倍。通过克服针对 DNA 损伤剂诱导的致命损伤的最后一道检查点防御，Chk1 抑制剂 PF-477736 可能增强多种化疗药物对具有内在检查点缺陷的肿瘤细胞的抗肿瘤疗效。


PF-477736 2HCl (PF-00477736) 是一种强效、选择性的 ATP 竞争性小分子检查点激酶 1 (Chk1) 抑制剂。它能消除 DNA 损伤诱导的细胞周期阻滞，并增强吉西他滨、卡铂和多西他赛等化疗药物的细胞毒性。在异种移植模型中，它能增强抗肿瘤活性而不增加毒性。目前，它正与吉西他滨联合进行 I 期临床试验。[1][2]

生物活性&实验参考方法
靶点
Chk1 (Ki = 0.49 ± 0.29 nM) [1]
Chk2 (Ki = 47 ± 9 nM) [1]
CDK1 (Ki = 9.9 μM, 20,000-fold selectivity vs Chk1) [1]
体外研究 (In Vitro)
PF-477736 (128 nM) 以剂量依赖的方式抑制 CA46 和 HeLa 细胞中喜树碱诱导的 DNA 损伤检查点。PF-477736 可有效抑制吉西他滨诱导的 HT29 细胞 S 期阻滞，并伴随凋亡细胞数量的相应增加。PF-477736 (540 nM) 以时间和剂量依赖的方式增强吉西他滨对 HT29 细胞的细胞毒性。在 MTT 实验中，PF-477736 可增强多种化疗药物对多种 p53 缺陷型人类癌细胞系的生长抑制活性。在吉西他滨阻滞的细胞中加入PF-477736 (360 nM) 可显著增强H2AX磷酸化强度，反映出DNA损伤位点附近γ-H2AX分子数量的增加。在HL-60细胞中，PF-477736 (0.5 nM) 可选择性地阻断姜黄素存在下的p73和P53磷酸化。PF-477736 (360 nM) 可抑制多西他赛诱导的组蛋白H3 (Ser10) 和Cdc25C (Ser216) 磷酸化，并增强COLO205细胞的凋亡。PF-477736 (250 nM) 与MK-1775联用在OVCAR-5细胞中具有显著的协同细胞毒活性。 PF-477736 (250 nM) 与 MK-1775 结合，导致 OVCAR-5 细胞中 DNA 含量介于 2N 和 4N 之间的细胞积累。 PF-477736 (250 nM) 与 MK-1775 联用会导致 OVCAR-5 细胞在 DNA 复制结束前过早发生有丝分裂，DNA 损伤最终导致细胞凋亡。

激酶活性测定：在 96 孔板中，于 30℃ 下进行 20 分钟的测定，反应体系为 0.1 mL，包含 50 mM TRIS pH 7.5、0.4 M NaCl、4 mM PEP 和 0.15 mM NADH。反应体系包含 28 单位/mL 乳酸脱氢酶、16 单位/mL 丙酮酸激酶、3 mM DTT、0.125 mM Syntide-2、0.15 mM ATP 和 25 mM 氯化镁。反应起始时加入 1 nM CHK1 激酶结构域。通过测量不同浓度 PF-477736 存在下的初始反应速率来确定 CHK1 活性的抑制情况。使用酶动力学软件和 Excel 软件分析数据，并拟合竞争性抑制的动力学模型以获得 Ki 值。 PF-477736 的激酶选择性通过筛选浓度为 1 μM 或 10 μM 的化合物，针对约 100 种蛋白激酶的面板 2 进行评估。

细胞实验：IC50 实验用于测定 PF-477736 对 p53 缺陷型人类癌细胞系的抗增殖作用。将每种细胞系的细胞以指数增长密度接种于 96 孔板的完全培养基中，并使其贴壁 16 小时。将PF-477736进行系列稀释，并在每个孔中加入适当的对照。细胞与药物孵育96小时。孵育后，向每个孔中加入用完全培养基稀释的MTT工作液，并继续孵育4小时。离心并去除上清液后，向每个孔中加入DMSO，并在SpectraMax酶标仪上于540 nm处读取吸光度值。

