p110α (IC50 = 2 nM); p110β (IC50 = 3 nM); p110δ (IC50 = 3 nM); p110γ (IC50 = 15 nM); mTORC1 (IC50 = 20 nM); mTORC2 (IC50 = 83 nM); DNA-PK (IC50 = 23 nM)

PI-103 有效抑制蛋白激酶 mTOR 的雷帕霉素敏感 (mTORC1) 和雷帕霉素不敏感 (mTORC2) 复合物。[1] PI-103 阻断 PI3K/Akt 激活，这种激活既是内在发生的，也是由生长因子诱导的。 [2] 在母细胞中，PI-103 可防止白血病增殖，防止白血病祖细胞克隆，并引发线粒体凋亡，特别是在白血病干细胞所在的室中。 PI-103 抑制 p110α 的效果比 p110 的抑制效果高 200 倍以上。此外，PI-103 还可有效抑制肌管和脂肪细胞中 PIP3 和 PI(3,4)P2 的合成。 [2] PI-103 抑制 Akt 磷酸化，其 IC95 比 LY294002 低 100 倍。令人惊讶的是，PI-103 完全保护动物免受胰岛素引起的血糖下降。在母细胞和未成熟白血病细胞中，PI-103 具有与依托泊苷相加的促凋亡作用。 [2]

当肿瘤达到 50-100 mm3 时，将动物随机分组并用载体或 PI-103 进行治疗。 18 天后，PI-103 显示出显着的活性，肿瘤大小平均缩小 4 倍。 [2] 在病前（根据体重、食物和水的消耗量、活动水平和一般检查）或尸检时，用 PI-103 治疗的小鼠没有表现出明显的毒性作用。正如 p110α 和 mTOR 阻断所预期的那样，治疗后的肿瘤显示出较低水平的磷酸化 Akt 和 S6。 PI-103 治疗对神经胶质瘤异种移植物具有细胞抑制作用。 [2]

使用脂质激酶活性的标准薄层色谱 (TLC) 测定或高通量膜捕获测定来测量 IC50 值。通过制备含有激酶、抑制剂（2% DMSO 最终浓度）、缓冲液（25 mM HEPES，pH 7.4，10 mM MgCl2）和新鲜超声处理的磷脂酰肌醇（100 μg/mL）的反应混合物来进行激酶反应。通过添加含有 10 μCi γ-32P-ATP 的 ATP 至终浓度 10 或 100 μM 来引发反应，并在室温下进行 20 分钟。对于 TLC 分析，通过添加 105 μL 1N HCl，然后添加 160 μL CHCl3:MeOH (1:1) 来终止反应。将双相混合物涡旋，短暂离心，并使用预涂有 CHCl3 的凝胶加样移液器吸头将有机相转移至新管中。将该提取物点样在 TLC 板上，并在 65:35 正丙醇：1M 乙酸溶液中显色 3-4 小时。然后将 TLC 板干燥，暴露于磷光成像屏幕并定量。对于每种化合物，激酶活性通常在 10-12 个抑制剂浓度下测量，代表从测试的最高浓度 (100 μM) 稀释两倍。对于表现出显着活性的化合物，IC50 测定重复两到四次，报告值是这些独立测量值的平均值。

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在 1 μmol/L ATP 存在下，使用闪烁邻近测定法测定磷脂酰肌醇 3-激酶抑制活性。 Invitrogen 基于 TR-FRET 的 LanthaScreen 技术用于确定 mTOR 蛋白激酶是否受到抑制。使用 GraphPad Prism 软件，在 1 mol/L ATP 存在下，计算最大浓度为 10 mol/L 的每种化合物的 IC50 值。[1]

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蛋白激酶测定[1]
在含有25 mM HEPES、pH 7.4、10 mM MgCl2、200μM ATP（2.5μCi的γ-32P-ATP）和0.5 mg/mL BSA的测定中，对重组全长Abl或Abl（T315I）（Upstate）的Abl、Abl（T305I）抑制剂（终浓度：10μM）进行三次测定。优化的Abl肽底物EAIYAPFAKK用作磷酸受体（200μM）。通过在磷酸纤维素片上点样终止反应，用0.5%磷酸洗涤（约6次，每次5-10分钟）。将纸张干燥，并通过磷化法对转移的放射性进行定量。[1]

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Akt1、Akt1（ΔPH）、Akt2、Akt2（ΔPH)[1]
在含有25 mM HEPES、PH 7.4、10 mM MgCl2、200μM ATP（2.5μCi的γ-32P-ATP）和0.5 mg/mL BSA的试验中，对重组全长Akt1、Akt2、Akt3、Akt1（ΔPH）或Akt2（ΔPH。通过在硝化纤维上点样终止反应，用1M NaCl/1%磷酸洗涤硝化纤维（约6次，每次5-10分钟）。将纸张干燥，并通过磷化法对转移的放射性进行定量。[1]

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有关激酶活性测试的更多信息，请参阅本文的补充材料/SI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2946820/).

