Autotaxin (IC50 = 2.8 nM)
Additionally, PF-8380 inhibits rat autotaxin, a substrate for FS-3, with an IC50 of 1.16 nM. When fetal fibroblast-produced enzymes were combined with lysophosphatidylcholine (LPC) as a substrate, PF-8380's efficacy remained intact. When human whole blood was treated with PF-8380 for two hours at an IC50 of 101 nM, autocrine motility factors were suppressed [1]. Lysophospholipase D (lysoPLD) activity is exhibited by the enzyme autotaxin (ATX), which catalyzes the conversion of lysophosphatidylcholine (LPC) to lysophosphatidic acid (LPA). After applying 1 μM PF-8380 as a pretreatment to GL261 and U87-MG cells, they were exposed to 4 Gy of radiation, which led to a decrease in clone survival, reduced migration (33% in GL261; P=0.002 and 17.9% in U87-MG; P=0.012), decreased invasion (35.6% in GL261; P=0.0037; 31.8% in U87-MG; P=0.002), and attenuate radiation-induced Akt phosphorylation [2].

此外，PF-8380 还能抑制大鼠自分泌运动因子（FS-3 的底物），IC50 为 1.16 nM。当胎儿成纤维细胞产生的酶与作为底物的溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 结合时，PF-8380 的功效保持不变。当用 PF-8380 以 101 nM 的 IC50 处理人全血两小时时，自分泌运动因子受到抑制 [1]。溶血磷脂酶 D (lysoPLD) 活性由自分泌运动因子 (ATX) 发挥作用，该酶催化溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 转化为溶血磷脂酸 (LPA)。对 GL261 和 U87-MG 细胞应用 1 μM PF-8380 作为预处理后，将它们暴露于 4 Gy 的辐射下，导致克隆存活率下降，迁移减少（GL261 中为 33%；P=0.002 和 17.9%） U87-MG 中；P=0.012），侵袭减少（GL261 中 35.6%；P=0.0037；U87-MG 中 31.8%；P=0.002），并减弱辐射诱导的 Akt 磷酸化 [2]。

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使用1 µM PF-8380预处理GL261和U87-MG细胞后，再进行4 Gy照射，结果显示克隆形成能力下降，细胞迁移减少（GL261减少33%；P = 0.002；U87-MG减少17.9%；P = 0.012），细胞侵袭减少（GL261减少35.6%；P = 0.0037；U87-MG减少31.8%；P = 0.002），并减弱了辐射诱导的Akt磷酸化 [2]

在 24 小时内以 1 mg/kg 静脉注射剂量和 1 至 100 mg/kg 口服剂量检查 PF-8380 的药代动力学特性。 PF-8380的平均清除率为31 mL/min/kg，稳态分布容积为3.2 L/kg，有效t1/2为1.2 h。口服生物利用度中等，范围为 43% 至 83%。血浆浓度随着单次口服剂量的增加而增加，但 Cmax 的增加率大约与 1 至 10 mg/kg 的剂量成正比，但小于与 10 至 100 mg/kg 的剂量成正比。 PF-8380 的暴露量（通过曲线下面积测量）通常与剂量成比例，并且线性高达 100 mg/kg。采集后立即检测血浆 C16:0、C18:0 和 C20:0 LPA 水平。使用 3 mg/kg 剂量时，LPA 水平在 0.5 小时内下降幅度最大，所有 LPA 在 24 小时内恢复至或高于基线 [1]。 10 mg/kg PF-8380 治疗导致肿瘤相关血管分布适度增加 20% (P=0.497)。在 4 Gy 照射前 45 分钟，PF-8380 治疗使接受治疗的小鼠的血管分布与对照组相比减少了约 48% (P=0.031)，而仅接受放射治疗的小鼠则减少了 65% (P=0.011)[2]。

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在异位小鼠GL261肿瘤模型中，未治疗小鼠需11.2天达到肿瘤体积7000 mm³，而PF-8380（10 mg/kg）联合放疗（每次2 Gy，共五次）组需超过32天才达到相同肿瘤体积 [2]

