(+)-Pinoresinol   中文名称: (+)-松脂酚

In glioblastoma cells (LN428, U87MG, LN2308, U251), the primary target of pinoresinol is the cellular FLICE-inhibitory protein long isoform (cFLIP_L) and survivin, leading to their downregulation at the post-translational level. Pinoresinol reduces cFLIP_L and survivin protein levels via proteasome-mediated degradation, thereby facilitating TRAIL DISC formation and caspase-8 activation. No IC50, Ki, EC50, or DC50 values for direct binding to cFLIP or survivin are reported. In ants (Formica exsectoides), pinoresinol acts as a feeding deterrent, but specific molecular targets are not identified. [1][2]

松脂醇可诱导TRAIL耐药的胶质母细胞瘤细胞构建死亡诱导信号复合物，进而激活caspase-8依赖性凋亡级联反应[2]。在TRAIL耐药的胶质母细胞瘤细胞（LN428、U87MG、LN2308、U251）中，用无毒剂量的松脂醇（0.2-1 μM）联合TRAIL（50 ng/mL）处理可诱导快速凋亡和caspase激活。联合处理9小时后开始出现细胞死亡，并在24小时内迅速增加（图2A）。单独使用松脂醇（浓度最高1 μM，处理24小时）仅显示出轻微的生长抑制作用（细胞死亡率<5%）。 0.5 μM 松脂醇与 50 ng/mL TRAIL 联合处理可显著增加细胞死亡（24 小时后约 80-90%）（图 1D）。这种增敏作用在多种胶质母细胞瘤细胞系（U87MG、LN2308、LN428、U251）中均有观察到，但在正常原代星形胶质细胞中未观察到（图 2B）。细胞死亡依赖于 caspase，因为预先使用泛 caspase 抑制剂 z-VAD-FMK (20 μM) 或 caspase-8 抑制剂 z-IETD-fmk (50 μM) 可完全消除细胞毒性，而坏死抑制剂 necrostatin-1 (30 μM) 则未能起到保护作用（图 2C、D）。 Annexin V/PI染色结果显示，松脂醇联合TRAIL显著增加了早期凋亡细胞（Annexin V+）的比例，而z-VAD-FMK可抑制这一过程（图2E）。Western blot分析表明，松脂醇联合TRAIL在6小时后激活了caspase-8和caspase-3，并导致PARP裂解；而z-IETD-fmk可抑制这一过程（图2F）。松脂醇（0.5 μM）以时间依赖性方式降低cFLIP_L和survivin的蛋白水平（从4-6小时开始），但不影响死亡受体（DR4/5）、FADD、RIP1、TRAF2、cIAP1/2、XIAP、Bcl-x_SL或Bid的表达。在HT-29细胞中，松脂醇也下调了cFLIP_S的表达。RT-PCR结果显示，松脂醇（0.5-1 μM）处理后，cFLIP_L和survivin的mRNA水平没有变化（图4C）。用蛋白酶体抑制剂MG132（10 μM）预处理可阻止松脂醇诱导的cFLIP_L和survivin的下调（图4D）。野生型cFLIP_L的过表达显著降低了松脂醇联合TRAIL诱导的细胞死亡和caspase级联激活；cFLIP_L突变体（K167/195R）则更显著地抑制了细胞凋亡。 Survivin 的过表达不影响细胞死亡（图 5A、B）。免疫沉淀实验表明，在 LN428 细胞中，TRAIL 单独作用可导致 cFLIP_L 募集至 DISC，同时 FADD 和 caspase-8/10 的检测较弱；用松脂醇 (0.5 μM) 预处理可增加 DISC 的形成和 procaspase-8/10 的加工，减少 DISC 结合的 cFLIP_L，并导致 procaspase-8 完全加工为活性 p18 亚基（图 5C）。 0.5 μM 的松脂醇不影响 NF-κB 转录活性（TNF 或 TRAIL 诱导的活性经松脂醇预处理后显著降低，但 IκBα 超抑制因子或 TPCA-1 的过表达不改变 TRAIL 的敏感性）（图 3A-C）。松脂醇对野生型和 p53 缺失型 HCT116 细胞中 TRAIL 诱导的细胞死亡的敏感性增强程度相似，且不诱导 p53 或 p21 的表达（图 3D、E）。在无细胞体外转录/翻译实验中，0.1-1 μM 的松脂醇以剂量依赖的方式抑制 GFP 的产生，与环己酰亚胺 (CHX) 的作用类似。使用体外合成的EGFP mRNA，1 μM松脂醇完全抑制了EGFP蛋白的表达，其效果与10 μM CHX相当（图6C、D）。0.5 μM松脂醇也能降低cFLIP_L和survivin蛋白的表达水平，其动力学与10 μM CHX相似，且联合处理并未加速这种下调（图6B）。在MG132存在的情况下，0.5 μM松脂醇处理4小时后，泛素化的cFLIP_L水平低于单独使用MG132处理组（图6A）。在蚂蚁中，以0.001、0.01、0.1、1.0和5.0 μg/只果蝇的剂量，局部涂抹松脂醇，测试其驱避作用。当松脂醇剂量≥1 μg/只果蝇时，蚂蚁携带果蝇的持续时间缩短（<3分钟），且梳理行为（自我清洁）增加。当松脂醇剂量为1 μg/只果蝇时，100%的蚂蚁携带果蝇的时间均少于3分钟，且100%的蚂蚁都进行了梳理行为；当剂量为5 μg/只果蝇时，效果类似。该效应具有统计学意义（携带行为：P < 0.001，χ²=27.45，df=5，n=66；梳理行为：P < 0.001，χ²=29.69，df=2，n=66）。相比之下，mayolene-16 仅在每只果蝇 5 μg 的剂量下才表现出驱避作用（携带持久性：P<0.001，χ²=11.0，df=1，n=22）。[1][2]

