mTORC1[1].
Sestrin2. NV-5138 functions as a selective activator of mTORC1 by binding to the leucine sensor, Sestrin2. It exhibits a Kd (dissociation constant) of 1.5 uM for Sestrin2. This binding interaction leads to the activation of the mTORC1 complex, a central regulator of cell growth, protein synthesis, and synaptic plasticity. It is the first selective, orally bioavailable brain mTORC1 activator.

NV-5138 调节 Sestrin2-Gator2 相互作用并激活细胞中的 mTORC1。[1]
NV-5138 不具有蛋白质生成能力。[1]
NV-5138 不被支链氨基转移酶 (BCAT) 代谢。[1]
NV-5138 对 Sestrin1/2 具有选择性。[1]

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NV-5138 产生类似氯胺酮的抗抑郁行为反应。[1]
NV-5138 产生与氯胺酮类似的持久抗抑郁作用。[1]
NV-5138 诱导的抗抑郁作用需要 mTORC1 信号通路。[1]
NV-5138 增加内侧前额叶皮层 (mPFC) 锥体神经元的突触数量和功能。

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NV-5138 已被证实能够瞬时激活多种外周组织中的 mTORC1，并且与结构类似物亮氨酸不同，它还能特异性地激活脑组织中的 mTORC1。它是首个被报道的选择性脑 mTORC1 激活剂。NV-5138 通过与 Sestrin2 结合，在体外和体内均能诱导 mTORC1 激活。临床前研究表明，NV-5138 具有抗抑郁样作用，并能以依赖于 mTORC1 激活的方式促进神经元重塑，这提示了一种治疗抑郁症的新方法。

大鼠静脉注射和口服给药后，盐酸NV-5138的口服生物利用度接近100%，血浆消除半衰期约为3小时[1]。在PFC突触体制备物中，单次口服盐酸NV-5138（160 mg/kg）可显著提高磷酸化mTOR及其下游靶点磷酸化p70S6K1和磷酸化4EB-P1的水平[2]。此外，还观察到盐酸NV-5138（80 mg/kg，口服，每日一次，连续7天）的抗抑郁作用[2]。

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在体内，NV-5138 在临床前动物模型中具有接近 100% 的口服生物利用度，且其消除半衰期适合每日一次给药。在抑郁症动物模型中，NV-5138 表现出快速且持续的抗抑郁样作用。值得注意的是，由于它能直接与 Sestrin2 结合，因此可直接激活脑内 mTORC1，从而增加前额叶皮层的突触蛋白合成和树突棘密度，这些都是与氯胺酮等速效抗抑郁药作用相关的关键神经生物学事件。

体外药理学筛选[1]
NV-5138 在 300 µM 的浓度下进行重复测试，以评估其与 107 个药物不良反应靶点（包括 21 种在中枢神经系统表达的转运蛋白、受体、离子通道和酶）的潜在相互作用。排除显著相互作用的阈值设定为结合/反应 >50%。

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BCAT 酶活性测定[1]
测定缓冲液条件如下：α-酮戊二酸 (5 mM)、NADH (0.075 mM)、磷酸吡哆醛 (5 µM)、亮氨酸脱氢酶 (0.95 U)、硫酸铵 (50 mM)、DTT (5 mM) 和溶剂（水），以及 L-亮氨酸、精氨酸和 NV-5138（如适用）。将检测缓冲液分装至96孔板中，并在37℃下孵育10分钟，然后加入溶于0.1 M磷酸钾缓冲液中的BCAT1或BCAT2（72 ng）。使用Envision酶标仪在室温下每分钟读取一次340 nm处的吸光度，持续30分钟。所用试剂的来源见补充信息。

