p110α (IC50 = 8 nM); p110β (IC50 = 88 nM); p110δ (IC50 = 48 nM); p110γ (IC50 = 150 nM); mTORC1 (IC50 = 20 nM); mTORC2 (IC50 = 83 nM); PI3KC2β (IC50 = 26 nM); PI3KC2α (IC50 = 1 μM); hsVPS34 (IC50 = 2.3 μM); DNA-PK (IC50 = 2 nM); ATR (IC50 = 850 nM); ATM (IC50 = 920 nM); PI4KIIIβ (IC50 = 50 μM)

PI-103 有效抑制蛋白激酶 mTOR 的雷帕霉素敏感 (mTORC1) 和雷帕霉素不敏感 (mTORC2) 复合物。[1] PI-103 阻断 PI3K/Akt 激活，这种激活既是内在发生的，也是由生长因子诱导的。 [2] 在母细胞中，PI-103 可防止白血病增殖，防止白血病祖细胞克隆，并引发线粒体凋亡，特别是在白血病干细胞所在的室中。 PI-103 抑制 p110α 的效果是 p110β 的 200 倍以上。此外，PI-103 还可有效抑制肌管和脂肪细胞中 PIP3 和 PI(3,4)P2 的合成。 [2] PI-103 抑制 Akt 磷酸化，IC95 比 LY294002 低 100 倍。令人惊讶的是，PI-103 完全保护动物免受胰岛素引起的血糖下降。在母细胞和未成熟白血病细胞中，PI-103 具有与依托泊苷相加的促凋亡作用。 [2]

当肿瘤尺寸为 50 至 100 mm3 时，用载体或 PI-103 治疗动物。 18 天后，PI-103 显示出显着的活性，肿瘤大小平均缩小 4 倍。 [2]病前（根据体重、食物和水的消耗量、活动水平和一般检查）或尸检时，接受 PI-103 治疗的小鼠没有表现出明显的毒性作用。正如 p110α 和 mTOR 阻断所预期的那样，治疗后的肿瘤显示出较低水平的磷酸化 Akt 和 S6。 PI-103 治疗对神经胶质瘤异种移植物具有细胞抑制作用。[2]

在 1 μmol/L ATP 存在下，使用闪烁邻近测定法测定磷脂酰肌醇 3-激酶抑制活性。 Invitrogen 基于 TR-FRET 的 LanthaScreen 技术用于确定 mTOR 蛋白激酶是否受到抑制。使用 GraphPad Prism 软件，在 1 mol/L ATP 存在下，计算最大浓度为 10 mol/L 的每种化合物的 IC50 值。[1]

---

蛋白激酶测定[1]
在含有25 mM HEPES、pH 7.4、10 mM MgCl2、200μM ATP（2.5μCi的γ-32P-ATP）和0.5 mg/mL BSA的测定中，对重组全长Abl或Abl（T315I）（Upstate）的Abl、Abl（T305I）抑制剂（终浓度：10μM）进行三次测定。优化的Abl肽底物EAIYAPFAKK用作磷酸受体（200μM）。通过在磷酸纤维素片上点样终止反应，用0.5%磷酸洗涤（约6次，每次5-10分钟）。将纸张干燥，并通过磷化法对转移的放射性进行定量。[1]

---

Akt1、Akt1（ΔPH）、Akt2、Akt2（ΔPH)[1]
在含有25 mM HEPES、PH 7.4、10 mM MgCl2、200μM ATP（2.5μCi的γ-32P-ATP）和0.5 mg/mL BSA的试验中，对重组全长Akt1、Akt2、Akt3、Akt1（ΔPH）或Akt2（ΔPH。通过在硝化纤维上点样终止反应，用1M NaCl/1%磷酸洗涤硝化纤维（约6次，每次5-10分钟）。将纸张干燥，并通过磷化法对转移的放射性进行定量。[1]

---

有关激酶活性测试的更多信息，请参阅本文的补充材料/SI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2946820/).

