mGlu7
mGluR7 (metabotropic glutamate receptor 7).

在共表达大鼠mGluR7和Gα15的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中（IC50=26 nM），MMPIP可降低L-(+)-2-氨基-4-膦酸丁酸（L-AP4；0.5 mM）诱导的细胞内Ca2+动员[1]。在表达大鼠mGluR7的CHO细胞中，MMPIP可阻断L-AP4诱导的福斯克林刺激的cAMP积累抑制（IC50 220 nM）[1]。此外，在CHO-人mGluR7/Gα15细胞中，MMPIP可拮抗L-AP4介导的cAMP积累抑制，IC50为610 nM[1]。MMPIP盐酸盐是一种选择性mGluR7拮抗剂，其KB值范围为24至30 nM。该药物对 mGluR7 具有高亲和力和选择性，使其成为研究该受体在中枢神经系统中功能的宝贵工具，使研究人员能够区分 mGluR7 介导的作用与其他 mGluR 亚型的作用。

MMPIP（10 mg/kg）可显著增强预脉冲诱导的听觉惊吓反应抑制（最高可达对照组的137%），同时减弱声惊吓反应的强度[2]。MMPIP（10 mg/kg）通过提高决策准确性，减轻了MK-801（0.1 mg/kg）引起的认知缺陷[2]。腹腔注射扎米芬那辛（10 mg/kg）后，小鼠体内的消除半衰期较短（血浆1.16 h，脑组织1.75 h）[2]。该化合物用于体内研究，以探究mGluR7在各种中枢神经系统功能中的作用。作为一种选择性拮抗剂，MMPIP有助于确定mGluR7对焦虑、抑郁以及学习和记忆等行为的影响。其作用通常在全身给药后于啮齿动物模型中进行评估。

我们发现并进行了药理学表征，鉴定出新型异噁唑并吡啶酮衍生物，它们是代谢型谷氨酸受体 (mGluR) 7 的拮抗剂。通过随机筛选鉴定出 5-甲基-3,6-二苯基异噁唑并[4,5-c]吡啶-4(5H)-酮 (MDIP)，并通过对 MDIP 进行化学修饰制备了 6-(4-甲氧基苯基)-5-甲基-3-吡啶-4-基异噁唑并[4,5-c]吡啶-4(5H)-酮 (MMPIP)。MDIP 和 MMPIP 均能抑制 L-(+)-2-氨基-4-膦酸丁酸 (L-AP4) 诱导的共表达大鼠 mGluR7 和 Gα15 的中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞内 Ca2+ 动员（IC50 分别为 20 nM 和 26 nM）。在MMPIP存在的情况下，激动剂浓度-反应曲线中的最大反应降低，且其拮抗作用是可逆的。MMPIP不能置换与mGluR7结合的[3H](2S)-2-氨基-2-[(1S,2S)-2-羧基环丙-1-基]-3-(黄原-9-基)丙酸(LY341495)。这些结果表明，这些异噁唑并吡啶酮衍生物是变构拮抗剂。在表达大鼠mGluR7的CHO细胞中，MDIP和MMPIP抑制了l-AP4诱导的福斯克林刺激的cAMP积累的抑制作用（IC50分别为99 nM和220 nM）。在共表达人mGluR7和Gα15的CHO细胞中，MDIP和MMPIP也抑制了l-AP4诱导的cAMP反应。在 cAMP 测定中，MMPIP 的最大抑制程度高于 MDIP。MMPIP 能够拮抗变构激动剂 N,N'-二苯甲酰乙烷-1,2-二胺二盐酸盐 (AMN082) 诱导的 cAMP 积累抑制。在没有这些激动剂的情况下，MMPIP 可进一步提高表达 mGluR7 的 CHO 细胞中福斯克林刺激的 cAMP 水平，而竞争性拮抗剂 LY341495 则无此作用。该结果表明 MMPIP 具有反向激动活性。MMPIP 的内在活性对百日咳毒素敏感，且依赖于 mGluR7。浓度至少为 1 μM 的 MMPIP 对 mGluR1、mGluR2、mGluR3、mGluR4、mGluR5 和 mGluR8 无显著影响。 MMPIP是首个选择性mGluR7变构拮抗剂，有望成为阐明mGluR7在中枢神经系统功能中作用的药理学工具[1]。体外受体结合实验用于测定MMPIP对mGluR7的亲和力和选择性。这些实验通常使用放射性标记的配体和表达该受体的细胞膜制备物。评估化合物与mGluR7变构位点的结合能力及其对其他mGluR亚型的选择性。