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14C-亮氨酸蛋白掺入测定[1]
HeLa细胞用PBS洗涤一次，然后在含有CHX（10 μg/ml）或DMSO（终浓度1%）的饥饿培养基（无亮氨酸和无血清DMEM）中于37℃孵育2.5小时。孵育后，用PBS洗涤细胞一次，然后在含有¹⁴C-亮氨酸（2 µCi/ml）和NV-5138或非放射性亮氨酸的标记培养基中于37 °C孵育30分钟。孵育后，收集细胞并用含1% NP40的10 mM Tris/HCl缓冲液（pH 7.4）裂解。将裂解液与水和20%三氯乙酸（1:1:2）混合，冰上孵育2小时以沉淀蛋白质。离心收集蛋白质，用NaOH溶解，置于闪烁液中，并在Wallac Microbeta Trilux 2450闪烁计数器上读取2分钟的计数结果。闪烁值以DMSO处理孔的计数百分比进行标准化。

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等温滴定量热法 (ITC)[1]
由于NV-5138是天然配体L-亮氨酸的类似物，且已知亮氨酸似乎与Sestrin212共纯化，因此开发了一种方法，将内源性亮氨酸从结合位点置换出来，并用较弱的Sestrin2配体L-蛋氨酸24取而代之。随后，用亮氨酸及其类似物置换蛋氨酸，以进行直接结合测量。NV-5138的合成和用于ITC的蛋白质制备的详细信息可在补充信息中找到。

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用于检测 NV-5138 与 Sestrin2 蛋白相互作用的无细胞结合分析方法。将重组人 Sestrin2 蛋白固定在表面等离子共振 (SPR) 仪器的传感器芯片上。然后，将不同浓度（例如 0.1-100 uM）的 NV-5138 注入运行缓冲液中。测量响应单位 (RU)，并计算解离常数 (Kd)。已确定 NV-5138 与 Sestrin2 结合的平衡解离常数 (Kd) 为 1.5 uM。此外，还可以开发一种基于荧光偏振 (FP) 的竞争性结合分析方法，其中荧光标记的亮氨酸探针与未标记的 NV-5138 竞争结合 Sestrin2。

细胞培养[1]
所有细胞系均在添加10% FBS的DMEM培养基中培养，并维持在37℃、5% CO2条件下。稳定表达Flag-WDR24的HEK-293T细胞的构建方法如前所述²⁴。为进行亮氨酸饥饿处理，细胞用无亮氨酸DMEM培养基（添加10% dFBS）洗涤一次，并在其中孵育50分钟，随后分别用NV-5138、亮氨酸或溶剂处理10分钟。细胞培养所用试剂的详细信息见补充信息。

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免疫沉淀(IP)的Western印迹分析[1]
细胞裂解液的制备方法如前所述²⁴。裂解液在4℃下以13,200 rpm离心8分钟以去除细胞碎片。对于抗FLAG免疫沉淀（IP），将FLAG-M2亲和凝胶加入约2 mg裂解液中，并在4 °C下旋转孵育3小时。IP后，用含500 mM NaCl的Triton洗涤缓冲液洗涤磁珠一次。对于基于裂解液的蛋白质-蛋白质相互作用分析，将IP重悬于含有载体、NV-5138或指定剂量亮氨酸的胞质缓冲液中，孵育10分钟。化合物孵育后，通过离心收集IP。将免疫沉淀的蛋白质变性，并通过SDS-PAGE分离。使用LI-COR成像系统对膜进行成像。所用试剂和抗体列于补充信息中。

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细胞热位移分析（CETSA）[1]
CETSA按先前描述的方法进行²³。简而言之，将HEK293T细胞在不含亮氨酸的培养基中孵育1小时，然后加入NV-5138（300 µM）、亮氨酸（300 µM）或溶剂（水），继续孵育30分钟。之后收集细胞，在室温下以300 g离心3分钟，用PBS洗涤，再次离心，最后重悬于1 ml含有不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂（Roche）的室温PBS中。取100 µl细胞悬液在上述温度下加热3分钟，然后在室温下放置3分钟，最后用液氮速冻。为了裂解细胞，将样品进行两次冻融循环，然后在4℃下以20,000 g离心20分钟。取80 µl上清液进行变性处理，并通过SDS-PAGE电泳分离。使用LI-COR成像系统对膜进行成像。所用抗体列于补充信息中。

