Phorbol 12,13-dibutyrate   中文名称: 佛波醇-12,13-二丁酸酯

PKC/protein kinase C

在OK细胞中，Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu) （1mm）抑制Na/ k - atp酶转运活性并激活PKC [3]

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为了确定PKC和RhoA/ROCK在人内肛门括约肌（IAS）平滑肌细胞(SMCs) 刺激状态下的未知状态。研究人员确定了PKC激活剂Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu) （10(-7) M）对人类IAS SMCs中PKCα、RhoA和ROCK II易位的影响。研究人员在PDBu后、PKC抑制剂calphostin C （10(-6) M）、细胞渗透性RhoA抑制剂C3外酶（2.5 μg/ml）和ROCK抑制剂Y 27632 （10(-6) M）前后的基础状态下，使用免疫细胞化学和荧光显微复制技术，研究人员还通过计算机数字显微法测定了SMC长度的变化。在基底状态下，PKCα几乎均匀分布在整个细胞中，而RhoA和ROCK II则位于高强度的周围。PDBu引起PKCα、RhoA和ROCK II的显著易位。calphostin C能减弱pdbu诱导的PKCα易位，而C3外泌酶和y27632则不能。然而，pdbus诱导的RhoA易位被C3外泌酶阻断，ROCK II的易位被C3外泌酶和Y 27632减弱。PDBu与RhoA/ROCK II易位同时引起的IAS SMCs的收缩被C3外泌酶和y27632减弱，而calphostin c则不减弱。在IAS SMCs中，与PKC相比，RhoA/ROCK具有组成性活性，PDBu的收缩性与RhoA/ROCK激活有关，而与PKC无关。RhoA/ROCK与PKC在IAS功能障碍的病理生理和潜在治疗中的相对作用仍有待确定。[1]

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研究人员从完整的小鼠角质形成细胞中测量了强肿瘤启动子phorbol 12-肉豆酸13-乙酸酯（PMA）、弱肿瘤启动子Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)和抗肿瘤启动子12-脱氧phorbol 13-苯乙酸酯（dPP）的解离率。PDBu和dPP的释放速度非常快（t1/2 = 1 min），而PMA的释放速度较慢（t1/2 = 9 min）。Western blot分析蛋白激酶C α (PKC α)和PKC δ在可溶性部分和Triton x -100可溶性颗粒部分的数量显示，当phorbol酯被洗掉时，这两种同工酶从可溶性部分到颗粒部分的易位是可逆的。当细胞先前用1微米dPP或1微米PDBu处理5分钟时，5-15分钟的洗涤导致PKC同工酶完全重新分布。在100或10纳米PMA处理的情况下，重新分布需要更长的时间；然而，PKC同工酶在60分钟内恢复到可溶部分。PMA、dPP和PDBu较长的初始处理（长达60分钟）以非常相似的完全可逆的方式转移PKC。研究人员得出结论，在该细胞系中，磷酯不会诱导PKC同工酶转化为完整的膜状态。[2]

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肾上皮中的Na/ k - atp酶在基底外侧表面表达，因此对载体溶质运输至关重要。Na/ k - atp酶的一种潜在调节模式涉及细胞内效应蛋白激酶C （PKC）。在肾细胞系中，Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)(1 μ m)激活PKC可抑制OK细胞中Na/ k - atp酶转运活性(Vmax降低42%；p < 0.02)，但在lc - pk1细胞中没有。通过免疫印迹，两种细胞类型均表达可检测水平的PKC α和PKC sigma。在PDBu的作用下，PKC α从细胞质转移到两种细胞系的膜部分。在两种细胞类型中，phobol酯处理增加了32PO4在多种底物中的掺入，但仅在OK细胞中检测到约109 kda的中性pI底物。Anti-LEAVE针对Na/K-ATPase所有已知α亚型的H4-H5环高度保守的序列，识别来自两种细胞系的约109 kda膜蛋白。Anti-LEAVE还发现了一种与仅存在于OK细胞中的大磷酸化蛋白相结合的蛋白质。在32PO4加载和PDBu处理后，anti-LEAVE免疫在OK细胞而不是lc - pk1细胞中沉淀了大约109 kda的磷酸化蛋白。这些数据支持PKC能够磷酸化α亚基并抑制完整肾细胞中Na/ k - atp酶转运活性的观点。此外，他们认为肾脏中某些形式的Na/ k - atp酶对PKC磷酸化不敏感，这种异质性可能有助于反应的多样性。[3]

为了探讨蛋白激酶C （PKC）在抗原诱导的气道高反应（AHR）小鼠支气管平滑肌（BSM）收缩增强中的作用，我们比较了PKC激活剂Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)对AHR小鼠支气管平滑肌收缩的影响。主动致敏小鼠反复吸入抗原刺激。最后抗原激发24小时后，测量bsm的等距收缩。乙酰胆碱能显著增强AHR小鼠的BSM收缩，但不增强高K（+）去极化。在对照小鼠的bsm中，PDBu引起组织在高K（+）预收缩时张力显著增加，尽管PDBu本身对基底张力没有影响。在AHR小鼠的bsm中，pdbu介导的收缩明显增强。这些发现表明，在抗原诱导的AHR小鼠中，pkc介导的信号通路的增加参与了bsm的增强收缩。[4]