将 PI-103 应用于 U87MG 细胞 24 小时。使用细胞毒性检测试剂盒和 LDH 活性的比色测定来测量细胞死亡。计算细胞死亡百分比（每个实验点三个12孔板的平均值）的计算方法为[（实验值-低对照）/（高对照-低对照）×100]，其中低对照用DMSO处理，使用 Triton 进行高度控制（1% Triton X-100，30 分钟，37°）。

---

人肿瘤细胞系U87MG、PC3、SKOV-3、IGROV-1、Detroit 562、HCT116、SNUC2B和LoVo购自美国典型培养物保藏中心。所有癌症细胞系均在含有2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM中生长，并在37°C的空气中添加10%胎牛血清和5%CO2。人脐静脉内皮细胞（混合）及其适当的生长培养基和补充剂购自TCS CellWorks。根据供应商的说明培养细胞，并在第3至8代使用。通过台盼蓝排斥法判断，细胞存活率通常>90%。所有细胞系经PCR检测均为支原体阴性。使用Alamar Blue或磺基罗丹明B测定法测定导致肿瘤细胞增殖抑制50%的GI50值（浓度），对于人脐血管内皮细胞，在连续暴露于化合物96小时后，通过碱性磷酸酶测定法测定GI50值。在该试验之前，抗生素已被移除。[3]

PTEN状态在大多数细胞系中得到验证，包括U87MG和IGROV-1，通过内部蛋白质印迹法进行蛋白质表达，此外，PIK3CA状态通过测序进行实验确定或验证。在结肠癌癌症细胞系的情况下，PTEN状态再次通过Western印迹在实验室内部得到证实。此外，使用单核苷酸多态性（SNP）分析来确认基因型与癌症基因组计划宇宙数据库3中提供的基因型相匹配，随后从该数据库中获得了KRAS和PIK3CA突变状态的数据。[3]

---

细胞系的易位、免疫印迹和磷酸蛋白免疫测定[3]
叉头易位试验如前所述进行。免疫印迹按如下方式进行。将细胞以3至5×105个细胞/孔的速度接种在2 mL培养基中的6孔板中，使其附着过夜，并用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂处理指定时间。孵育期后，小心地从孔中取出培养基，并向每个孔中加入约150μL补充有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的冰冷细胞提取缓冲液。在4°C下以14000×g离心10分钟后收集细胞上清液，并使用BCA蛋白检测试剂盒定量其蛋白质浓度。

对于蛋白质印迹，通过SDS-PAGE分离30μg每种裂解物，电转移到硝化纤维膜上，并用特异性一抗和辣根过氧化物酶偶联的二抗进行检测。用增强化学发光试剂检测信号。甘油醛-3-磷酸脱氢酶用作负载对照。

小鼠：将 100 万个细胞（溶于 PBS）皮下注射到 5 至 6 月龄的雄性小鼠体内，细胞来源可以是 FVB/N 品系或裸鼠 BALB/c 品系。当肿瘤体积达到 50 至 100 mm³ 时，每天腹腔注射 (IP) 10 mg/kg 或 70 mg/kg 的 PI-103。对照组小鼠注射等量的 DMSO。每两天测量一次小鼠的体重和肿瘤大小。待小鼠死亡后取出肿瘤并进行处理。

---

异种移植[2]
将 10⁶ 个 U87MG:ΔEGFR 细胞皮下注射到 6 至 12 周龄的 Balbc nu/nu 小鼠（Harlan Sprague-Dawley）左前肢尾侧。已建立肿瘤（50–100 mm³）的小鼠被随机分配到腹腔注射组，分别接受 5 mg/kg 的 PI-103（溶于 50% DMSO）或仅接受 50% DMSO（对照组）。每隔 4 天用游标卡尺测量肿瘤直径，每个数据点取 5 只小鼠的数据计算肿瘤体积（mm³ = 宽度² × 长度/2）。尸检时，对所有器官进行大体和显微镜分析，以评估毒性。