ATX ELISA和ATX活性测定。[3]
BOS和非BOS细胞系在60mm培养皿中培养直至融合。细胞用PBS洗涤一次，然后血清饥饿24小时。收集无血清上清液，并根据制造商的方案用人ENPP-2/Autotaxin Quantikine ELISA试剂盒测量ATX水平。使用SpectraMax M3多模式微孔板读数器测量450nm处的吸光度。对于ATX活性，收集细胞上清液，在4°C下以17000 g离心10分钟，以沉淀漂浮的细胞或碎片，并用带Ultracel-3膜的Amicon Ultra-4离心过滤器浓缩至原始体积的八分之一。在测量蛋白质浓度后，用荧光磷脂ATX底物FS-3对等量的总蛋白质进行ATX活性测定。简而言之，将30μl上清液和40μl FS-3溶液（含有5μM FS-3、140 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、50 mM Tris-HCl pH 8.0和1 mg/ml BSA）混合并装载到Costar 96孔黑色壁透明底板上。分别在485nm和528nm的激发和发射波长下，使用SpectraMax M3多模微孔板读数器测量样品的荧光。 对于肺裂解物中的ATX活性测定，将20μl同种异体裂解物和40μl FS-3溶液混合，并对安慰剂和PF-8380治疗的肺同种异体移植物进行类似的ATX活动测定。

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PF-8380的浓度基于其对纯化ATX的LysoPLD活性抑制动力学数据确定 [2]

共培养克隆存活试验[2]
将HUVEC（1.0×106）和bEnd.3细胞（1.0×10^6）铺在100mm板上，24小时后，将U87-MG（2×10^7）和GL261（2×106）细胞铺在transwell插入物上。共培养24小时后，在用0、2、4、6或8 Gy照射之前，用1μM的PF-8380或载体对照DMSO处理细胞45分钟。与PF-8380或DMSO共培养处理后，将计算出的U87-MG和GL261细胞数量进行铺板，以使铺板效率正常化。孵育7至10天后，用70%乙醇固定平板，并用1%亚甲基蓝染色。通过在显微镜下观察平板，对由>50个细胞组成的菌落进行计数。存活分数计算为（集落数/铺板细胞数）/（相应对照的集落数除以铺板细胞数来）。通过对计算D0和n的α/β模型进行曲线拟合来分析生存曲线。

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细胞迁移的伤口愈合/划痕分析[2]
将GL261或U87-MG细胞一式三份铺在6cm的板上，并使其生长至70%融合。用无菌200μL移液管尖端刮擦半融合细胞层，以形成没有细胞的划痕，并用PBS洗涤平板一次，以去除非粘附细胞和碎片。对于放射增敏药物研究，在用4 Gy照射之前，用1μMPF-8380或DMSO处理细胞45分钟，然后在37°C的5%CO2中孵育。监测对照板的细胞迁移（20-24小时）。细胞用70%乙醇固定，用1%亚甲基蓝染色。为了量化迁移，对划痕区域中三个随机选择的高功率场（HPF）中的细胞进行计数，并对周围细胞密度进行归一化。计算每个治疗组的平均值和标准误差。

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肿瘤经口侵袭试验[2]
肿瘤经口基质凝胶侵袭试验以前曾用于帮助定量肿瘤与内皮的相互作用和转移。GL261（1.0×106个细胞/孔）或U87-MG（0.6×106个电池/孔）悬浮在无血清培养基中，并加入到带有8μm孔的基质涂层聚碳酸酯膜过滤器的上室（插入物）中。将500微升新鲜培养基加入底部腔室。对于放射增敏药物研究，在用4 Gy照射之前，两个腔室都用载体DMSO或1μMPF-8380处理45分钟。36小时后，用湿棉签去除膜插入物上腔室中的剩余细胞。将粘附在穿过基质凝胶侵入的transwell插入膜外表面上的细胞用100%甲醇固定并染色。使用Image J软件对每个样本的7-10个HPF中的侵袭细胞进行计数，并计算每个HPF中侵袭细胞的平均数量。计算每个治疗组的平均值和标准误差。

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克隆形成实验中，U87-MG和GL261细胞与内皮细胞共培养，用1 µM PF-8380或DMSO预处理45分钟后，进行0、2、4、6或8 Gy照射，培养7–10天，固定染色，计数>50个细胞的克隆 [2]
迁移实验中，GL261或U87-MG细胞划痕后，用1 µM PF-8380或DMSO预处理45分钟，再进行4 Gy照射，培养20–24小时，固定染色，计数迁移细胞 [2]
侵袭实验中，GL261或U87-MG细胞置于基质包被的Transwell小室中，用1 µM PF-8380或DMSO预处理45分钟，再进行4 Gy照射，培养36小时，固定染色，计数侵袭细胞 [2]
免疫印迹分析中，细胞处理后裂解，使用抗磷酸化Akt和总Akt抗体进行分析 [2]

