Phorbol 12,13-dibutyrate   中文名称: 佛波醇-12,13-二丁酸酯

PKC/protein kinase C

在OK细胞中，Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu) （1mm）抑制Na/ k - atp酶转运活性并激活PKC [3]

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为了确定PKC和RhoA/ROCK在人内肛门括约肌（IAS）平滑肌细胞(SMCs) 刺激状态下的未知状态。研究人员确定了PKC激活剂Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu) （10(-7) M）对人类IAS SMCs中PKCα、RhoA和ROCK II易位的影响。研究人员在PDBu后、PKC抑制剂calphostin C （10(-6) M）、细胞渗透性RhoA抑制剂C3外酶（2.5 μg/ml）和ROCK抑制剂Y 27632 （10(-6) M）前后的基础状态下，使用免疫细胞化学和荧光显微复制技术，研究人员还通过计算机数字显微法测定了SMC长度的变化。在基底状态下，PKCα几乎均匀分布在整个细胞中，而RhoA和ROCK II则位于高强度的周围。PDBu引起PKCα、RhoA和ROCK II的显著易位。calphostin C能减弱pdbu诱导的PKCα易位，而C3外泌酶和y27632则不能。然而，pdbus诱导的RhoA易位被C3外泌酶阻断，ROCK II的易位被C3外泌酶和Y 27632减弱。PDBu与RhoA/ROCK II易位同时引起的IAS SMCs的收缩被C3外泌酶和y27632减弱，而calphostin c则不减弱。在IAS SMCs中，与PKC相比，RhoA/ROCK具有组成性活性，PDBu的收缩性与RhoA/ROCK激活有关，而与PKC无关。RhoA/ROCK与PKC在IAS功能障碍的病理生理和潜在治疗中的相对作用仍有待确定。[1]

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研究人员从完整的小鼠角质形成细胞中测量了强肿瘤启动子phorbol 12-肉豆酸13-乙酸酯（PMA）、弱肿瘤启动子Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)和抗肿瘤启动子12-脱氧phorbol 13-苯乙酸酯（dPP）的解离率。PDBu和dPP的释放速度非常快（t1/2 = 1 min），而PMA的释放速度较慢（t1/2 = 9 min）。Western blot分析蛋白激酶C α (PKC α)和PKC δ在可溶性部分和Triton x -100可溶性颗粒部分的数量显示，当phorbol酯被洗掉时，这两种同工酶从可溶性部分到颗粒部分的易位是可逆的。当细胞先前用1微米dPP或1微米PDBu处理5分钟时，5-15分钟的洗涤导致PKC同工酶完全重新分布。在100或10纳米PMA处理的情况下，重新分布需要更长的时间；然而，PKC同工酶在60分钟内恢复到可溶部分。PMA、dPP和PDBu较长的初始处理（长达60分钟）以非常相似的完全可逆的方式转移PKC。研究人员得出结论，在该细胞系中，磷酯不会诱导PKC同工酶转化为完整的膜状态。[2]

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肾上皮中的Na/ k - atp酶在基底外侧表面表达，因此对载体溶质运输至关重要。Na/ k - atp酶的一种潜在调节模式涉及细胞内效应蛋白激酶C （PKC）。在肾细胞系中，Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)(1 μ m)激活PKC可抑制OK细胞中Na/ k - atp酶转运活性(Vmax降低42%；p < 0.02)，但在lc - pk1细胞中没有。通过免疫印迹，两种细胞类型均表达可检测水平的PKC α和PKC sigma。在PDBu的作用下，PKC α从细胞质转移到两种细胞系的膜部分。在两种细胞类型中，phobol酯处理增加了32PO4在多种底物中的掺入，但仅在OK细胞中检测到约109 kda的中性pI底物。Anti-LEAVE针对Na/K-ATPase所有已知α亚型的H4-H5环高度保守的序列，识别来自两种细胞系的约109 kda膜蛋白。Anti-LEAVE还发现了一种与仅存在于OK细胞中的大磷酸化蛋白相结合的蛋白质。在32PO4加载和PDBu处理后，anti-LEAVE免疫在OK细胞而不是lc - pk1细胞中沉淀了大约109 kda的磷酸化蛋白。这些数据支持PKC能够磷酸化α亚基并抑制完整肾细胞中Na/ k - atp酶转运活性的观点。此外，他们认为肾脏中某些形式的Na/ k - atp酶对PKC磷酸化不敏感，这种异质性可能有助于反应的多样性。[3]

为了探讨蛋白激酶C （PKC）在抗原诱导的气道高反应（AHR）小鼠支气管平滑肌（BSM）收缩增强中的作用，我们比较了PKC激活剂Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)对AHR小鼠支气管平滑肌收缩的影响。主动致敏小鼠反复吸入抗原刺激。最后抗原激发24小时后，测量bsm的等距收缩。乙酰胆碱能显著增强AHR小鼠的BSM收缩，但不增强高K（+）去极化。在对照小鼠的bsm中，PDBu引起组织在高K（+）预收缩时张力显著增加，尽管PDBu本身对基底张力没有影响。在AHR小鼠的bsm中，pdbu介导的收缩明显增强。这些发现表明，在抗原诱导的AHR小鼠中，pkc介导的信号通路的增加参与了bsm的增强收缩。[4]

