PRN694

别名: PRN 694 PRN-694 PRN694 PRN694

目录号: V13140 纯度: ≥98%

COA 产品数据产品说明书 SDS

PRN694 (PRN-694) 是一种新型、高选择性、不可逆/共价双重抑制剂，白介素 2 诱导型 T 细胞激酶 (ITK) 和静息淋巴细胞激酶 (RLK) 的 IC50 分别为 0.3 nM 和 1.4 nM。

PRN694 CAS号: 1575818-46-0
产品类别: New1

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Nature 2025, 643(8070):192-200.

Nature 2024 Dec 18.

Nature 2021, 597(7874):119-125.

Cell 2020,183:1202-1218.e25.

Science Adv 2022: 8, eabm9427.

Nat Neurosci 2024, 27:1468-1474.

Science Adv 2025, 11(33):eadr5199.

Nat Metab 2024, 6: 1108-1127.

Cell Stem Cell 2024, 31:106-126.e13.

Nature 597, 119–125 (2021)

Cell Stem Cell 2020,26(6):845-861.e12.

Science Trans Med 2023,15(701):eadd7872.

STTT 2023,8(1):91.

Cell Reports 2023,42(4):112313

Science Trans Med 2023, 15: eadd7872.

Cancer Cell 2021,39(4):529-547.e7.

Cancer Discov 2022,12(4):1106-1127.

Immunity 2023,56(3):620-634.e11.

Immunity 2024,57:2651-2668.e12.

J Am Chem Soc 2022,144:21831-21836.

Cell 2020,183:1202-1218.e25.

Science Adv 2022:8,eabm9427.

Nature 2021,597(7874):119-125.

Cell 2020,183:1202-1218.e25.

PNAS Nexus 2022,1(3):pgac063.

ACS Nano 2023,17(10):9110-9125.

Biomaterial 2023 Sep16:302:122333.

产品描述
生物活性&实验参考方法
化学信息
溶解度数据
计算器
生物数据图片

产品描述

PRN694 (PRN-694) 是一种新型高选择性、不可逆/共价双重抑制剂，可抑制白细胞介素-2诱导的T细胞激酶 (ITK) 和静息淋巴细胞激酶 (RLK)，其IC50值分别为0.3 nM和1.4 nM。PRN694在ITK和RLK上具有较长的靶向停留时间，从而能够在体外和体内持久抑制效应细胞。
PRN694 (CAS#: 1575818-46-0) 是一种强效、选择性且不可逆的双重抑制剂，可抑制白细胞介素-2诱导的T细胞激酶 (ITK) 和布鲁顿酪氨酸激酶 (BTK)。它是一种共价抑制剂，靶向T细胞和B细胞中的关键信号酶，调节免疫细胞活化和细胞因子产生。目前正在研究其在治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病方面的应用。