小鼠、治疗和肿瘤生长延迟[2]
本研究中使用的所有动物实验程序均已获得IACUC批准。动物的饲养和处理均遵循DCM指南。将GL261细胞（1 × 10⁶）注射到裸鼠的右后肢。待肿瘤可触及后，将小鼠按蛇形分选法分成6至7只一组，每组代表肿瘤大小分布相似（范围 = 240 mm³）。荷瘤小鼠腹腔注射赋形剂（DMSO）或PF-8380（10 mg/kg体重），每日一次，连续5天。给药45分钟后，用异氟烷麻醉小鼠，并将其置于RS2000照射器中。随后，小鼠每天接受2 Gy的照射，连续5天，总剂量为10 Gy。使用铅块（10 mm厚）屏蔽小鼠的头部、胸部和腹部。使用外部可溯源数字游标卡尺对肿瘤大小进行纵向监测。

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在动物房的隔离室内进行灌胃给药。PF-8380和AM095溶解于PEG 400中，浓度为6 mg/ml。每日测量动物体重。从肺移植后第14天开始，每天两次通过灌胃给予PF-8380或AM095，剂量为30 mg/kg体重。安慰剂组小鼠通过灌胃给予载体（PEG 400）。肺移植后第40天，处死小鼠，并收集肺移植组织用于Western blotting、羟脯氨酸测定或免疫组织化学分析。

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将GL261细胞注射到裸鼠的右后肢。一旦肿瘤可触及，小鼠连续五天每天腹腔注射 10 mg/kg 的 PF-8380 或载体。给药 45 分钟后，小鼠每天接受 2 Gy 的放射治疗，持续五天。纵向监测肿瘤大小 [2]

PF-8380 的体内药代动力学已得到广泛研究，并显示出良好的口服生物利用度。以 30 mg/kg 的剂量口服给药时，可使血浆和炎症组织部位的 LPA 水平降低 95% 以上 [3]

长期按照所述剂量方案使用PF-8380已被证明对小鼠无毒性作用[3]

[1]. A novel autotaxin inhibitor reduces lysophosphatidic acid levels in plasma and the site of inflammation. J Pharmacol Exp Ther. 2010 Jul;334(1):310-7.

[2]. Autotaxin Inhibition with PF-8380 Enhances the Radiosensitivity of Human and Murine Glioblastoma Cell Lines. Front Oncol. 2013 Sep 17;3:236.

[3]. Autocrine lysophosphatidic acid signaling activates β-catenin and promotes lung allograft fibrosis. J Clin Invest. 2017 Apr 3;127(4):1517-1530.

自泌素是负责将溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 转化为溶血磷脂酸 (LPA) 的酶，在包括但不限于癌症、关节炎和多发性硬化症在内的多种炎症性疾病中表达上调。LPA 信号通路可促进血管生成、有丝分裂、细胞增殖和细胞因子分泌。抑制自泌素可能在多种疾病中具有抗炎作用；然而，由于缺乏有效的抑制剂，这一假设尚未得到药理学验证。本文报道了一种高效自泌素抑制剂 PF-8380 [6-(3-(哌嗪-1-基)丙酰基)苯并[d]恶唑-2(3H)-酮] 的研制，其在分离酶活性测定中的 IC50 为 2.8 nM，在人全血中的 IC50 为 101 nM。 PF-8380 具有足够的口服生物利用度和体内暴露量，可用于自体分泌素抑制的体内试验。本研究采用大鼠气囊模型，检测了自体分泌素在血浆和炎症部位产生溶血磷脂酸 (LPA) 的作用。特异性抑制剂 PF-8380 以 30 mg/kg 的剂量口服给药，3 小时内即可使血浆和气囊中的 LPA 水平降低 95% 以上，表明自体分泌素是炎症期间 LPA 的主要来源。30 mg/kg 的 PF-8380 可减轻炎症性痛觉过敏，其疗效与 30 mg/kg 的萘普生相当。血浆自体分泌素活性的抑制与炎症部位和离体全血中自体分泌素活性的抑制呈正相关。此外，还观察到密切的药代动力学/药效学关系，提示 LPA 在体内生成和降解迅速。PF-8380 可作为阐明 LPA 在炎症中作用的工具化合物。 [1]