PF-477736 2HCl对Chk1激酶活性的抑制Ki值为0.49 nM；对CDK1的抑制作用较弱（Ki = 9.9 μM），对Chk2的抑制Ki值为47 nM。在包含超过100种蛋白激酶的检测中，仅有7种（VEGFR2、Aurora-A、FGFR3、Flt3、Fms、Ret和Yes）的抑制选择性低于100倍。[1] 在CA46细胞（p53突变型）中，PF-477736 2HCl以45 nM的EC50值（组蛋白H3磷酸化测定）消除了喜树碱诱导的G2期阻滞。在HeLa细胞中，EC50值为38 nM；在HT29细胞中，EC50值为42 nM。 [1]在HT29细胞中，PF-477736 2HCl（360 nM，8×EC50）与吉西他滨（15 nM，单独使用毒性极低）联合使用，可使细胞生长抑制率增加高达89%，且呈时间和剂量依赖性（细胞存活率测定）。PF-477736单独使用对细胞活力无显著影响。[1]在PC3细胞中，吉西他滨（30 nM）联合PF-477736 2HCl（360 nM）可显著增加γH2AX磷酸化水平，表明由于检查点抑制导致DNA损伤增加。 [1] 在 COLO205 细胞中，PF-477736 2HCl 可逆转多西他赛 (1 nM) 诱导的磷酸化组蛋白 H3 增加、γH2AX 聚集以及细胞凋亡。在高浓度多西他赛 (5-10 nM) 下，多西他赛可诱导 Chk1 磷酸化 (Ser345)；PF-477736 2HCl 可抑制磷酸化 Cdc25C (Ser216) 的胞质定位并增强细胞凋亡。[2] 在 HT29 细胞中，联合治疗 (吉西他滨 + PF-477736 2HCl) 可消除 S 期阻滞并增加细胞凋亡 (TUNEL 检测)。[1]
体内研究 (In Vivo)
PF-477736（4 mg/kg 静脉注射）在小鼠体内的终末半衰期 (T1/2) 为 2.9 小时，AUC 为 5.72 μg×hr/mL，CLp 为 11.8 mL/min/kg。在 Colo205 异种移植小鼠模型中，PF-477736 呈剂量依赖性地增强了最大耐受剂量吉西他滨的抗肿瘤活性。PF-477736（12 mg/kg）可诱导 Colo205 异种移植小鼠模型中组蛋白 H3 (Ser10) 和磷酸化组蛋白 H2AX 的磷酸化水平升高。PF-477736（15 mg/kg 腹腔注射）可增强多西他赛在 COLO205 和 MDA-MB-231 异种移植模型中诱导的肿瘤生长抑制和肿瘤生长延缓作用。 PF 477736（10 mg/kg，每日一次，腹腔注射）联合 MK-1775（30 mg/kg，每日两次，口服）可显著抑制荷瘤小鼠（OVCAR-5）的肿瘤生长。
在 COLO205 人结肠癌异种移植瘤模型中，PF-477736 2HCl（40 mg/kg，腹腔注射，每 3 天一次，共 4 次，于吉西他滨给药后 24 小时给药）可增强吉西他滨（最大耐受剂量）诱导的肿瘤生长抑制作用 75%，并将细胞杀伤对数从 0.5 提高至 1.25；疾病进展时间延长比为 3.6 倍。未观察到单药抗肿瘤活性。 [1]在COLO205异种移植瘤模型中，PF-477736 2HCl（7.5或15 mg/kg，腹腔注射，第1、8、15天，每日两次）呈剂量依赖性地增强了多西他赛（15或30 mg/kg，腹腔注射，每日一次）的疗效，显著抑制肿瘤生长并延缓肿瘤生长（P<0.05）。在15 mg/kg PF-00477736 + 30 mg/kg多西他赛的联合治疗下，12只小鼠中有3只达到完全缓解；所有肿瘤最终在单独使用多西他赛治疗后均复发。体重减轻额外增加了5%（第21天达到最低点），但在第36天恢复。[2]在MDA-MB-231异种移植瘤中，PF-477736 2HCl（15 mg/kg）联合多西他赛（15 mg/kg）显著增强了肿瘤生长抑制和延缓（P<0.05）。[2]在COLO205肿瘤中，免疫组化结果显示：PF-477736 2HCl抑制了多西他赛诱导的磷酸化组蛋白H3和胞质磷酸化Cdc25C的增加，并增加了γH2AX灶和caspase-3的表达，表明细胞凋亡增强。 [2] 生物发光成像 (BLI) 显示，PF-477736 2HCl (15 mg/kg) 可显著增强多西他赛诱导的活肿瘤细胞减少作用，最早在首次给药后 24 小时即可观察到 (P<0.05)。[2]