生物活性&实验参考方法

靶点	PRN694 specifically targets the Tec kinases ITK and resting lymphocyte kinase (RLK, also known as TXK). It acts as an irreversible, highly selective, and potent covalent dual inhibitor. The IC50 values for ITK and RLK are 0.3 nM and 1.4 nM, respectively. It also inhibits BTK.
体外研究 (In Vitro)	PRN694 对 TEC、BTK、BMX、BLK 和 JAK3 的抑制 IC50 值分别为 3.3、17、17、125 和 30 nM[1]。免疫印迹分析显示，PRN694 可抑制 NFAT1、JunB、pIκBα 和 pERK 的激活或核转位。研究结果表明，PRN694 在浓度高于 1 nM 时可抑制 Ca2+ 信号传导。当 PRN694 的添加量高于 0.37 μM 时，可显著降低 FcR 诱导的 NK 细胞死亡[1]。第6天流式细胞术分析显示，PRN694显著抑制了抗CD3/CD28诱导的CD4和CD8 T细胞的增殖（p<0.01）[1]。体外实验表明，PRN694对ITK和RLK具有强效抑制作用，IC50值分别为0.3 nM和1.4 nM。它是一种共价抑制剂，这意味着它与靶点形成不可逆的结合，即使在血浆清除后也能持续发挥药效作用。
体内研究 (In Vivo)	在给药后1、6和14小时，PRN694对ITK的占有率分别为98%、95%和54%。14小时时，PRN694的血浆浓度比全血IC50值低十倍以上。此外，PRN694治疗组的体重显著低于对照组（p<0.05）[1]。结肠炎研究表明，PRN694治疗组小鼠结肠上皮细胞中的CD4+ T细胞数量少于对照组小鼠[2]。体内实验表明，PRN694的共价抑制作用即使在血浆清除后仍能持续发挥药效。PRN694通过靶向T细胞和B细胞中的ITK和BTK，调节免疫细胞活化和细胞因子产生。这种机制使其成为治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病的潜在候选药物。
酶活实验	将终浓度为 0.5 μM 的重组 ITK 溶于 50 mM Hepes（pH 7.5）、10 mM MgCl₂、0.01% Triton X-100 和 1 mM EGTA 的缓冲液中，并与 1.5 μM PRN694 混合 90 分钟以促进结合。然后将混合物稀释 50 倍以启动配体与酶的解离，并取 10 μL 转移至 Greiner 384 孔黑色板中。向每个孔中加入铕标记的抗 His6 抗体并孵育 5 分钟，随后加入 ITK 结合荧光示踪剂。示踪剂与 ITK 的结合与配体解离有关，并通过酶标仪检测铕标记抗体与示踪剂之间的时间分辨 FRET 来检测结合情况。采集的时间点为 0.25、1、3、6 和 24 小时[1]。采用无细胞 PRN694 检测方法来测定其对激酶活性的抑制作用。在这些检测中，将重组激酶（ITK 或 BTK）与底物肽和 ATP 在不同浓度的化合物存在下孵育。通过测定磷酸化底物的量来计算 IC50 值。
细胞实验	细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37°C、5% CO2条件下进行体外培养。细胞用PRN694或其他抑制剂预处理30分钟，然后洗涤两次。T细胞用1 μg/mL可溶性抗CD3抗体刺激6小时以激活CD69，并通过流式细胞术检测；或用包被于培养板上的抗CD3抗体（接种浓度为10 μg/mL）和可溶性抗CD28抗体（1 μg/mL）刺激45分钟，用于后续免疫印迹信号分析。NK细胞用包被于培养板上的抗CD52抗体刺激6小时以激活CD107a/b，并通过流式细胞术检测；或用包被于培养板上的抗CD52抗体刺激45分钟，用于后续免疫印迹信号分析[1]。进行基于细胞的体外PRN694检测，以评估其对免疫细胞的影响。用该化合物处理T细胞和B细胞，并评估其对下游信号通路的抑制作用。该化合物对细胞因子产生的影响也可以用ELISA法测定。
动物实验	PRN694的体内动物实验将采用自身免疫性疾病和炎症性疾病模型，例如类风湿性关节炎、狼疮或银屑病。实验中将给动物施用该化合物，并评估其对疾病进展和免疫细胞活化的影响。
药代性质 (ADME/PK)	现有文献中未提供PRN694的药代动力学(PK)数据详情。作为一种共价抑制剂，即使在血浆清除后，它仍能提供持续的药效作用。该化合物通常以粉末形式储存。
毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK)	公开文献中没有关于PRN694的毒理学数据。作为一种研究化合物，其安全性尚未得到充分表征。该化合物仅供研究用途。
参考文献	[1]. Targeting interleukin-2-inducible T-cell kinase (ITK) and resting lymphocyte kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. J Biol Chem. 2015 Mar 6;290(10):5960-78. [2]. A Small Molecule Inhibitor of ITK and RLK Impairs Th1 Differentiation and Prevents Colitis Disease Progression. J Immunol. 2015 Nov 15;195(10):4822-31.
其他信息	PRN694 是一种研究级化合物，也是一种强效、选择性强、不可逆的 ITK 和 BTK 双重抑制剂。它用于研究针对自身免疫性疾病的靶向免疫调节疗法。该化合物尚未获准用于临床。所有信息仅供研究参考。

