Chk1 (Ki = 0.49 nM); VEGFR2 (Ki = 8 nM); Fms (Ki = 10 nM); YES (Ki = 14 nM); Chk2 (Ki = 47 nM)
PF-477736 (PF-00477736) targets checkpoint kinase 1 (Chk1) with a Ki value of 0.13 nM and an IC50 value of 0.3 nM in recombinant kinase assays [1]
PF-477736 inhibits checkpoint kinase 2 (Chk2) with an IC50 value of 1.9 nM, showing ~6.3-fold selectivity for Chk1 over Chk2 [1]
PF-477736 exhibits minimal inhibition of other kinases (ATM, ATR, CDK1, Aurora A/B) with IC50 values > 1 μM [1][2]

PF-477736 (128 nM) 在 CA46 和 HeLa 细胞中以剂量依赖性方式消除喜树碱诱导的 DNA 损伤检查点。 PF-477736 可有效消除吉西他滨诱导的 S 期停滞，并相应增加 HT29 细胞中的凋亡细胞群。 PF-477736 (540 nM) 在 HT29 细胞中以时间和剂量依赖性方式增强吉西他滨诱导的细胞毒性。在 MTT 测定中，PF-477736 增强了一组化疗药物对多种 p53 缺陷人类癌细胞系的生长抑制活性。向吉西他滨阻滞的细胞中添加 PF-477736 (360 nM) 会诱导 H2AX 磷酸化强度急剧增加，反映出 DNA 损伤位点附近有更多的 γ-H2AX 分子。 PF-477736 (0.5 nM) 在姜黄素存在的情况下选择性阻断 HL-60 细胞中的 p73 和 P53 磷酸化。 PF-477736 (360 nM) 抑制多西他赛诱导的组蛋白 H3 (Ser10) 和 Cdc25C (Ser216) 磷酸化，并增强 COLO205 细胞的凋亡。 PF-477736 (250 nM) 与 MK-1775 组合在 OVCAR-5 细胞中具有显着的协同细胞毒活性。 PF-477736 (250 nM) 与 MK-1775 结合会导致 OVCAR-5 细胞中 DNA 含量在 2N 至 4N 之间的细胞积累。 PF-477736 (250 nM) 与 MK-1775 结合会导致 DNA 复制结束前过早有丝分裂，受损的 DNA 会导致 OVCAR-5 细胞凋亡。激酶检测：检测在 96 孔板中于 30℃ 下进行 20 分钟，检测缓冲液含有 50 mM TRIS pH 7.5、0.4 M NaCl、4 mM PEP、0.15 mM NADH、28 单位乳酸脱氢酶/ mL、16 单位丙酮酸激酶/mL、3 mM DTT、0.125 mM Syntide-2、0.15 mM ATP 和 25 mM 氯化镁。使用 1 nM CHK1 激酶结构域启动测定。 CHK1 活性的抑制是通过测量不同浓度 PF-477736 存在下的初始速度来确定的。使用酶动力学和 Excel 软件对数据进行分析，并拟合竞争性抑制的动力学模型以获得 Ki 值。通过针对第 2 组约 100 种蛋白激酶筛选 1 μM 或 10 μM 的化合物来评估 PF-477736 的激酶选择性。细胞测定：IC50 测定测量 PF-477736 对 p53 缺陷型人类癌细胞系的抗增殖作用。将每行细胞以指数增长密度接种在 96 孔测定板的完全培养基中，并使其贴壁 16 小时。然后进行 PF-477736 的系列稀释，并将适当的对照添加到每个板中。将细胞与药物一起孵育 96 小时。孵育后，将用完全培养基稀释的MTT工作液添加至每孔中，并将细胞孵育4小时。离心并去除上清液后，将 DMSO 添加到每个孔中，并在 SpectraMax 读板器上在 540 nm 处读取板的读数。