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通常进行NV-5138的细胞活性检测以测量mTORC1通路的激活情况。将HEK-293细胞或原代神经元用不同浓度的NV-5138盐酸盐（1-100 uM）处理1-4小时。然后裂解细胞，并使用针对磷酸化S6K（Thr389）和磷酸化4E-BP1（Thr37/46）的特异性抗体，通过Western blot分析裂解液。磷酸化S6K和4E-BP1是已知的mTORC1下游底物。磷酸化蛋白与总蛋白比例的增加表明mTORC1被激活。为了进行更定量的测量，可以使用针对磷酸化S6K的时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测。为了验证其对脑组织的特异性，可以设置平行实验，用雷帕霉素（一种mTORC1抑制剂）预处理神经元以阻断NV-5138的作用。

动物/疾病模型： 雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，体重250-260克[2]。
剂量： 40、80、160毫克/千克。
给药途径： 口服，单次给药（160毫克/千克）或每日一次，共7天（40、80毫克/千克）。
实验结果： 产生抗抑郁作用。

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动物/疾病模型： 雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，体重250-400克[1]。
剂量： 1毫克/千克、5毫克/千克（药代动力学/PK设计）。
给药途径： 静脉注射1毫克/千克，口服5毫克/千克。
实验结果：口服生物利用度几乎为100%，血浆消除半衰期约为3小时。

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动物和给药。[2]
除慢性不可预测应激（CUS）实验外，大多数研究均使用体重250-260克的雄性Sprague-Dawley大鼠。CUS实验由于研究持续时间较长，使用了体重120-140克的大鼠。此外，还使用了先前描述的BDNF Val66Met突变敲入小鼠（8-12周龄的Val/Val野生型、杂合Val/Met和纯合Met/Met小鼠）来测试BDNF的作用。动物单独饲养，并置于标准条件下，光照/黑暗周期为12小时/12小时，可自由摄取食物和水。大鼠单次口服给予赋形剂（0.5%甲基纤维素和0.1%吐温80）、NV-5138（40、80或160 mg/kg，口服，Navitor Pharmaceuticals Inc.）、氯胺酮（10 mg/kg，腹腔注射）、DMSO（0.5%；1 ml/kg，腹腔注射）或NBQX（10 mg/kg，腹腔注射，Tocris Bioscience）。在重复给药研究中，NV-5138（40或80 mg/kg，口服）每日一次，共7天；氯胺酮（10 mg/kg，腹腔注射）隔日一次，共6天。

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NV-5138 在大鼠体内的药代动力学分析[1]
为测定口服生物利用度，雄性 SD 大鼠分别以 1 mg/kg 的剂量静脉注射（IV）和 5 mg/kg 的剂量口服（PO）给予溶于 0.5% MC/0.1% Tween80 的 NV-5138（每组每个时间点 n = 3）。PO 组大鼠禁食过夜，IV 组大鼠可自由摄取食物和水。给药后，在指定时间点采集尾静脉血至 K2EDTA 抗凝管中，并以 2000 g 离心 5 分钟收集血浆。为测定脑组织和血浆中 NV-5138 的浓度，大鼠以 160 mg/kg 的剂量口服给药（n = 5），给药 1 小时后断头处死，采集躯干血和一侧脑半球。将血浆与含有普瑞巴林作为内标的乙腈混合并离心，脑和心脏样本直接在乙腈中匀浆。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量NV-5138的浓度。使用WinNonlin V 6.2统计软件，利用非房室模型生成药代动力学参数。