细胞实验
MTT增殖实验：将细胞以指数密度接种于96孔板中，培养16小时使其贴壁，然后加入系列稀释的PF-477736 2HCl。孵育96小时后，加入MTT工作液，孵育4小时，然后加入DMSO，在540 nm处读取吸光度。IC50值通过四因素分析计算。[1] PF50 MTT实验：将固定浓度的PF-477736 2HCl（8×EC50，360 nM，K562除外，其浓度为4×EC50，180 nM）与系列稀释的DNA损伤剂（吉西他滨、SN-38、卡铂、阿霉素、丝裂霉素C）混合。孵育96小时后，进行MTT实验。 PF50 = IC50（单药）/IC50（联合用药）。[1]
细胞存活率测定：HT29细胞用吉西他滨（15 nM）或喜树碱（25 nM）处理16小时，然后加入不同浓度的PF-477736 2HCl，处理4-48小时。移除含药培养基，将细胞置于无药培养基中培养，直至对照细胞汇合度达到90%（8天），然后收集细胞并计数。[1]
斑点印迹法（组蛋白H3磷酸化）：CA46细胞用喜树碱（50 nM，16小时）处理，然后在诺考达唑（0.1 μg/mL）存在下，加入递增浓度的PF-477736 2HCl，处理16小时。细胞裂解后转移至硝酸纤维素膜，用抗磷酸化组蛋白H3抗体进行探针检测，再用HRP标记的二抗和化学发光法进行检测。[1]
流式细胞术检测细胞周期和凋亡：细胞用溴脱氧尿苷和碘化丙啶（或FITC-dUTP用于凋亡检测）染色，并在FACSCalibur流式细胞仪上进行分析。[1][2]
免疫荧光：细胞固定后，用抗磷酸化组蛋白H3、γH2AX、磷酸化Cdc25C和DAPI抗体进行染色。以阳性细胞百分比进行定量。[2]
动物实验
溶于 50 nM 乙酸钠缓冲液和 4% 葡萄糖溶液（pH 4）；40 mg/kg；静脉注射。Colo205 异种移植小鼠模型
COLO205 异种移植疗效评估：将 2×10^6 个 COLO205 细胞悬浮于 50% Matrigel 中，皮下植入 5-8 周龄的雌性裸鼠（nu/nu）。当肿瘤体积达到 100-150 mm^3 时，将小鼠随机分组。PF-477736 2HCl 配制成溶于 50 mM 乙酸钠缓冲液（含 4% 葡萄糖，pH 4）的溶液，腹腔注射给药。吉西他滨每 3 天腹腔注射一次，共 4 次（每 3 天一次，共 4 次）。 PF-477736 2HCl在吉西他滨给药24小时后给予，给药方案相同，剂量为4-60 mg/kg。PF-00477736的最大耐受剂量（MTD）为40 mg/kg（基于5-10%的体重减轻和行为反应）。末次给药后2天评估肿瘤生长抑制率（TGI）。[1]
对于多西他赛联合治疗：COLO205肿瘤的建立方法类似。多西他赛（15或30 mg/kg）于第1、8和15天每日腹腔注射一次。PF-477736 2HCl（7.5或15 mg/kg）于第1、8和15天每日腹腔注射两次（0和6小时）。每周两次使用游标卡尺测量肿瘤体积。生物发光成像 (BLI)：小鼠腹腔注射 D-荧光素 (75 mg/kg)，10 分钟后使用 IVIS100 系统进行成像。[18F]FLT-PET：小鼠静脉注射 250 μCi 示踪剂，60 分钟后进行 PET/CT 成像。[2]
免疫组织化学：给药后 24 或 48 小时收集肿瘤组织，固定、切片，并进行磷酸化 Chk1 (Ser345)、磷酸化组蛋白 H3、γH2AX、磷酸化 Cdc25C 和 caspase-3 的染色。使用 Chromovision 自动化细胞成像系统进行定量分析。[2]
药代性质 (ADME/PK)
大鼠静脉注射（4 mg/kg）后：全身血浆清除率低（约占肝血流量的20%），分布容积中等（稳态），末端半衰期为2.9小时。[1]
小鼠腹腔注射后：药代动力学呈剂量依赖性。20至40 mg/kg剂量范围内AUC的增加幅度大于剂量比例，提示消除途径已饱和。[1]
与多西他赛联合用药研究中，PF-477736 2HCl和多西他赛的血浆暴露量与单药治疗相比未发生改变（数据未显示）。[2]
毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK)
在小鼠中，根据5-10%的体重下降和行为反应的严重程度，单独使用PF-477736 2HCl的最大耐受剂量（MTD）为40 mg/kg（腹腔注射，每3天一次，共4次）。[1]
当与MTD多西他赛（30 mg/kg）联合使用时，PF-477736 2HCl（15 mg/kg）在体重最低点（第21天）导致额外5%的体重下降，但该下降在第36天可逆。在亚MTD多西他赛（15 mg/kg）剂量下，未观察到额外的毒性。[2]
未报告细胞毒性药物常见副作用的加剧。[1]
参考文献
Mol Cancer Ther.2008 Aug;7(8):2394-404;Clin Cancer Res.2009 Jul 15;15(14):4630-40.
其他信息
PF-477736 2HCl 是一种 ATP 竞争性 Chk1 抑制剂，可阻断 S 期和 G2/M 期检查点以及纺锤体检查点。它能增强 DNA 损伤药物（吉西他滨、卡铂、SN-38、阿霉素、丝裂霉素 C）对 p53 缺陷型肿瘤细胞的细胞毒性，但对 p53 功能正常的正常细胞（HUVEC）的影响甚微。[1]
高浓度多西他赛可激活 DNA 损伤检查点（Chk1 Ser345 位点磷酸化）和纺锤体检查点（组蛋白 H3 磷酸化）。PF-477736 2HCl 可破坏这两个检查点，导致有丝分裂灾难和细胞凋亡。 [2]
生物标志物：PF-477736 2HCl抑制多西他赛诱导的磷酸化组蛋白H3和胞质磷酸化Cdc25C，并增加γH2AX和caspase-3。[2]
该化合物目前正与吉西他滨联合进行I期临床试验。[1]
*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性
化学信息 & 存储运输条件
分子式
C22H27CL2N7O2
分子量
492.401481866837
精确质量
491.16
CAS号
1247874-19-6
相关CAS号
1175132-90-7 (HCl);1071848-28-6 952238-93-6 (?HCl);1247874-19-6 (2HCl);952021-60-2;
PubChem CID
154731146
外观&性状
Typically exists as solid at room temperature
tPSA
130
氢键供体(HBD)数目
6
氢键受体(HBA)数目
5
可旋转键数目(RBC)
4
重原子数目
33
分子复杂度/Complexity
725
定义原子立体中心数目
1
SMILES
Cl.Cl.O=C([C@@H](C1CCCCC1)N)NC1C=C2C(NN=CC3=C(C4C=NN(C)C=4)NC(C=1)=C23)=O
InChi Key
RXRFKHCZZSOCOS-JQDLGSOUSA-N
InChi Code
InChI=1S/C22H25N7O2.2ClH/c1-29-11-13(9-25-29)20-16-10-24-28-21(30)15-7-14(8-17(27-20)18(15)16)26-22(31)19(23)12-5-3-2-4-6-12;;/h7-12,19,27H,2-6,23H2,1H3,(H,26,31)(H,28,30);2*1H/t19-;;/m1../s1
化学名
(2R)-2-amino-2-cyclohexyl-N-[2-(1-methylpyrazol-4-yl)-9-oxo-3,10,11-triazatricyclo[6.4.1.04,13]trideca-1,4,6,8(13),11-pentaen-6-yl]acetamide;dihydrochloride
别名
PF-477736;PF-736 diHCl; PF00477736;PF-00477736 dihydrochloride;PF-00477736; PF 00477736 dihydrochloride; PF 477736; PF477736
HS Tariff Code
2934.99.9001
存储方式