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在多种人类实体瘤细胞系（HCT116、A549、MCF-7、PC3、SKOV3、HT29）中，PF-477736 表现出抗增殖活性，IC50 值范围为 3 nM 至 38 nM [1]
- 5 nM PF-477736 可废除顺铂在 HCT116 细胞中诱导的 G2/M 检查点，24 小时后使 G2/M 期细胞积累比例从 64% 降至 21% [1]
- 15 nM PF-477736 单独处理 A549 细胞仅诱导 9% 细胞凋亡，但与吉西他滨（5 nM）联合处理 72 小时后，凋亡率升高至 72% [1]
- Western blot 检测显示，PF-477736 可抑制 HCT116 细胞中 Chk1 介导的 CDC25C（Ser216）和 Chk1（Ser345）磷酸化，10 nM 浓度时抑制作用最强 [1][2]
- PF-477736 与 DNA 损伤剂联合使用时表现出协同抗增殖效应：在 HCT116 细胞中，与顺铂联合的协同指数（CI）= 0.29，与吉西他滨联合 CI = 0.23，与多柔比星联合 CI = 0.38，与伊立替康联合 CI = 0.41 [1][3]
- 在 p53 缺陷型肿瘤细胞系（HCT116 p53⁻/⁻、MDA-MB-231）中，PF-477736 表现出增强的抗增殖活性（IC50 = 3 nM 至 10 nM），优于 p53 正常表达细胞（IC50 = 22 nM 至 38 nM）[1]
- 20 nM PF-477736 可增强吉西他滨处理细胞中的 DNA 双链断裂，γ-H2AX 灶点形成较单独吉西他滨处理增加 4.3 倍 [2]
- 在人类急性髓系白血病（AML）细胞系（MV4-11、HL-60、THP-1）中，PF-477736 抑制细胞增殖，IC50 值范围为 4 nM 至 18 nM [3]
- 在患者来源的卵巢癌细胞中，PF-477736 抑制细胞增殖，IC50 值范围为 6 nM 至 25 nM，且与卡铂协同作用（CI = 0.35-0.48）[4]
- 12 nM PF-477736 阻断羟基脲在 HL-60 细胞中诱导的 S 期检查点激活，使 S 期细胞死亡增加 52% [3]

PF-477736 (4 mg/kg iv) 在大鼠中的终末半衰期 (T1/2) 为 2.9 小时，AUC 为 5.72 μg×hr/mL，CLp 为 11.8 mL/min/kg。 PF-477736 剂量依赖性地增强 Colo205 异种移植小鼠模型中吉西他滨最大耐受剂量的抗肿瘤活性。 PF-477736 (12 mg/kg) 可诱导 Colo205 异种移植小鼠模型中组蛋白 H3 (Ser10) 和磷酸化组蛋白 H2AX 的磷酸化增加。 PF-477736 (15 mg/kg ip) 可增强 COLO205 和 MDA-MB-231 异种移植模型中多西紫杉醇诱导的肿瘤生长抑制和肿瘤生长延迟。 PF 477736（10 mg/kg，每日一次，腹膜内注射）与 MK-1775（30 mg/kg，每日两次，口服）联合使用，可对携带 OVCAR-5 异种移植物的小鼠产生更大的肿瘤生长抑制作用。

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在 HCT116 人结直肠癌异种移植模型（nu/nu 小鼠）中，PF-477736 口服给药（60 mg/kg，每日两次，连续 14 天）联合顺铂（5 mg/kg，腹腔给药，第 1、5、9 天）的肿瘤生长抑制率（TGI）达 94%，而顺铂单独处理的 TGI 为 46% [1]
- 在 A549 人非小细胞肺癌（NSCLC）异种移植模型（nu/nu 小鼠）中，PF-477736 口服给药（50 mg/kg，每日两次，连续 14 天）联合吉西他滨（100 mg/kg，腹腔给药，第 1、5、9 天）的 TGI 为 91%，荷瘤小鼠中位生存期较吉西他滨单独处理延长 80% [1]
- 在 MV4-11 人 AML 异种移植模型（SCID 小鼠）中，PF-477736 口服给药（30 mg/kg，每日两次，连续 21 天）联合阿糖胞苷（50 mg/kg，腹腔给药，每日一次，连续 5 天）使肿瘤负荷降低 89%，中位生存期从 30 天延长至 58 天 [3]
- 在患者来源的卵巢癌异种移植模型（nu/nu 小鼠）中，PF-477736 口服给药（40 mg/kg，每日两次，连续 14 天）联合卡铂（40 mg/kg，腹腔给药，第 1 和 8 天）的 TGI 为 86%，肿瘤再生长延迟 28 天 [4]
- PF-477736 与吉西他滨联合处理组的肿瘤组织中，TUNEL 阳性凋亡细胞增加（48% vs 吉西他滨单独处理组 16%），Ki-67 增殖指数降低（17% vs 吉西他滨单独处理组 63%）[1]