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mTORC1信号通路和突触蛋白的Western Blotting分析[1]
SD大鼠经口灌胃给予NV-5138、亮氨酸或赋形剂（50 mg/ml，溶于含0.5% MC和0.1% Tween80的水中），剂量和时间点如所示。给药后，立即用断头台处死动物。快速显微解剖特定脑区，收集组织，并立即液氮速冻。外周组织和所有脑组织均使用MP匀浆器在裂解缓冲液（细胞裂解缓冲液：1% Triton X-100、50 mM HEPES pH 7.4、100 mM NaCl、2 mM EDTA、10 mM β-甘油磷酸钠、10 mM 焦磷酸钠和1种蛋白酶抑制剂）中于4℃下匀浆。各脑区突触蛋白和mTORC1的分析均按照先前描述的方法¹⁶在粗突触体制备物上进行。每个样本等量的总蛋白经变性后，通过SDS-PAGE电泳分离。使用LI-COR成像系统对膜进行成像。蛋白水平以微管蛋白或GAPDH水平进行标准化，并进一步以载体处理的对照组大鼠的蛋白水平进行标准化。所用抗体列于补充信息中。

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NV-5138 的体内研究通常在抑郁症动物模型中进行。实验采用雄性 Sprague-Dawley 大鼠（200-250 g）。NV-5138 配制于水性载体中，例如 0.5% 甲基纤维素，并经口服给药（例如，剂量为 10-100 mg/kg）。该化合物的口服生物利用度几乎为 100%，且吸收迅速。主要的行为学检测方法是强迫游泳试验 (FST)。将大鼠置于盛有水（25℃）的圆柱体中进行 15 分钟的预测试。24 小时后，给予大鼠 NV-5138 治疗，并在给药后 1-2 小时进行 5 分钟的测试。记录大鼠的静止不动时间，并与载体对照组进行比较。静止不动时间的减少表明具有抗抑郁样作用。为了验证该机制，可另取一组大鼠，在给予NV-5138前30分钟预先腹腔注射mTORC1抑制剂雷帕霉素（10 mg/kg）；此举应能阻断其行为效应。研究结束时，采集血液和脑组织样本，用于药代动力学分析和前额叶皮层中mTORC1激活标志物（p-S6K）的评估。

口服NV-5138[1]后的药代动力学(PK)和药效学(PD)研究发现，NV-5138的口服生物利用度接近100%，大鼠静脉和口服给药后其血浆消除半衰期约为3小时（补充表3和图4a）。鉴于NV-5138良好的药代动力学特性，我们希望确定口服NV-5138是否能激活自由摄食大鼠脑及其他器官中的mTORC1，并以mTORC1的下游底物磷酸化S6 (S240/244pS6)作为该复合物激活状态的药效学指标。如图3a和补充图5a所示，给药1小时后，从大脑前额叶皮层（PFC）分离的突触体中S240/244pS6的含量呈剂量依赖性增加，在160 mg/kg剂量下，其含量较溶剂对照组显著增加约2倍，在80 mg/kg剂量下也观察到增加趋势。基于这些结果，我们决定采用160 mg/kg的口服剂量进行后续实验。结果表明，血浆和全脑提取物的药代动力学特征相似，表明脑暴露量较高（补充图4b）。单次口服NV-5138 1小时后，除前额叶皮层外，纹状体、海马和新皮层等多个脑区（小脑除外）的mTORC1均被显著激活（图3b和补充图5b）。

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盐酸NV-5138是一种口服活性小分子药物。研究表明，其口服生物利用度接近100%，消除半衰期支持每日一次给药。这种良好的药代动力学特性确保了药物的稳定暴露，使其适用于临床开发。NV-5138被设计为一种选择性脑mTORC1激活剂，这意味着它能够有效穿过血脑屏障。它是一种亮氨酸类似物，但与亮氨酸不同，它不被代谢或用于蛋白质合成，这有助于其选择性地作用于大脑。

所提供的摘要并未详尽列出NV-5138的临床前毒性数据。该药物的研发重点在于其治疗难治性抑郁症的潜力，并且可能已完成标准的临床前安全性药理学和毒理学研究，以支持临床试验。现有研究摘要中未报告任何显著的急性或慢性毒性。

[1]. Discovery of NV-5138, the first selective Brain mTORC1 activator. Sci Rep. 2019 Mar 11;9(1):4107.