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month
运输条件
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
溶解度数据
溶解度 (体外实验)
DMSO: 10 mM
Water:N/A
Ethanol:N/A
制备储备液 1 mg 5 mg 10 mg
1 mM 2.0309 mL 10.1543 mL 20.3087 mL
5 mM 0.4062 mL 2.0309 mL 4.0617 mL
10 mM 0.2031 mL 1.0154 mL 2.0309 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;

4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。

计算器
计算 重置

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度，具体如下：

  • 计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
  • 计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
  • 计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度
使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示：
假如化合物的分子量为350.26 g/mol，在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少？
  • 在分子量（MW）框中输入350.26
  • 在“浓度”框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
  • 在“体积”框中输入5，然后选择正确的单位（mL）
  • 单击“计算”按钮
  • 答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式，您可以计算体积和浓度。
计算 重置

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如，可以输入C1、C2和V2来计算V1，具体如下：

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液？
使用方程式C1V1=C2V2，其中C1=10mM，C2=25μM，V2=25 ml，V1未知：
  • 在C1框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
  • 在C2框中输入25，然后选择正确的单位（μM）
  • 在V2框中输入25，然后选择正确的单位（mL）
  • 单击“计算”按钮
  • 答案62.5μL（0.1 ml）出现在V1框中
g/mol
计算 重置

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成，具体如下：

注：化学分子式大小写敏感：C12H18N3O4  c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量（分子量）的说明：
  • 要计算化合物的分子量 (摩尔质量)，请输入化学/分子式，然后单击“计算”按钮。
分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义：
  • 分子质量（或分子量）是一种物质的一个分子的质量，用统一的原子质量单位（u）表示。（1u等于碳-12中一个原子质量的1/12）
  • 摩尔质量（摩尔重量）是一摩尔物质的质量，以g/mol表示。
/
计算 重置

配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

  • 输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
  • 单击“计算”按钮
  • 答案显示在体积框中
动物体内实验配方计算器（澄清溶液）
第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量）
第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶/难溶于水的化合物），不同的产品和批次配方组成不同，如对配方有疑问，可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外，请注意这只是一个配方计算器，而不是特定产品的确切配方。
+
+
+
计算 重置

计算结果:

工作液浓度： mg/mL；

DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。

体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。

(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
            (2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

生物数据图片
  • PF-477736 HCl


    PF-00477736 abrogates the camptothecin-induced DNA damage checkpoint in a dose-dependent manner.2008 Aug;7(8):2394-404.

  • PF-477736 HCl


    PF-00477736 effectively abrogates the gemcitabine-induced S-phase arrest with a corresponding increase in apoptotic cell populations in the combination treatment compared with the gemcitabine treatment alone.2008 Aug;7(8):2394-404.

  • PF-477736 HCl


    A,PF-00477736 enhances gemcitabine-induced cytotoxicity in a time- and dose-dependent manner in HT29 cells as determined by cell survival assay.

  • PF-477736 HCl


    A,PF-00477736 potentiates the antiproliferative effect of gemcitabine.B,in vitrocytotoxicity of PF-00477736 in selected cell lines with different DNA-damaging agents.2008 Aug;7(8):2394-404.

  • PF-477736 HCl


    A,in vitroeffects of gemcitabine ± PF-00477736 on the modulation of proteins involved in the G2DNA damage checkpoint pathway.B,gemcitabine + PF-00477736 combinationin vitroleads to increased DNA damage.

  • PF-477736 HCl


    A,PF-00477736 potentiation of gemcitabine in human colon Colo205 xenograft model.B,summary of PF-00477736 potentiation of gemcitabine in human colon xenograft models.2008 Aug;7(8):2394-404.

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