---

异种移植瘤疗效和药效学研究[3]
将 200 万个 U87MG 人胶质母细胞瘤细胞双侧皮下注射到本实验室培育的 6 至 8 周龄雌性 CrTac: Ncr-Fox1(nu) [Ncr] 无胸腺小鼠体内。 PI-540 用无菌生理盐水配制，PI-620 用无菌水配制，GDC-0941 用 10% DMSO、5% Tween 20 和 85% 无菌生理盐水配制。化合物以 0.1 mL/10 g 体重的溶剂稀释，每日一次或两次给药（PI-540 和 PI-620 腹腔注射；GDC-0941 口服）。对照组动物接受等体积的相应溶剂。当实体瘤形成良好（平均直径约 5 mm）时开始进行治疗研究的给药，并按照图例中所示的方案持续给药。测量肿瘤的两个垂直直径，并根据公式 V = 4/3π [(d1 + d2) / 4]3 (29) 计算肿瘤体积。定期称量动物体重并观察不良反应。实验结束后，采集小鼠血液，制备血浆样本，并切除肿瘤称重。治疗组/对照组百分比 (T/C) 的值由治疗组与对照组的最终肿瘤重量计算得出。末次给药后，每隔一段时间采集肿瘤样本进行速冻，用于药代动力学和/或药效学分析。对于专门的药效学研究，动物连续给药 4 天，并按上述方法采集样本。血浆和肿瘤样本中化合物浓度的分析以及肿瘤样本中生物标志物调控的评估，均采用 Meso Scale Discovery 电化学发光免疫分析和/或免疫印迹法，如前所述 (29, 34)。在一些实验中，采用与 U87MG 类似的方法研究了 IGROV-1 人卵巢癌异种移植瘤。

GDC-0941 的药代动力学 [3]
PI-103 的血浆和组织清除率快是由于酚基的快速葡萄糖醛酸化所致。尽管与 PI-103 相比，PI-540 和 PI-620 在小鼠和人微粒体中的代谢有所降低，但仍观察到显著的体内葡萄糖醛酸化。这解释了前文所述的快速清除现象。为了消除这种代谢缺陷，我们合成并测试了多种酚类等排体。含有增溶剂磺酰哌嗪的吲唑衍生物 GDC-0941 显示出有限的微粒体代谢，使其口服生物利用度达到 78%，此外，它还对磷脂酰肌醇 3-激酶通路具有强效抑制活性（图 1B 和 E）。图 6A 显示了以 75 mg/kg 的剂量口服 GDC-0941 给携带 U87MG 胶质母细胞瘤异种移植瘤的无胸腺小鼠后的药代动力学。GDC-0941 吸收迅速，给药后 30 分钟即达到血药浓度峰值 (Cmax)。肿瘤分布同样迅速，Cmax 也在同一时间达到。尽管肿瘤与血浆的浓度比约为 0.8，但这些特性使得给药后 6 小时肿瘤内药物浓度远高于 GI50。

[1]. Cell. 2006 May 19;125(4):733-47.

[2]. Cancer Cell. 2006 May;9(5):341-9.

[3]. Mol Cancer Ther. 2009 Jul;8(7):1725-38.

PI-103 是一种有机杂三环化合物，其结构为吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶，2 位和 4 位分别被 3-羟基苯基和吗啉-4-基取代。它是一种具有抗癌特性的双重激酶抑制剂。PI-103 可作为 EC 2.7.1.137（磷脂酰肌醇 3-激酶）抑制剂、mTOR 抑制剂和抗肿瘤药物。它属于吗啉类、酚类、有机杂三环化合物、叔胺类化合物和芳香胺类化合物。
PI-103 是 I 类 PI3K 的 p110α 抑制剂。

---

磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3-K) 是一类重要的药物靶点，但 PI3-K 同工酶的独特作用仍不甚明了。本文介绍了一种药理学方法，用于研究PI3-K家族。我们合成了一系列化学结构多样的PI3-K抑制剂，并通过生化方法对其靶点选择性进行了枚举，揭示了不同靶点和化学类型之间存在的隐蔽同源性。三种抑制剂与p110γ结合的晶体结构表明，p110γ上存在一个构象灵活的区域，该区域可被选择性化合物特异性地利用。随后，我们利用该化合物阵列确定了胰岛素信号传导所需的PI3-K亚型。我们发现，在培养细胞中，p110α是主要的胰岛素反应性PI3-K，而p110β并非必需，但它设定了p110α活性的表型阈值。靶向p110α的化合物能够阻断体内胰岛素治疗的急性效应，而p110β抑制剂则没有这种作用。这些结果展示了利用涵盖整个蛋白家族的抑制剂矩阵进行系统性靶点验证的方法。 [1]