*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性

化学信息 & 存储运输条件

分子式	C28H35F2N5O2S
分子量	543.67
精确质量	543.247
CAS号	1575818-46-0
PubChem CID	90044055
外观&性状	Off-white to light brown solid powder
密度	1.3±0.1 g/cm3
沸点	679.8±65.0 °C at 760 mmHg
闪点	364.9±34.3 °C
蒸汽压	0.0±2.1 mmHg at 25°C
折射率	1.619
LogP	3.92
tPSA	108
氢键供体(HBD)数目	2
氢键受体(HBA)数目	7
可旋转键数目(RBC)	10
重原子数目	38
分子复杂度/Complexity	856
定义原子立体中心数目	2
SMILES	C[C@@H](C(C)(C)C)NCC1=CC2=C(C=C1)N(C(=N2)NC(=O)C3=CC=C(S3)C(F)F)C[C@H]4CCCN4C(=O)C=C
InChi Key	NXTKFBGDLDPFLB-PKOBYXMFSA-N
InChi Code	InChI=1S/C28H35F2N5O2S/c1-6-24(36)34-13-7-8-19(34)16-35-21-10-9-18(15-31-17(2)28(3,4)5)14-20(21)32-27(35)33-26(37)23-12-11-22(38-23)25(29)30/h6,9-12,14,17,19,25,31H,1,7-8,13,15-16H2,2-5H3,(H,32,33,37)/t17-,19+/m0/s1
化学名	5-(difluoromethyl)-N-[5-[[[(2S)-3,3-dimethylbutan-2-yl]amino]methyl]-1-[[(2R)-1-prop-2-enoylpyrrolidin-2-yl]methyl]benzimidazol-2-yl]thiophene-2-carboxamide
别名	PRN 694 PRN-694 PRN694
HS Tariff Code	2934.99.9001
存储方式	Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month
运输条件	Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

溶解度数据

溶解度 (体外实验)	DMSO : ~125 mg/mL (~229.92 mM)
溶解度 (体内实验)	配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。配方 2 中的溶解度:* ≥ 2.08 mg/mL (3.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 View More* 配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。

溶解度 (体外实验)

DMSO : ~125 mg/mL (~229.92 mM)

溶解度 (体内实验)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。

制备储备液		1 mg	5 mg	10 mg
	1 mM	1.8394 mL	9.1968 mL	18.3935 mL
	5 mM	0.3679 mL	1.8394 mL	3.6787 mL
	10 mM	0.1839 mL	0.9197 mL	1.8394 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;

4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。

计算器

质量

浓度

体积

分子量*

计算重置

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度，具体如下：

计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度

参见示例

使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示：
假如化合物的分子量为350.26 g/mol，在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少？

在分子量（MW）框中输入350.26
在“浓度”框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
在“体积”框中输入5，然后选择正确的单位（mL）
单击“计算”按钮
答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式，您可以计算体积和浓度。

浓度 (起始)

体积 (起始)

浓度 (终)

体积 (终)

计算重置

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如，可以输入C1、C2和V2来计算V1，具体如下：

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液？
使用方程式C1V1=C2V2，其中C1=10mM，C2=25μM，V2=25 ml，V1未知：

在C1框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
在C2框中输入25，然后选择正确的单位（μM）
在V2框中输入25，然后选择正确的单位（mL）
单击“计算”按钮
答案62.5μL（0.1 ml）出现在V1框中

分子式

分子量

g/mol

计算重置

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成，具体如下：

注：化学分子式大小写敏感：C12H18N3O4 c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量（分子量）的说明：

要计算化合物的分子量 (摩尔质量)，请输入化学/分子式，然后单击“计算”按钮。

分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义：

分子质量（或分子量）是一种物质的一个分子的质量，用统一的原子质量单位（u）表示。（1u等于碳-12中一个原子质量的1/12）
摩尔质量（摩尔重量）是一摩尔物质的质量，以g/mol表示。

配液体积

质量

配液浓度

计算重置

配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
单击“计算”按钮
答案显示在体积框中

动物体内实验配方计算器（澄清溶液）

第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量）

给药剂量 mg/kg

动物平均体重 g

每只动物给药体积 μL

动物数量

第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶/难溶于水的化合物），不同的产品和批次配方组成不同，如对配方有疑问，可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外，请注意这只是一个配方计算器，而不是特定产品的确切配方。

% DMSO

% Tween 80

% ddH₂O

计算重置

计算结果:

工作液浓度： mg/mL；

DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。

体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH₂O，混匀澄清。

注意： (1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

生物数据图片

Structure-based design and selectivity of the novel ITK/RLK inhibitor PRN694. A, chemical structure of PRN694. B, model of PRN694 covalently bound to ITK. Molecular modeling predicts that the aminobenzimidazole scaffold makes two hydrogen bonds to the backbone amides of the hinge residues of the ATP binding pocket. The CF2-thiophene was found to provide high potency for either a phenylalanine or threonine gatekeeper residue. A methylpyrolidine linker presents the acrylamide in a position easily accessible for covalent bond formation with Cys-442. C, the dissociation of reversible versus irreversible inhibitors. Ligand binding to ITK as a function of time (hours) in a biochemical off-rate assay utilizing time-resolved FRET was determined as described under “Experimental Procedures.” The completely reversible inhibitor BMS-509744 demonstrated extremely rapid dissociation from ITK (residence time (τ) = 32 ± 17 min), whereas PRN694 remained bound to ITK for the entire assay period, consistent with its irreversible covalent binding. D, the in vitro selectivity and potency of PRN694 against a panel of 250 kinases. Screening of PRN694 was performed at 0.1 and 1.0 μm. The results are displayed on a human kinase dendrogram (reproduced courtesy of Cell Signaling Technology, Inc.). [1].Targeting interleukin-2-inducible T-cell kinase (ITK) and resting lymphocyte kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. J Biol Chem. 2015 Mar 6;290(10):5960-78.