在利用蚂蚁（Formica exsectoides）进行的昆虫行为学实验中，松脂醇表现出拒食活性。实验中，工蚁被喂食单只果蝇（Drosophila melanogaster，残翅品系），这些果蝇事先用甲醇溶液（1 μL）局部处理，松脂醇的剂量分别为每只果蝇0.001、0.01、0.1、1.0和5.0 μg。对照组果蝇仅接受1 μL甲醇溶液处理。当每只果蝇接受≥1 μg松脂醇处理时，蚂蚁携带果蝇超过3分钟的倾向显著降低，并且梳理触角（用前足擦拭触角）的行为显著增加。在每只果蝇1 μg松脂醇处理组中，0%的蚂蚁携带果蝇超过3分钟（对照组为100%），且100%的蚂蚁都进行了梳理触角的行为（对照组为0%）。该效应呈剂量依赖性。松脂醇的效力比马约烯-16 更强，后者仅在 5 μg/只果蝇时才显示出驱避作用。[1]

人胶质母细胞瘤细胞（LN428、U87MG、LN2308、U251MG）培养于含10%胎牛血清（FBS）、2 mmol/L谷氨酰胺和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基中。正常原代星形胶质细胞取自新生大鼠，培养于含10%胎牛血清（FBS）、2 mmol/L谷氨酰胺和100 U/mL青霉素/链霉素的MEM培养基中。为评估细胞活力，将细胞接种于96孔板中，先用松脂醇（0.2-1 μM）处理30分钟，再用TRAIL（50 ng/mL）处理24小时。使用Cell Titer-Glo发光细胞活力检测试剂盒（通过酶标仪测量发光值）定量细胞死亡。细胞活力计算公式为（1 − 处理组/对照组）× 100%。使用倒置显微镜拍摄代表性图像。Annexin V/PI染色：处理后收集细胞，按照试剂盒说明书，在HEPES缓冲液（pH 7.4）中用FITC标记的Annexin V和碘化丙啶进行双重染色，并通过流式细胞仪（FACScan）进行分析。细胞周期分析：将细胞固定于70%乙醇中，用PBS洗涤，然后在室温下用PI溶液（100 μg/mL PI，含50 μg/mL RNase）染色30分钟，最后通过流式细胞仪进行分析。免疫印迹实验中，细胞在冰冷的M2缓冲液（20 mM Tris pH 7.6、0.5% NP-40、250 mM NaCl、3 mM EDTA、3 mM EGTA、2 mM DTT、0.5 mM PMSF、20 mM β-甘油磷酸钠、1 mM钒酸钠、1 µg/mL亮抑蛋白酶肽）中裂解。裂解液经8-12% SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转移至PVDF膜上，分别与一抗（1:1000稀释）和二抗（1:2000稀释）孵育，并通过增强化学发光法显色。免疫沉淀实验中，细胞裂解液与抗caspase-8抗体和蛋白A-琼脂糖珠于4℃孵育过夜；免疫沉淀物用M2缓冲液洗涤三次，然后进行免疫印迹分析。对于RT-PCR，使用ReliaPrep RNA Miniprep试剂盒分离总RNA，使用M-MLV逆转录酶制备cDNA。PCR引物：cFLIP_L（5′-CTGGTTGCCCCAGATCAACT-3′和5′-CCCAGGGAAGTGAAGGTGTC-3′）；survivin（5′-TGACGACCCCATAGAGGAACA-3′和5′-TCAATCCATGGCAGCCAGC-3′）；GAPDH（5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′和5′-GATGGCATGGACTGTGGTCA-3′）。对于转染和荧光素酶检测，使用Lipofectamine将p2xNF-κB-Luc和pRSV-β-半乳糖苷酶转染至LN428细胞，然后用TNF（30 ng/mL）或TRAIL（50 ng/mL）处理6小时；使用试剂盒测定荧光素酶活性，并以β-半乳糖苷酶活性进行标准化。对于cFLIP_L过表达，将细胞转染pCA-flag-cFLIP_L（野生型或K167/195R突变体）或pCA-flag-survivin 24小时，然后用TRAIL（50 ng/mL）和松脂醇（1 μM）处理12小时。[2]