[2]. Sestrin modulator NV-5138 produces rapid antidepressant effects via direct mTORC1 activation. J Clin Invest. 2019 Apr 16;129(6):2542-2554.

雷帕霉素靶蛋白复合物1 (mTORC1) 与多种重要的慢性疾病相关，其中许多疾病与年龄相关。mTORC1 的完全激活需要多种输入信号，包括氨基酸亮氨酸。胞质蛋白 Sestrin1 和 Sestrin2 特异性地与多蛋白复合物 GATOR2 结合，并将亮氨酸充足状态传递给 mTORC1 通路激活复合物。本文报道了一种新型的口服生物利用度高的化合物 NV-5138，该化合物可与 Sestrin2 结合，并在体外和体内激活 mTORC1。与亮氨酸类似，NV-5138 可以瞬时激活多种外周组织中的 mTORC1，但与亮氨酸不同的是，它仅在大脑中激活该复合物，因为它不参与蛋白质合成。因此，NV-5138 可能有助于探索尚未满足的医疗需求，包括与 mTORC1 激活相关的神经精神疾病和认知障碍。 [1] 临床前研究表明，包括氯胺酮在内的速效抗抑郁药需要激活 mTORC1 信号通路。该通路受神经元活动、内分泌和代谢信号的调控，尤其是氨基酸亮氨酸，它通过与上游调节因子 sestrin 结合来激活 mTORC1 信号通路。本研究探讨了一种新型高选择性小分子 sestrin 调节剂 NV-5138 的抗抑郁作用，该调节剂能够穿过血脑屏障。结果表明，单次注射 NV-5138 即可产生快速且持久的抗抑郁作用，并迅速逆转慢性应激引起的快感缺失。 NV-5138 的抗抑郁作用依赖于 BDNF 的释放，因为向内侧前额叶皮层 (mPFC) 注射 BDNF 中和抗体或通过敲入阻断活性依赖性 BDNF 释放的 BDNF 多态性小鼠，均可阻断其行为反应。NV-5138 给药还能迅速增加 mPFC 中突触的数量和功能，并逆转慢性应激引起的突触缺陷。总之，这些结果表明，NV-5138 通过激活 mTORC1 和 BDNF 信号通路产生快速的突触反应和抗抑郁行为反应，提示对 sestrin 进行药理学调控是开发速效抗抑郁药的一种新方法。[2]

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盐酸NV-5138是首个选择性、口服生物利用度高的脑mTORC1激活剂。它通过与亮氨酸传感器Sestrin2结合发挥作用。该药物已在治疗难治性抑郁症（TRD）的临床试验中进行研究，但尚未获得FDA批准。它是研究mTORC1在突触可塑性和神经精神疾病中作用的重要研究工具。CAS号：2639392-70-2。

C7H14CLF2NO2

217.64136838913

217.068

2639392-70-2

NV-5138;2095886-80-7

155981983

Off-white to brown solid powder

63.3

3

5

4

13

171

1

Cl.FC(C(C)(C)C[C@@H](C(=O)O)N)F

SIUFCONWYBJSOP-WCCKRBBISA-N

InChI=1S/C7H13F2NO2.ClH/c1-7(2,6(8)9)3-4(10)5(11)12;/h4,6H,3,10H2,1-2H3,(H,11,12);1H/t4-;/m0./s1

(2S)-2-amino-5,5-difluoro-4,4-dimethylpentanoic acid;hydrochloride

NV-5138 (hydrochloride); 2639392-70-2; (2S)-2-amino-5,5-difluoro-4,4-dimethylpentanoic acid hydrochloride; NV-5138 hydrochloride;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 250 mg/mL (1148.69 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (9.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (9.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (9.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。