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目的：多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种侵袭性强的原发性脑肿瘤，具有放射抗性，即使采用积极的手术、化疗和放疗也容易复发。自泌素（ATX）在包括GBM在内的多种癌症中过表达，并与肿瘤进展、侵袭和血管生成有关。我们使用ATX特异性抑制剂PF-8380，研究了ATX作为增强GBM放射敏感性的潜在靶点。方法和材料：我们使用小鼠GL261细胞和人U87-MG细胞作为GBM细胞模型。通过PF-8380进行克隆形成存活实验和肿瘤Transwell侵袭实验，以评估ATX在细胞存活和侵袭中的作用。通过免疫印迹分析放射依赖性Akt激活。使用GL261背侧皮肤褶皱模型研究肿瘤诱导的血管生成。本研究采用异位小鼠GL261肿瘤模型评估PF-8380作为放射增敏剂的疗效。结果显示：用1 μM PF-8380预处理GL261和U87-MG细胞，随后进行4 Gy照射，可降低细胞克隆形成能力、迁移能力（GL261细胞降低33%，P = 0.002；U87-MG细胞降低17.9%，P = 0.012）、侵袭能力（GL261细胞降低35.6%，P = 0.0037；U87-MG细胞降低31.8%，P = 0.002）以及放射诱导的Akt磷酸化水平。在肿瘤窗口模型中，抑制ATX可消除放射诱导的肿瘤新生血管形成（降低65%，P = 0.011）。在异位小鼠GL261肿瘤模型中，未经治疗的小鼠肿瘤体积达到7000 mm³需要11.2天，而PF-8380（10 mg/kg）联合放射治疗（5次，每次2 Gy）则需要超过32天才能达到7000 mm³的肿瘤体积。结论：PF-8380抑制ATX可降低GBM细胞的侵袭性并增强其放射敏感性。ATX抑制剂可阻断放射诱导的Akt激活。此外，ATX抑制剂还可降低肿瘤血管生成并延缓肿瘤生长。这些结果表明，抑制ATX可能改善GBM对放射治疗的反应。[2]

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组织纤维化是器官移植后长期移植物功能衰竭的主要原因。在肺移植中，进行性终末气道纤维化会导致肺功能不可逆性下降，即闭塞性细支气管炎综合征（BOS）。本研究发现了一条自分泌通路，该通路连接活化T细胞核因子2（NFAT1）、自分泌素（ATX）、溶血磷脂酸（LPA）和β-catenin，促进肺移植中纤维化的进展。源自纤维化肺移植的间充质细胞（BOS MCs）表现出组成型核β-catenin表达，且该表达依赖于自分泌ATX和LPA信号传导。我们发现，NFAT1位于ATX的上游，调控ATX和β-catenin的表达。在BOS MCs中沉默NFAT1可抑制ATX表达，而NFAT1的持续过表达则可增加非纤维化MCs中ATX的表达和活性。 LPA信号诱导NFAT1核转位，提示自分泌LPA合成通过正反馈环路促进NFAT1转录激活和ATX分泌。在小鼠原位肺移植诱导的支气管闭塞综合征（BOS）体内模型中，LPA受体（LPA1）拮抗剂或ATX抑制剂可降低移植物纤维化，并伴有活性β-catenin和去磷酸化NFAT1表达降低。来自β-catenin报告基因小鼠的肺同种异体移植在LPA1拮抗剂存在下表现出β-catenin转录激活降低，证实了LPA信号在β-catenin激活中的体内作用。[3]

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PF-8380是一种非脂质小分子自泌素（ATX）抑制剂，可抑制其溶血磷脂酶D活性，从而减少溶血磷脂酸的生成，进而减弱Akt信号传导，减少肿瘤侵袭、迁移和血管生成，并增强胶质母细胞瘤模型的放射敏感性。[2]

C22H22CL3N3O5

514.786182880402

513.062

2070015-01-7

PF-8380;1144035-53-9

78357775

White to off-white solid powder

88.2

2

6

7

33

693

0

ClC1C=C(C=C(C=1)COC(N1CCN(CCC(C2=CC=C3C(=C2)OC(N3)=O)=O)CC1)=O)Cl.Cl

JMSUDQYHPSNBSN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H21Cl2N3O5/c23-16-9-14(10-17(24)12-16)13-31-22(30)27-7-5-26(6-8-27)4-3-19(28)15-1-2-18-20(11-15)32-21(29)25-18/h1-2,9-12H,3-8,13H2,(H,25,29)

3,5-dichlorobenzyl 4-(3-oxo-3-(2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazol-6-yl)propyl)piperazine-1-carboxylate hydrochloride

PF8380 HCl; PF-8380; PF-8380 (hydrochloride); PF-8380 hydrochloride; 2070015-01-7; (3,5-dichlorophenyl)methyl 4-[3-oxo-3-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)propyl]piperazine-1-carboxylate;hydrochloride; 1-Piperazinecarboxylic acid, 4-[3-(2,3-dihydro-2-oxo-6-benzoxazolyl)-3-oxopropyl]-, (3,5-dichlorophenyl)methyl ester, hydrochloride (1:1); PF 8380

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 5.2 mg/mL (~10.10 mM)
H2O : < 0.1 mg/mL

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。