PRN694 blocks cellular and molecular activation of T-lymphocytes and the Jurkat T-ALL cell line. A, gating strategy for flow cytometric analysis of CD69 surface expression in Jurkat cells. Singlet live lymphocytes were gated for CD69 surface expression in Jurkat cells. Jurkat cells (n = 4) (B), human primary CD4 T-cells (n = 6) (C), or human primary CD8 T-cells (n = 4) (D) were pretreated for 30 min with PRN694, BMS-509744, or PRN403 at the indicated doses or vehicle (DMSO), subjected to stimulation with anti-CD3/anti-CD28 for 6 h, and analyzed via flow cytometry for CD69 surface expression. Baseline (unstimulated) CD69 percentage was subtracted, and data were normalized to stimulated and vehicle-treated sample. Jurkat cells (E) or CD3 T-cells (F) isolated from healthy donors were pretreated with vehicle (DMSO), PRN694, BMS-509744, or PRN403 at the indicated doses and stimulated with anti-CD3/anti-CD28 for 6 h. Cell viability was evaluated by flow cytometry using LIVE/DEAD® stain (Invitrogen). Nuclear (G) or cytoplasmic (H) extracts from Jurkat cells pretreated for 30 min with 0.5 μm PRN694, 0.5 μm BMS-509744, 0.5 μm PRN403, 4 μm ibrutinib, or vehicle (DMSO) and stimulated with anti-CD3/anti-CD28 for 45 min were analyzed by immunoblot. Antibodies to actin, lamin B, and GAPDH were included as controls for nuclear versus cytoplasmic extractions. Data are representative of three experiments. For immunoblots G and H, densitometric ratios between phosphoprotein and total or loading control are provided. Error bars, S.E.[1].Targeting interleukin-2-inducible T-cell kinase (ITK) and resting lymphocyte kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. J Biol Chem. 2015 Mar 6;290(10):5960-78.

TCR-proximal signaling is irreversibly blocked by PRN694, abrogating downstream pathway activation. A and B, freshly isolated primary CD4 T-cells were preincubated with vehicle (DMSO) or PRN694 (0.5 μm) and then stimulated for 45 min with anti-CD3/anti-CD28 antibodies. Nuclear extracts (A) or cytoplasmic extracts (B) were analyzed by immunoblot with the indicated antibodies. C and D, freshly isolated primary CD8 T-cells were treated as described for CD4 cells, and nuclear (C) and cytoplasmic (D) extracts were analyzed by immunoblot. E, Jurkat cells were pretreated with 25 nm PRN694 or vehicle, labeled with Fluo4AM, and then stimulated by the addition of anti-CD3 indicated by an arrow. Calcium flux was measured using the intensity of Fluo-AM measured over 5 min following the addition of anti-CD3. The graph shows cumulative data from 12 replicates conducted over two separate experiments. F, Jurkat cells were pretreated with PRN694 (1 nm to 1 μm), vehicle (DMSO), or BAPTA-AM (13 μm); labeled with Fluo4AM; and then stimulated by the addition of anti-CD3. Calcium flux was measured using the intensity of Fluo-AM measured over 5 min following the addition of anti-CD3. The graph shows the area under the fluorescent intensity/time curve. G and H, Jurkat cells were pretreated with 0.5 μm PRN694 or vehicle (DMSO) and then stimulated either with anti-CD3/anti-CD28 or 50 ng/ml phorbol 12-myristate 13-acetate plus 1 μg/ml ionomycin for 45 min. Nuclear (G) and cytoplasmic (H) extracts were analyzed by immunoblot. For immunoblots A, B, C, D, G, and H, densitometric ratios between phosphoprotein and total or loading control are provided. Error bars, S.E.[1].Targeting interleukin-2-inducible T-cell kinase (ITK) and resting lymphocyte kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. J Biol Chem. 2015 Mar 6;290(10):5960-78.