使用基于 Invitrogen TR-FRET 的 LanthaScreen 技术来评估 mTOR 蛋白激酶的抑制作用。为了计算 IC50 值，在 1 μmol/L ATP 存在下以最大浓度 10 mol/L 测试化合物。 将 PI-103 应用于 U87MG 细胞 24 小时。使用细胞毒性检测试剂盒和 LDH 活性的比色测定来测量细胞死亡。计算细胞死亡百分比（每个实验点三个12孔板的平均值）的计算方法为[（实验值-低对照）/（高对照-低对照）×100]，其中低对照用DMSO处理，使用 Triton 进行高度控制（1% Triton X-100，30 分钟，37°）。

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人肿瘤细胞系U87MG、PC3、SKOV-3、IGROV-1、Detroit 562、HCT116、SNUC2B和LoVo购自美国典型培养物保藏中心。所有癌症细胞系均在含有2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM中生长，并在37°C的空气中添加10%胎牛血清和5%CO2。人脐静脉内皮细胞（混合）及其适当的生长培养基和补充剂购自TCS CellWorks。根据供应商的说明培养细胞，并在第3至8代使用。通过台盼蓝排斥法判断，细胞存活率通常>90%。所有细胞系经PCR检测均为支原体阴性。使用Alamar Blue或磺基罗丹明B测定法测定导致肿瘤细胞增殖抑制50%的GI50值（浓度），对于人脐血管内皮细胞，在连续暴露于化合物96小时后，通过碱性磷酸酶测定法测定GI50值。在该试验之前，抗生素已被移除。[3]

PTEN状态在大多数细胞系中得到验证，包括U87MG和IGROV-1，通过内部蛋白质印迹法进行蛋白质表达，此外，PIK3CA状态通过测序进行实验确定或验证。在结肠癌癌症细胞系的情况下，PTEN状态再次通过Western印迹在实验室内部得到证实。此外，使用单核苷酸多态性（SNP）分析来确认基因型与癌症基因组计划宇宙数据库3中提供的基因型相匹配，随后从该数据库中获得了KRAS和PIK3CA突变状态的数据。[3]

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细胞系的易位、免疫印迹和磷酸蛋白免疫测定[3]
叉头易位试验如前所述进行。免疫印迹按如下方式进行。将细胞以3至5×105个细胞/孔的速度接种在2 mL培养基中的6孔板中，使其附着过夜，并用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂处理指定时间。孵育期后，小心地从孔中取出培养基，并向每个孔中加入约150μL补充有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的冰冷细胞提取缓冲液。在4°C下以14000×g离心10分钟后收集细胞上清液，并使用BCA蛋白检测试剂盒定量其蛋白质浓度。

对于蛋白质印迹，通过SDS-PAGE分离30μg每种裂解物，电转移到硝化纤维膜上，并用特异性一抗和辣根过氧化物酶偶联的二抗进行检测。用增强化学发光试剂检测信号。甘油醛-3-磷酸脱氢酶用作负载对照。

小鼠：将 100 万个细胞（溶于 PBS）皮下注射到 5 至 6 月龄的雄性小鼠体内，细胞来源可以是 FVB/N 品系或裸鼠 BALB/c 品系。当肿瘤体积达到 50 至 100 mm³ 时，每天给小鼠注射 50 mg/kg 索拉非尼和/或 10 mg/kg 或 70 mg/kg PI-103。对照组小鼠注射等量的 DMSO。每两天测量一次小鼠的体重和肿瘤大小。待小鼠死亡后取出肿瘤并进行处理。

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异种移植[2]
将 10⁶ 个 U87MG:ΔEGFR 细胞皮下注射到 6 至 12 周龄的 Balbc nu/nu 小鼠（Harlan Sprague-Dawley）左前肢尾侧。已建立肿瘤（50–100 mm³）的小鼠被随机分配到腹腔注射组，分别接受 5 mg/kg 的 PI-103（溶于 50% DMSO）或仅接受 50% DMSO（对照组）。每隔 4 天用游标卡尺测量肿瘤直径，每个数据点取 5 只小鼠的数据计算肿瘤体积（mm³ = 宽度² × 长度/2）。尸检时，对所有器官进行大体和显微镜分析，以评估毒性。