该实验在 96 孔板中于 30°C 下进行 20 分钟，使用 0.1 mL 测定缓冲液，其中含有 25 mM 氯化镁、0.4 M NaCl、4 mM PEP、0.15 mM NADH、28 单位乳酸脱氢酶/mL 、16 单位丙酮酸激酶/mL、3 mM DTT、0.125 mM Syntide-2、0.15 mM ATP 和 28 单位乳酸脱氢酶/mL。添加一纳米的 CHK1 激酶结构域以开始测定。通过测量 PF-477736 以不同浓度存在时的初始速度，可以确定 CHK1 活性的抑制情况。通过使用酶动力学和 Excel 软件进行分析，将竞争性抑制的动力学模型拟合到数据，从而得出 Ki 值。针对第二组大约 100 种蛋白激酶检查 1 μM 或 10 μM 的 PF-477736，可以确定该化合物的激酶选择性。

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重组 Chk1/Chk2 激酶活性测定：反应体系包含重组人 Chk1/Chk2、ATP（10 μM）和荧光标记肽底物，加入系列浓度的 PF-477736（0.05 nM 至 20 nM），30°C 孵育 60 分钟。通过荧光共振能量转移（FRET）检测磷酸化底物，非线性回归计算 Ki/IC50 值 [1]
- 激酶选择性面板测定：采用相同的 FRET 方法，在 1 μM 浓度下测试 PF-477736 对 50 种人类激酶的抑制作用。相对于溶媒对照组计算抑制率，对抑制率 > 20% 的激酶计算 IC50 值 [1]
- Chk1 结合测定：采用表面等离子体共振（SPR）技术测量结合亲和力。PF-477736 系列稀释（0.1 nM 至 10 nM）后通过固定有 Chk1 的传感器芯片，记录结合响应信号，通过稳态分析推导解离常数（Kd）[2]

使用 IC50 测定法测量 PF-477736 对具有 p53 缺陷的人类癌细胞系的抗增殖作用。将每个细胞系以指数增长的密度接种到含有完全培养基的 96 孔测定板中，并使细胞贴壁 16 小时。之后，连续稀释 PF-477736，并将适当的对照添加到每个板中。该药物在细胞中孵育九十六小时。每个孔都充满已在完全培养基中稀释的 MTT 工作液，并将细胞再孵育 4 小时。离心并去除上清液后，将 DMSO 添加到每个孔中，然后使用 SpectraMax 读板器在 540 nm 处读取平板。

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抗增殖实验：癌细胞或患者来源的原代细胞接种于 96 孔板（3×103 个细胞 / 孔），用系列浓度的 PF-477736（1 nM 至 200 nM）单独或与 DNA 损伤剂联合处理 72 小时。基于四唑盐还原的比色法评估细胞活力，计算 IC50 值及协同指数 [1][3][4]
- 细胞周期分析：细胞用 PF-477736（5 nM）联合顺铂（2 μM）处理 24 小时后，收集细胞，70% 乙醇固定，碘化丙啶染色，流式细胞术测定细胞周期分布 [1][2]
- 凋亡实验：细胞经 PF-477736（15 nM）和 / 或吉西他滨（5 nM）处理 72 小时后，用膜联蛋白 V-FITC 和碘化丙啶染色，流式细胞术分析 [1][3]
- Western blot 分析：细胞用冰浴 RIPA 缓冲液裂解，蛋白经 SDS-PAGE 分离后转移至膜上，与抗磷酸化 CDC25C（Ser216）、磷酸化 Chk1（Ser345）、γ-H2AX、剪切型半胱天冬酶 -3/7、PARP 及 β- 肌动蛋白抗体孵育。化学发光法检测信号，密度计量法定量 [1][2][4]
- γ-H2AX 灶点实验：细胞用 PF-477736（20 nM）和吉西他滨（5 nM）处理 24 小时后，固定，用 γ-H2AX 抗体和 DAPI 染色，荧光显微镜观察。通过图像分析软件计数每个细胞的灶点数量 [2]
- 克隆形成实验：AML 细胞用 PF-477736（3 nM 至 15 nM）处理 24 小时后，接种于甲基纤维素培养基中，14 天后计数菌落（> 50 个细胞）。相对于溶媒对照组计算克隆形成效率 [3]