然后通过Nitex网过滤收获SMCs。将含有细胞的滤液在室温下350 g离心10分钟。在Lab-Tek II型载玻片上，将微球中的细胞置于含有5%胎牛血清、5%青霉素-链霉素、50 μg/ml庆大霉素和2 μg/ml两性霉素B的DMEM生长培养基中，在37℃、5% CO2、湿度调节的培养箱中重悬。在calphostin C 10−6 M、C3外泌酶2.5 μg/ml或Y 27632 10−6 M前后分别用Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)(10−7 M, 20 min)处理SMCs前，将细胞附着的培养基替换为无血清培养基24 h。对于对照组，细胞不经任何药剂处理，但在与处理细胞相似的条件下。（仔细记录细胞传代，第二次传代后不使用细胞，以消除多次传代后培养基中SMC去分化的担忧。）[1]

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Western blot分析，[1]
pThr696-MYPT1和pThr18/Ser19-MLC20的水平通过Western blot分析，在对照和预处理Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)(10−7 M), calphostin C(10−6 M)， C3外泌酶（2.5 μg/ml）和y27632（10−6 M）条件下测定。用PBS冲洗细胞，用500 μl裂解缓冲液（1% SDS， 1.0 mM正钒酸钠，10 mM Tris, pH 7.4）裂解细胞，其中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒，使蛋白酶和磷酸酶失活。细胞裂解液14000 rpm离心5min，将上清转移到不同的管中，使用Pierce公司的BCA试剂盒进行蛋白定量。20 μl裂解物中20微克蛋白质与2× Laemmli样品缓冲液（终浓度为62.5 mM Tris, 1% SDS， 15%甘油，0.005%溴酚蓝，2% β-巯基乙醇）混合，置于沸水浴中5分钟。样品装于15%聚丙烯酰胺凝胶上。将分离的蛋白电泳转移到0.2 μm的免疫印迹聚偏二氟乙烯膜上。膜在奥德赛阻断缓冲液中保存1小时，用pThr696-MYPT1 pThr18/Ser19-MLC20一抗（山羊饲养）在含有0.2% Tween的奥德赛阻断缓冲液中染色过夜。用含0.2% Tween的PBS洗涤3次，每次10 min，用抗山羊红外染料（IRdye800）偶联的二抗孵育1 h，并用奥德赛红外扫描仪扫描膜。Western blot条带强度计算采用Image J 1.41 (National Institutes of Health；平均值±SE)，图表绘制为pThr696-MYPT1和pThr18/Ser19-MLC20与非磷酸化形式的MYPT1和MLC20的强度比，[1]

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为了评估可溶性PKCa和膜相关PKCa和PKCG的数量，细胞用指定剂量的PMA， Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)和dPP在37℃下处理5,15或60分钟；同一介质在同一温度下三次换洗；最后用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（不含Ca2+和MP， pH 7.4）冲洗两次。收集并裂解细胞，按照前面的描述制备可溶性颗粒和Triton x -100可溶性颗粒。在PDBu和dPP处理的情况下，由于这些配体的解离速度非常快，因此洗涤缓冲液和裂解缓冲液含有与初始孵育期间相同的PDBu或dPP浓度（见下文）。蛋白质样品经过SDS-PAGE，转移到硝化纤维素膜上。[2]

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免疫沉淀- 60mm的OK和LLCPK融合培养皿，在上述相同的条件下，为完整的细胞磷酸化，将细胞装载放射性示踪剂。单层膜用Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu) (1 pM)或Me's0处理10分钟，然后用三次冰的Krebs缓冲液洗涤。加入250 pl/皿的沉淀缓冲液（50 mM Tris-HC1, 1% Nonidet P-40,5 mM EDTA, 0.15 M NaCI, pH 8.3）后，细胞在玻璃对玻璃的匀浆器中刮匀20次。悬浮液在冰上孵卵20分钟，在50,000 X g下离心30分钟。根据三氯乙酸可沉淀计数平衡上清蛋白的数量，平均为OK细胞-35 X lo6计数/min/样品，lc - pk1细胞-7 X lo6计数/min/样品。匀浆用兔血清（1:lOO）在4℃下清洗60分钟，然后用10% （v/v）洗涤的Pansorbin清洗60分钟。清除后的上清与亲和纯化的抗leave （1:lOO）孵育过夜。在4℃下加入山羊抗兔IgG二级抗体（1:100），静置60 min，再用10%洗涤过的Pansorbin沉淀免疫复合物。在4℃下，用洗涤缓冲液（50 mM Tris-HC1, 0.15 M NaC1, 1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, pH 8.3）重悬、涡流和洗涤四次。最后一次洗涤后，将颗粒悬浮在SDS样品缓冲液中，煮沸5分钟，低速离心清除。蛋白在9% SDS-PAGE上分离，放射自显影分析。[3]

[1]. Immunocytochemical evidence for PDBu-induced activation of RhoA/ROCK in human internal anal sphincter smooth muscle cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2011 Aug;301(2):G317-25.