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异种移植瘤疗效和药效学研究[3]
将 200 万个 U87MG 人胶质母细胞瘤细胞双侧皮下注射到本实验室培育的 6 至 8 周龄雌性 CrTac: Ncr-Fox1(nu) [Ncr] 无胸腺小鼠体内。 PI-540 用无菌生理盐水配制，PI-620 用无菌水配制，GDC-0941 用 10% DMSO、5% Tween 20 和 85% 无菌生理盐水配制。化合物以 0.1 mL/10 g 体重的溶剂稀释，每日一次或两次给药（PI-540 和 PI-620 腹腔注射；GDC-0941 口服）。对照组动物接受等体积的相应溶剂。当实体瘤形成良好（平均直径约 5 mm）时开始进行治疗研究的给药，并按照图例中所示的方案持续给药。测量肿瘤的两个垂直直径，并根据公式 V = 4/3π [(d1 + d2) / 4]3 (29) 计算肿瘤体积。定期称量动物体重并观察不良反应。实验结束后，采集小鼠血液，制备血浆样本，并切除肿瘤称重。治疗组/对照组百分比 (T/C) 的值由治疗组与对照组的最终肿瘤重量计算得出。末次给药后，每隔一段时间采集肿瘤样本进行速冻，用于药代动力学和/或药效学分析。对于专门的药效学研究，动物连续给药 4 天，并按上述方法采集样本。血浆和肿瘤样本中化合物浓度的分析以及肿瘤样本中生物标志物调控的评估，均采用 Meso Scale Discovery 电化学发光免疫分析和/或免疫印迹法，如前所述 (29, 34)。在一些实验中，采用与 U87MG 类似的方法研究了 IGROV-1 人卵巢癌异种移植瘤。

GDC-0941 的药代动力学 [3]
PI-103 的血浆和组织清除率快是由于酚基的快速葡萄糖醛酸化所致。尽管与 PI-103 相比，PI-540 和 PI-620 在小鼠和人微粒体中的代谢有所降低，但仍观察到显著的体内葡萄糖醛酸化。这解释了前文所述的快速清除现象。为了消除这种代谢缺陷，我们合成并测试了多种酚类等排体。含有增溶剂磺酰哌嗪的吲唑衍生物 GDC-0941 显示出有限的微粒体代谢，使其口服生物利用度达到 78%，此外，它还对磷脂酰肌醇 3-激酶通路具有强效抑制活性（图 1B 和 E）。图 6A 显示了以 75 mg/kg 的剂量口服 GDC-0941 给携带 U87MG 胶质母细胞瘤异种移植瘤的无胸腺小鼠后的药代动力学。GDC-0941 吸收迅速，给药后 30 分钟即达到血药浓度峰值 (Cmax)。肿瘤分布同样迅速，Cmax 也在同一时间达到。尽管肿瘤与血浆的浓度比约为 0.8，但这些特性使得给药后 6 小时肿瘤内药物浓度远高于 GI50。

[1]. Cell. 2006 May 19;125(4):733-47.

[2]. Cancer Cell. 2006 May;9(5):341-9.

[3]. Mol Cancer Ther. 2009 Jul;8(7):1725-38.

PI-103 是一种有机杂三环化合物，其结构为吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶，在 2 位和 4 位分别被 3-羟基苯基和吗啉-4-基取代。它是一种具有抗癌特性的双重激酶抑制剂。PI-103 可作为 EC 2.7.1.137（磷脂酰肌醇 3-激酶）抑制剂、mTOR 抑制剂和抗肿瘤药物。它属于吗啉类、酚类、有机杂三环化合物、叔胺类化合物和芳香胺类化合物。PI-103 是 I 类 PI3K 的 p110α 抑制剂。

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磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3-K) 是一类重要的药物靶点，但 PI3-K 同工酶的独特作用仍不甚明了。本文介绍了一种药理学研究PI3-K家族的方法。我们合成了一系列化学结构多样的PI3-K抑制剂，并通过生化方法对其靶点选择性进行了枚举，揭示了不同靶点和化学类型之间存在的隐蔽同源性。三种抑制剂与p110γ结合的晶体结构表明，p110γ存在一个构象灵活的区域，该区域可被选择性化合物特异性地利用。随后，我们利用该化合物阵列确定了胰岛素信号传导所需的PI3-K亚型。我们发现，在培养细胞中，p110α是主要的胰岛素反应性PI3-K，而p110β并非必需，但它设定了p110α活性的表型阈值。靶向p110α的化合物能够阻断胰岛素治疗在体内的急性效应，而p110β抑制剂则没有这种作用。这些结果展示了利用涵盖一个蛋白质家族的抑制剂矩阵进行系统性靶点验证的方法。[1]