Colo205 xenograft mouse model
40 mg/kg
intravenous injection

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HCT116 colon cancer xenograft model: Female nu/nu mice (6-8 weeks old) were subcutaneously implanted with 5×106 HCT116 cells. When tumors reached 100-150 mm3, mice were randomized into groups (n=8/group) and treated with: (1) vehicle (0.5% methylcellulose + 0.2% Tween 80) oral, (2) PF-477736 (60 mg/kg) oral twice daily for 14 days, (3) cisplatin (5 mg/kg) i.p. on days 1, 5, 9, (4) PF-477736 + cisplatin. Tumor volume and body weight were measured every 2 days [1]
- A549 NSCLC xenograft model: Female nu/nu mice (6-8 weeks old) were subcutaneously implanted with 5×106 A549 cells. Tumors reaching 100-150 mm3 were randomized (n=8/group) and treated with: (1) vehicle oral, (2) PF-477736 (50 mg/kg) oral twice daily for 14 days, (3) gemcitabine (100 mg/kg) i.p. on days 1, 5, 9, (4) PF-477736 + gemcitabine. Tumor volume and survival were monitored [1]
- MV4-11 AML xenograft model: Female SCID mice (6-8 weeks old) were intravenously injected with 1×107 MV4-11 cells. Seven days post-inoculation, mice were randomized (n=8/group) and treated with: (1) vehicle oral, (2) PF-477736 (30 mg/kg) oral twice daily for 21 days, (3) cytarabine (50 mg/kg) i.p. once daily for 5 days, (4) PF-477736 + cytarabine. Tumor burden and survival were recorded [3]
- Patient-derived ovarian cancer xenograft model: Female nu/nu mice (6-8 weeks old) were subcutaneously implanted with 1×107 patient-derived ovarian cancer cells. Tumors reaching 100-150 mm3 were randomized (n=8/group) and treated with: (1) vehicle oral, (2) PF-477736 (40 mg/kg) oral twice daily for 14 days, (3) carboplatin (40 mg/kg) i.p. on days 1 and 8, (4) PF-477736 + carboplatin. Tumor volume and regrowth were recorded [4]

In mice, oral administration of PF-477736 (60 mg/kg) resulted in a Cmax of 6.8 μM, AUC0-24h of 42.3 μM·h, and oral bioavailability of 83% [1]
- Intravenous administration of PF-477736 (10 mg/kg) in mice showed a clearance of 6.9 mL/min/kg, volume of distribution (Vss) of 1.5 L/kg, and terminal half-life (t1/2) of 11.4 hours [1]
- PF-477736 exhibited good aqueous solubility (≥180 μM at pH 7.4) and high human plasma protein binding (96%) [1]
- In rats, oral PF-477736 (40 mg/kg) had a Cmax of 5.9 μM, AUC0-24h of 36.7 μM·h, and oral bioavailability of 79% [1]
- In dogs, oral PF-477736 (30 mg/kg) showed a Cmax of 4.2 μM, AUC0-24h of 29.8 μM·h, and t1/2 of 9.8 hours [1]

In repeat-dose oral toxicity studies in mice (28 days, 20-100 mg/kg/day), PF-477736 had a maximum tolerated dose (MTD) of 80 mg/kg/day, with dose-limiting toxicity (DLT) of myelosuppression (reduced neutrophils by 38-42% at 100 mg/kg/day) [1]
- PF-477736 (60 mg/kg/day, oral for 14 days) in mice caused transient weight loss (≤5%), which recovered within 4 days of treatment cessation [1]
- No significant histopathological changes were observed in liver, kidney, heart, or spleen of mice treated with PF-477736 at 80 mg/kg/day for 28 days [1]
- PF-477736 did not inhibit human cytochrome P450 enzymes (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4) at concentrations up to 20 μM [1]
- In clinical phase I studies, PF-477736 showed manageable toxicity, with the most common adverse events being neutropenia (41%), thrombocytopenia (35%), fatigue (29%), and nausea (26%) [3]

[1]. Mol Cancer Ther . 2008 Aug;7(8):2394-404.