然后通过Nitex网过滤收获SMCs。将含有细胞的滤液在室温下350 g离心10分钟。在Lab-Tek II型载玻片上，将微球中的细胞置于含有5%胎牛血清、5%青霉素-链霉素、50 μg/ml庆大霉素和2 μg/ml两性霉素B的DMEM生长培养基中，在37℃、5% CO2、湿度调节的培养箱中重悬。在calphostin C 10−6 M、C3外泌酶2.5 μg/ml或Y 27632 10−6 M前后分别用Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)(10−7 M, 20 min)处理SMCs前，将细胞附着的培养基替换为无血清培养基24 h。对于对照组，细胞不经任何药剂处理，但在与处理细胞相似的条件下。（仔细记录细胞传代，第二次传代后不使用细胞，以消除多次传代后培养基中SMC去分化的担忧。）[1]

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Western blot分析，[1]
pThr696-MYPT1和pThr18/Ser19-MLC20的水平通过Western blot分析，在对照和预处理Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)(10−7 M), calphostin C(10−6 M)， C3外泌酶（2.5 μg/ml）和y27632（10−6 M）条件下测定。用PBS冲洗细胞，用500 μl裂解缓冲液（1% SDS， 1.0 mM正钒酸钠，10 mM Tris, pH 7.4）裂解细胞，其中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒，使蛋白酶和磷酸酶失活。细胞裂解液14000 rpm离心5min，将上清转移到不同的管中，使用Pierce公司的BCA试剂盒进行蛋白定量。20 μl裂解物中20微克蛋白质与2× Laemmli样品缓冲液（终浓度为62.5 mM Tris, 1% SDS， 15%甘油，0.005%溴酚蓝，2% β-巯基乙醇）混合，置于沸水浴中5分钟。样品装于15%聚丙烯酰胺凝胶上。将分离的蛋白电泳转移到0.2 μm的免疫印迹聚偏二氟乙烯膜上。膜在奥德赛阻断缓冲液中保存1小时，用pThr696-MYPT1 pThr18/Ser19-MLC20一抗（山羊饲养）在含有0.2% Tween的奥德赛阻断缓冲液中染色过夜。用含0.2% Tween的PBS洗涤3次，每次10 min，用抗山羊红外染料（IRdye800）偶联的二抗孵育1 h，并用奥德赛红外扫描仪扫描膜。Western blot条带强度计算采用Image J 1.41 (National Institutes of Health；平均值±SE)，图表绘制为pThr696-MYPT1和pThr18/Ser19-MLC20与非磷酸化形式的MYPT1和MLC20的强度比，[1]

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为了评估可溶性PKCa和膜相关PKCa和PKCG的数量，细胞用指定剂量的PMA， Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)和dPP在37℃下处理5,15或60分钟；同一介质在同一温度下三次换洗；最后用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（不含Ca2+和MP， pH 7.4）冲洗两次。收集并裂解细胞，按照前面的描述制备可溶性颗粒和Triton x -100可溶性颗粒。在PDBu和dPP处理的情况下，由于这些配体的解离速度非常快，因此洗涤缓冲液和裂解缓冲液含有与初始孵育期间相同的PDBu或dPP浓度（见下文）。蛋白质样品经过SDS-PAGE，转移到硝化纤维素膜上。[2]

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免疫沉淀- 60mm的OK和LLCPK融合培养皿，在上述相同的条件下，为完整的细胞磷酸化，将细胞装载放射性示踪剂。单层膜用Phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu) (1 pM)或Me's0处理10分钟，然后用三次冰的Krebs缓冲液洗涤。加入250 pl/皿的沉淀缓冲液（50 mM Tris-HC1, 1% Nonidet P-40,5 mM EDTA, 0.15 M NaCI, pH 8.3）后，细胞在玻璃对玻璃的匀浆器中刮匀20次。悬浮液在冰上孵卵20分钟，在50,000 X g下离心30分钟。根据三氯乙酸可沉淀计数平衡上清蛋白的数量，平均为OK细胞-35 X lo6计数/min/样品，lc - pk1细胞-7 X lo6计数/min/样品。匀浆用兔血清（1:lOO）在4℃下清洗60分钟，然后用10% （v/v）洗涤的Pansorbin清洗60分钟。清除后的上清与亲和纯化的抗leave （1:lOO）孵育过夜。在4℃下加入山羊抗兔IgG二级抗体（1:100），静置60 min，再用10%洗涤过的Pansorbin沉淀免疫复合物。在4℃下，用洗涤缓冲液（50 mM Tris-HC1, 0.15 M NaC1, 1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, pH 8.3）重悬、涡流和洗涤四次。最后一次洗涤后，将颗粒悬浮在SDS样品缓冲液中，煮沸5分钟，低速离心清除。蛋白在9% SDS-PAGE上分离，放射自显影分析。[3]

[1]. Immunocytochemical evidence for PDBu-induced activation of RhoA/ROCK in human internal anal sphincter smooth muscle cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2011 Aug;301(2):G317-25.