为了进行蚂蚁驱避试验，我们从自然栖息地采集了红腹蚁（Formica exsectoides），并将其饲养在大型水族箱中。果蝇（Drosophila melanogaster，残翅品系）来自实验室培养，通过冷却使其活动受限。将松脂醇溶解于甲醇中，使用微量移液器以1 μL的体积，分别将0.001、0.01、0.1、1.0和5.0 μg的剂量局部涂抹于果蝇身上。同时测试了Mayolene-16，剂量为0.1和5 μg/只果蝇。对照组果蝇涂抹1 μL甲醇。涂抹后，让果蝇静置10-30分钟，待甲醇挥发（果蝇恢复完全活动能力）。每次试验均将一只处理过的果蝇提供给一只被限制在培养皿中的蚂蚁，并录制10分钟的视频。每个剂量组和对照组均进行了 11 次试验，每次试验均使用新鲜的蚂蚁和苍蝇。记录的参数包括：（i）蚂蚁用上颚携带苍蝇的时间长度，以及（ii）蚂蚁是否进行自我清洁（梳理）行为。[1]

在胶质母细胞瘤细胞中，浓度高达 1 μM 的松脂醇单独作用 24 小时仅显示出轻微的生长抑制作用（细胞死亡率 <5%），表明其剂量无毒。在正常原代星形胶质细胞中，松脂醇 (0.5 μM) 与 TRAIL (50 ng/mL) 联合使用未诱导细胞死亡，提示其对癌细胞具有选择性。[1][2]

[1]. Pinoresinol: A lignol of plant origin serving for defense in a caterpillar. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Oct 17;103(42):15497-501.

[2]. Accelerated degradation of cFLIPL and sensitization of the TRAIL DISC-mediated apoptotic cascade by pinoresinol, a lignan isolated from Rubia philippinensis. Sci Rep. 2019 Sep 18;9(1):13505.

(+)-松脂醇是松脂醇的对映异构体，具有(+)-1S,3aR,4S,6aR-构型。它具有降血糖作用，是一种植物代谢产物和植物雌激素。据报道，松脂醇存在于茶树（Camellia sinensis）、多齿双齿虫（Disynaphia multicrenulata）和其他具有相关数据的生物体中。另见：巴西莓果肉（部分）。

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松脂醇是松柏醇的木脂素二聚体，广泛分布于植物中。在菜粉蝶（Pieris rapae）幼虫中，它从寄主植物甘蓝（Brassica oleracea）中吸收；幼虫将其分泌为防御混合物的一部分（马约烯：松脂醇 ≈ 96:4）。确定毛虫体内的绝对构型为(-)-松脂醇，对映体纯度为94%。以人工小麦胚芽饲料（不含卷心菜）喂养毛虫的实验表明，其分泌物中缺乏松脂醇；补充(±)-松脂醇（占干物质的0.1%）后，分泌物中出现了松脂醇，表明松脂醇被隔离。卷心菜叶片中不含游离的松脂醇或简单的糖苷，但卷心菜提取物经酸水解后，从两株植物中得到约0.1 mg的松脂醇以及表松脂醇，表明松脂醇以聚合物结合的形式存在。在癌症生物学中，松脂醇通过抑制从头蛋白质合成（类似于环己酰亚胺）发挥TRAIL增敏剂的作用，导致短寿命抗凋亡蛋白cFLIP_L和survivin通过蛋白酶体降解而快速周转，从而促进DISC介导的caspase-8激活和TRAIL耐药胶质母细胞瘤细胞的凋亡。它不通过NF-κB或p53通路发挥作用。松脂醇还能诱导LN428细胞发生G2/M期阻滞（增加G2期细胞比例）（补充图34）。此外，据报道，松脂醇在高浓度（≥10 μM）下可通过抑制NF-κB抑制NF-κB来抑制P-糖蛋白（P-gp）介导的外排，并表现出抗炎特性。[1][2]

C20H22O6

358.3851

358.141

C, 67.03; H, 6.19; O, 26.78

487-36-5

73399

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

556.5±50.0 °C at 760 mmHg

121 °C

290.4±30.1 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.598

1.54

77.38

2

6

4

26

431

4

COC1=C(C=CC(=C1)[C@@H]2[C@H]3CO[C@@H]([C@H]3CO2)C4=CC(=C(C=C4)O)OC)O

HGXBRUKMWQGOIE-AFHBHXEDSA-N

InChI=1S/C20H22O6/c1-23-17-7-11(3-5-15(17)21)19-13-9-26-20(14(13)10-25-19)12-4-6-16(22)18(8-12)24-2/h3-8,13-14,19-22H,9-10H2,1-2H3/t13-,14-,19+,20+/m0/s1

4-[(3S,3aR,6S,6aR)-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrofuro[3,4-c]furan-3-yl]-2-methoxyphenol

NSC 35444; (+)-Pinoresinol

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~279.03 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。