[2]. Dissociation of phorbol esters leads to immediate redistribution to the cytosol of protein kinases C alpha and C delta in mouse keratinocytes. J Biol Chem. 1994 Nov 4;269(44):27159-62.

[3]. Heterogeneity of protein kinase C-mediated rapid regulation of Na/K-ATPase in kidney epithelial cells. J Biol Chem. 1993 Jul 25;268(21):15958-64.

[4]. Augmented PDBu-mediated contraction of bronchial smooth muscle of mice with antigen-induced airway hyperresponsiveness. J Smooth Muscle Res. 2010;46(5):259-66.

Phorbol-12,13-dibutyrate is a white solid. (NTP, 1992)
Phorbol 12,13-dibutanoate is a phorbol ester, a butyrate ester and a tertiary alpha-hydroxy ketone.
A phorbol ester found in CROTON OIL which, in addition to being a potent skin tumor promoter, is also an effective activator of calcium-activated, phospholipid-dependent protein kinase (protein kinase C). Due to its activation of this enzyme, phorbol 12,13-dibutyrate profoundly affects many different biological systems.

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Immunocytochemical studies provide evidence for the activation of RhoA/ROCK by their translocation to the periphery of the SMCs by Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu). The increased translocation of RhoA caused by PDBu was selectively blocked by RhoA inhibitor C3 exoenzyme. In addition, PDBu-induced ROCK II translocation was selectively reversed by C3 exoenzyme and Y 27632. These observations are consistent with a number of recent studies showing the involvement of RhoA/ROCK activation in PDBu-induced actions in different systems. In addition, earlier studies in the rat IAS have shown that contraction of the SMC via direct activation by PKC is dependent on RhoA/ROCK activation. This was shown via the determination the effect of PKC and RhoA/ROCK inhibitors on the PKC-induced contraction of the SMC. In the human IAS SMCs, however, it appears that RhoA/ROCK activation via PDBu appears to be independent of PKC activation. In the present studies immunocytochemical evidence combined with the functional data suggest that PDBu-induced contraction of the human IAS SMC utilize RhoA/ROCK pathways rather than the PKC.
The exact mechanism of RhoA/ROCK activation following Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu) that is independent on PKC activation is not presently known. It is well known that PDBu can also bind to the proteins other than PKC which has C1 domain (DAG binding domain). These include GTPase-activating proteins for Rac, Ras guanyl-releasing proteins (RasGRPs), and myotonic dystrophy kinase-related Cdc42 binding kinase (MRCK), a member of Rho family G proteins. The fate of PDBu-activated PKC that does not participate in RhoA/ROCK stimulation is not presently known. In addition, whether overactivation of PKC by PDBu leads to its own downregulation or disintegration or whether it activates other unknown intermediary kinase/s for RhoA/ROCK activation remains to be determined.
We conclude that Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)-induced contraction of the human IAS SMC appears to be associated with RhoA/ROCK activation. The relative contribution of PKC vs. RhoA/ROCK pathways in the basal IAS tone in the human IAS remains to be determined.[1]

C28H40O8

504.6124

504.272

C, 66.65; H, 7.99; O, 25.36

37558-16-0

37783

White to light yellow solid powder

1.27g/cm3

623.4ºC at 760mmHg

199.3ºC

1.574

2.632

130.36

3

8

9

36

1030

8

CCCC(=O)O[C@@H]1[C@H]([C@]2([C@@H](C=C(C[C@]3([C@H]2C=C(C3=O)C)O)CO)[C@H]4[C@@]1(C4(C)C)OC(=O)CCC)O)C

BQJRUJTZSGYBEZ-YVQNUNKESA-N

InChI=1S/C28H40O8/c1-7-9-20(30)35-24-16(4)27(34)18(22-25(5,6)28(22,24)36-21(31)10-8-2)12-17(14-29)13-26(33)19(27)11-15(3)23(26)32/h11-12,16,18-19,22,24,29,33-34H,7-10,13-14H2,1-6H3/t16-,18+,19-,22-,24-,26-,27-,28-/m1/s1

Phorbol 12,13-dibutanoate

PDBu; Phorbol 12,13-dibutyrate; Phorbol 12,13-dibutyrate; 37558-16-0; PDBU; Phorbol dibutyrate; Phorbol 12,13-dibutanoate; Phorbol-12,13-dibutyrate; PHORBOL12,13-DIBUTYRATE; (1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-4a,7b-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1,1,6,8-tetramethyl-5-oxo-1,1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9-decahydro-9aH-cyclopropa[3,4]benzo[1,2-e]azulene-9,9a-diyl dibutanoate; Phorbol dibutyrate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 125 mg/mL (~247.72 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。