[2]. Dissociation of phorbol esters leads to immediate redistribution to the cytosol of protein kinases C alpha and C delta in mouse keratinocytes. J Biol Chem. 1994 Nov 4;269(44):27159-62.

[3]. Heterogeneity of protein kinase C-mediated rapid regulation of Na/K-ATPase in kidney epithelial cells. J Biol Chem. 1993 Jul 25;268(21):15958-64.

[4]. Augmented PDBu-mediated contraction of bronchial smooth muscle of mice with antigen-induced airway hyperresponsiveness. J Smooth Muscle Res. 2010;46(5):259-66.

佛波醇-12,13-二丁酸酯是一种白色固体。(NTP, 1992)
佛波醇-12,13-二丁酸酯是一种佛波醇酯、丁酸酯和叔α-羟基酮。
它是一种存在于巴豆油中的佛波醇酯，巴豆油除了是一种强效的皮肤肿瘤促进剂外，还是钙激活的磷脂依赖性蛋白激酶（蛋白激酶C）的有效激活剂。由于其对该酶的激活作用，佛波醇-12,13-二丁酸酯对许多不同的生物系统产生深远的影响。

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免疫细胞化学研究表明，佛波醇-12,13-二丁酸酯(PDBu)通过促进RhoA/ROCK向平滑肌细胞(SMC)外周的转位来激活RhoA/ROCK。 PDBu 引起的 RhoA 易位增加可被 RhoA 抑制剂 C3 外酶选择性阻断。此外，PDBu 诱导的 ROCK II 易位可被 C3 外酶和 Y 27632 选择性逆转。这些观察结果与近期多项研究一致，这些研究表明 RhoA/ROCK 激活参与了 PDBu 在不同系统中诱导的作用。此外，早期在大鼠 IAS 中的研究表明，PKC 直接激活引起的 SMC 收缩依赖于 RhoA/ROCK 激活。这一结论是通过测定 PKC 和 RhoA/ROCK 抑制剂对 PKC 诱导的 SMC 收缩的影响而得出的。然而，在人 IAS SMC 中，PDBu 介导的 RhoA/ROCK 激活似乎与 PKC 激活无关。本研究结合免疫细胞化学证据和功能数据表明，PDBu诱导的人IAS SMC收缩是通过RhoA/ROCK通路而非PKC通路实现的。
目前尚不清楚佛波醇12,13-二丁酸酯（PDBu）激活RhoA/ROCK通路后，不依赖于PKC激活的确切机制。众所周知，PDBu还可以与除PKC以外的其他具有C1结构域（DAG结合结构域）的蛋白质结合。这些蛋白质包括Rac的GTP酶激活蛋白、Ras鸟苷酸释放蛋白（RasGRPs）以及肌强直营养不良激酶相关Cdc42结合激酶（MRCK，Rho家族G蛋白成员）。目前尚不清楚PDBu激活的、不参与RhoA/ROCK刺激的PKC的命运。此外，PDBu过度激活PKC是否会导致其自身下调或解体，或者是否会激活其他未知的中间激酶以激活RhoA/ROCK，仍有待确定。
我们得出结论，佛波醇12,13-二丁酸酯（PDBu）诱导的人内括约肌平滑肌细胞收缩似乎与RhoA/ROCK激活有关。PKC和RhoA/ROCK通路在人内括约肌基础张力中的相对贡献仍有待确定。[1]

C28H40O8

504.6124

504.272

C, 66.65; H, 7.99; O, 25.36

37558-16-0

37783

White to light yellow solid powder

1.27g/cm3

623.4ºC at 760mmHg

199.3ºC

1.574

2.632

130.36

3

8

9

36

1030

8

CCCC(=O)O[C@@H]1[C@H]([C@]2([C@@H](C=C(C[C@]3([C@H]2C=C(C3=O)C)O)CO)[C@H]4[C@@]1(C4(C)C)OC(=O)CCC)O)C

BQJRUJTZSGYBEZ-YVQNUNKESA-N

InChI=1S/C28H40O8/c1-7-9-20(30)35-24-16(4)27(34)18(22-25(5,6)28(22,24)36-21(31)10-8-2)12-17(14-29)13-26(33)19(27)11-15(3)23(26)32/h11-12,16,18-19,22,24,29,33-34H,7-10,13-14H2,1-6H3/t16-,18+,19-,22-,24-,26-,27-,28-/m1/s1

Phorbol 12,13-dibutanoate

PDBu; Phorbol 12,13-dibutyrate; Phorbol 12,13-dibutyrate; 37558-16-0; PDBU; Phorbol dibutyrate; Phorbol 12,13-dibutanoate; Phorbol-12,13-dibutyrate; PHORBOL12,13-DIBUTYRATE; (1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-4a,7b-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1,1,6,8-tetramethyl-5-oxo-1,1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9-decahydro-9aH-cyclopropa[3,4]benzo[1,2-e]azulene-9,9a-diyl dibutanoate; Phorbol dibutyrate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 125 mg/mL (~247.72 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。