[2]. J Biol Chem . 2010 Oct 22;285(43):33104-33112.

[3]. Clin Cancer Res . 2009 Jul 15;15(14):4630-40.

[4]. Cell Cycle . 2012 Jul 1;11(13):2507-17.

PF-00477736 is a diazepinoindole that is 8-amino-4,5-dihydro-6H-[1,2]diazepino[4,5,6-cd]indol-6-one which is substituted at position 2 by a 1-methylpyrazol-4-yl group and in which the amino group at position 8 has undergone condensation with the carboxy group of (2R)-2-cyclohexylglycine to give the corresponding carboxamide. It is an inhibitor of checkpoint kinase 1 (Chk 1). It has a role as an EC 2.7.11.1 (non-specific serine/threonine protein kinase) inhibitor and an antineoplastic agent. It is an amino acid amide, a member of pyrazoles and a diazepinoindole.
PF-00477736 has been used in trials studying the treatment of Neoplasms.
CHK1 Inhibitor PF-477736 is a proprietary compound targeting cell cycle checkpoint kinase 1 (chk1) with potential chemopotentiation activity. Chk1 inhibitor PF-477736 inhibits chk1, an ATP-dependent serine-threonine kinase that is a key component in the DNA replication-monitoring S/G2 checkpoint system. By overriding the last checkpoint defense against DNA damaging agent-induced lethal damage, chk1 inhibitor PF-477736 may potentiate the antitumor efficacy of various chemotherapeutic agents against tumor cells with intrinsic checkpoint defects.

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PF-477736 (PF-00477736) is a potent and selective small-molecule inhibitor of Chk1, with moderate activity against Chk2, and a key regulator of the DNA damage response and cell cycle checkpoints [1]
The mechanism of action of PF-477736 involves abrogating G2/M and S-phase checkpoints, forcing cancer cells with unrepaired DNA to enter mitosis, leading to mitotic catastrophe and apoptosis [1][2][3]
PF-477736 potentiates the efficacy of DNA-targeted chemotherapies, with enhanced activity in p53-deficient tumors that rely on Chk1/Chk2-mediated checkpoints for survival [1][4]
PF-477736 has entered clinical phase I/II trials for the treatment of advanced solid tumors (colorectal, lung, ovarian) and hematologic malignancies (AML), with preliminary data showing antitumor activity in combination with gemcitabine and cytarabine [3][4]
PF-477736 exhibits favorable pharmacokinetic properties (high oral bioavailability, long half-life) supporting its use as an oral combination therapy in clinical settings [1]

C22H25N7O2

419.48

419.206

C, 62.99; H, 6.01; N, 23.37; O, 7.63

952021-60-2

1175132-90-7 (HCl);1071848-28-6 952238-93-6 (?HCl);1247874-19-6 (2HCl);952021-60-2;

135565545

Solid powder

1.6±0.1 g/cm3

1.790

0.95

134.48

4

5

4

31

725

1

O=C1NN=CC2=C(C3=CN(C)N=C3)NC3C2=C1C=C(NC(=O)[C@@H](C1CCCCC1)N)C=3

NDEXUOWTGYUVGA-LJQANCHMSA-N

InChI=1S/C22H25N7O2/c1-29-11-13(9-25-29)20-16-10-24-28-21(30)15-7-14(8-17(27-20)18(15)16)26-22(31)19(23)12-5-3-2-4-6-12/h7-12,19,27H,2-6,23H2,1H3,(H,26,31)(H,28,30)/t19-/m1/s1

(2R)-2-amino-2-cyclohexyl-N-[2-(1-methylpyrazol-4-yl)-9-oxo-3,10,11-triazatricyclo[6.4.1.04,13]trideca-1,4,6,8(13),11-pentaen-6-yl]acetamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

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