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PI3激酶家族是一类脂质激酶，它通过生成第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PI3K）来促进细胞生长和存活。为了确定PI3K激活驱动的癌症的关键靶点，我们筛选了一系列靶向该酶家族的高效且结构多样的类药分子。令人惊讶的是，尽管许多化合物能够通过其下游效应分子Akt阻断PI3K信号传导，但只有一种化合物（PI-103）能够抑制胶质瘤细胞的增殖。PI-103独特的细胞活性直接源于其能够同时抑制PI3Kα和mTOR。PI-103在异种移植瘤中显示出显著活性，且未观察到毒性。这些数据表明，在恶性胶质瘤中，mTOR 和 PI3 激酶 α 的联合抑制具有显著的疗效。[2]磷脂酰肌醇 3-激酶通路在人类癌症中经常失调，其抑制剂具有巨大的治疗潜力。我们之前报道了一种有前景的三环吡啶并呋喃嘧啶先导化合物和化学工具化合物 PI-103。现在，我们报道了经药学优化的双环噻吩并嘧啶衍生物 PI-540 和 PI-620 的性质，以及由此产生的临床开发候选药物 GDC-0941。所有四种化合物均能抑制磷脂酰肌醇 3-激酶 p110α，IC50 ≤ 10 nmol/L。尽管这些化合物在亚型选择性方面存在一些差异，但它们在体外对多种人类癌细胞系表现出与PI-103相似的抗增殖特性，在PTEN阴性的U87MG人胶质母细胞瘤细胞中具有亚微摩尔级的效力，并且对磷脂酰肌醇3-激酶通路具有相似的调节作用。PI-540和PI-620在溶解度和代谢方面均有所改善，并在小鼠体内具有较高的组织分布。在无胸腺小鼠的U87MG胶质母细胞瘤异种移植模型中，腹腔注射PI-540和PI-620后，其抗肿瘤疗效均优于PI-103。PI-540（50 mg/kg，每日两次）和PI-620（25 mg/kg，每日两次）的治疗组/对照组比值分别为34%（抑制率66%）和27%（抑制率73%）。 GDC-0941在体外抗肿瘤活性与PI-103、PI-540和PI-620相当，在小鼠体内口服生物利用度为78%。口服150 mg/kg后，肿瘤暴露浓度在8小时内仍高于50%的抗增殖浓度，并持续抑制磷脂酰肌醇3-激酶通路。这些特性使其具有优异的剂量依赖性口服抗肿瘤活性，每日口服150 mg/kg可分别抑制U87MG胶质母细胞瘤和IGROV-1卵巢癌异种移植瘤98%和80%的生长。综上所述，这些数据支持将GDC-0941开发为一种高效、口服生物利用度高的磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂。GDC-0941近期已进入I期临床试验。[3]

C₁₉H₁₇CLN₄O₃

384.82

384.099

C, 59.30; H, 4.45; Cl, 9.21; N, 14.56; O, 12.47

371935-79-4

PI-103;371935-74-9; 371935-79-4 (HCl)

16739368

Light yellow to yellow solid

3.847

84.51

2

7

2

27

489

0

Cl.O1CCN(C2=C3C(C4=CC=CN=C4O3)=NC(C3C=CC=C(C=3)O)=N2)CC1

XSQMYBFFYPTMFE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H16N4O3.ClH/c24-13-4-1-3-12(11-13)17-21-15-14-5-2-6-20-19(14)26-16(15)18(22-17)23-7-9-25-10-8-23;/h1-6,11,24H,7-10H2;1H

3-(6-morpholin-4-yl-8-oxa-3,5,10-triazatricyclo[7.4.0.02,7]trideca-1(9),2(7),3,5,10,12-hexaen-4-yl)phenol;hydrochloride

PI-103 hydrochloride; PI-103 HCl; PI 103 HYDROCHLORIDE; PI-103 Hydrochloride; 3-(6-morpholin-4-yl-8-oxa-3,5,10-triazatricyclo[7.4.0.02,7]trideca-1(9),2(7),3,5,10,12-hexaen-4-yl)phenol;hydrochloride; CHEMBL538346; PI 103 HCl; PI103 HCl

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 4.1~24 mg/mL (10.7~68.9 mM)
Ethanol: ~19.7 mg/mL (~60.2 mM)