---

PI3激酶家族是一类脂质激酶，它通过生成第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PI3K）来促进细胞生长和存活。为了确定PI3K激活驱动的癌症的关键靶点，我们筛选了一系列靶向该酶家族的高效且结构多样的类药分子。令人惊讶的是，尽管许多化合物能够通过其下游效应分子Akt阻断PI3K信号通路，但只有单一化合物（PI-103）能够抑制胶质瘤细胞的增殖。PI-103独特的细胞活性直接源于其能够同时抑制PI3Kα和mTOR。PI-103在异种移植瘤中显示出显著活性，且未观察到毒性。这些数据表明，在恶性胶质瘤中，mTOR和PI3Kα的联合抑制具有显著的疗效。 [2]磷脂酰肌醇3-激酶通路在人类癌症中经常失调，其抑制剂具有巨大的治疗潜力。我们之前报道了一种有前景的三环吡啶并呋喃嘧啶先导化合物和化学工具化合物PI-103。现在，我们报道了经药学优化的双环噻吩并嘧啶衍生物PI-540和PI-620以及由此产生的临床开发候选药物GDC-0941的性质。这四种化合物均能抑制磷脂酰肌醇3-激酶p110α，IC50≤10 nmol/L。尽管在亚型选择性方面存在一些差异，但这些化合物在多种人类癌细胞系中表现出与PI-103相似的体外抗增殖活性，在PTEN阴性的U87MG人胶质母细胞瘤细胞中具有亚微摩尔级的效力，并且对磷脂酰肌醇3-激酶通路的调节作用也相当。 PI-540 和 PI-620 在小鼠体内表现出溶解度和代谢的改善，且组织分布良好。在无胸腺小鼠的 U87MG 胶质母细胞瘤异种移植模型中，腹腔注射 PI-540 和 PI-620 后，其抗肿瘤疗效均优于 PI-103。PI-540（50 mg/kg，每日两次）和 PI-620（25 mg/kg，每日两次）的治疗组/对照组比值分别为 34%（抑制率 66%）和 27%（抑制率 73%）。GDC-0941 的体外抗肿瘤活性与 PI-103、PI-540 和 PI-620 相当，在小鼠体内口服生物利用度为 78%。口服 150 mg/kg 后，肿瘤暴露浓度在 8 小时以上仍高于 50% 的抗增殖浓度，并持续抑制磷脂酰肌醇 3-激酶通路。这些特性使其具有优异的剂量依赖性口服抗肿瘤活性，每日口服150 mg/kg剂量分别可抑制U87MG胶质母细胞瘤和IGROV-1卵巢癌异种移植瘤98%和80%的生长。这些数据共同支持将GDC-0941开发为一种强效、口服生物利用度高的磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂。GDC-0941近期已进入I期临床试验。[3]

C19H16N4O3

348.36

384.8163

C, 59.30; H, 4.45; Cl, 9.21; N, 14.56; O, 12.47

371935-74-9

PI-103 Hydrochloride;371935-79-4; 371935-79-4 (HCl); 371935-74-9

9884685

Light yellow to green yellow solid powder

1.409 g/cm3

520.25ºC at 760 mmHg

1.712

3.847

84.51

1

7

2

26

489

0

O1C([H])([H])C([H])([H])N(C2C3=C(C4C([H])=C([H])C([H])=NC=4O3)N=C(C3C([H])=C([H])C([H])=C(C=3[H])O[H])N=2)C([H])([H])C1([H])[H]

TUVCWJQQGGETHL-UHFFFAOYSA-N

nChI=1S/C19H16N4O3/c24-13-4-1-3-12(11-13)17-21-15-14-5-2-6-20-19(14)26-16(15)18(22-17)23-7-9-25-10-8-23/h1-6,11,24H,7-10H2

3-(6-morpholin-4-yl-8-oxa-3,5,10-triazatricyclo[7.4.0.02,7]trideca-1(9),2(7),3,5,10,12-hexaen-4-yl)phenol

UNII-YQX02F616F; Phenol, 3-[4-(4-morpholinyl)pyrido[3',2':4,5]furo[3,2-d]pyrimidin-2-yl]-;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.05 mg/mL (3.01 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 1.05 mg/mL (3.01 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

View More

配方 3 中的溶解度: 1% DMSO +30% polyethylene glycol+1% Tween 80 : 30mg/mL

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。