cAMP[2]
采用均相时间分辨荧光 (HTRF) 法，按照先前描述的方法 (Chruścicka et al., 2015)，利用重组细胞系进行 cAMP 动态 2 检测。简而言之，收集稳定表达 mGlu7 受体的 HEK 293 T-REx 细胞，并将其悬浮于 Hanks-HEPES 缓冲液中。将细胞悬液加入含有 5 μM 福斯克林（终浓度）的化合物溶液中。在 37°C 下孵育 5 分钟后，加入 5 μl 溶于裂解缓冲液的 cAMP-d2 偶联物，并通过自动移液系统将其与 10 μl 细胞悬液混合。随后，加入 5 μl 抗 cAMP 隐蔽物偶联物，并在 1 小时后读取 620 nm 和 665 nm 处的荧光强度。结果以 665 nm/620 nm 比值乘以 104 表示。检测到的信号强度与样品中 cAMP 的浓度成反比。ADX71743 或 MMPIP 的拮抗活性以其 EC80 浓度下 L-Glu 活性的抑制百分比表示。ADX71743 或 MMPIP 的剂量反应数据使用 Prism 7.03 版进行分析。每个实验重复三次 (n = 3)，每个数据点均进行三次重复测定。体外功能性检测使用表达重组 mGluR7 的细胞进行。在有或无 MMPIP 的情况下，用激动剂刺激细胞，并测量受体介导的信号传导（例如 cAMP 调节）的抑制情况。KB 值由拮抗剂引起的激动剂浓度-反应曲线右移计算得出。

大多数行为学测试使用雄性瑞士白化小鼠（20–25 g）。空间延迟交替测试和声惊反射的PPI测试使用雄性Wistar大鼠（200–250 g）。电生理学研究使用雄性C57BL/6J野生型（WT）和mGlu7基因敲除（KO）小鼠。动物饲养于温度为21–22°C、光暗周期为12:12的房间内，自由摄取食物和水。每只动物仅使用一次，未进行多次实验。[2]

MMPIP配制于0.5%甲基纤维素溶液中。[2]

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药代动力学研究[2]
下述方法已成功应用于腹腔注射ADX71743和MMPIP在瑞士白化小鼠体内的药代动力学研究。将化合物 ADX71743 和 MMPIP 以 10 mg/kg 的剂量腹腔注射给小鼠。分别在 0.25、0.50、1.0、2.0、4.0 和 6.0 小时，对小鼠进行麻醉，并从门静脉采集血液至含有 5% EDTA 的试管中。随后用 0.1M PBS 灌注小鼠以清除体内残留血液，并取出脑组织进行分析。血液在 4°C 下以 2000 rpm 离心 10 分钟，收集血浆并冷冻于 -80°C 以备后续分析。[2] 所有药物处理动物的血浆和组织样本在使用前均在室温下解冻。标准样本制备流程：向含有 50 μl 待测血浆样本或组织匀浆的 Eppendorf 管中加入 200 μl 乙腈。样品在25°C、1400 rpm的混合器上混合5分钟。然后将试管在4°C下以2000 × g离心15分钟。将每个上清液约180 μl转移至孔板中。最后，将每个样品注入色谱柱。

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MK-801诱导的多动症[2]
如Woźniak等人（2016b）所述，使用OPTO-M3运动活动笼单独记录每只动物的运动活动，该笼与兼容的PC活动系统在线连接。每个笼子（13 cm × 23 cm × 15 cm）周围环绕着光电管光束阵列。这些光束的中断导致水平活动，定义为行走计数。将小鼠放入运动活动笼中适应 30 分钟。然后，腹腔注射 MMPIP（10、15 mg/kg）或 ADX71743（5、10 mg/kg）。两种药物均在注射 MK-801（0.35 mg/kg，腹腔注射）前 30 分钟给予。在给予 MK-801 后立即测量 60 分钟的运动活性。

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DOI 诱导的头部抽搐[2]
该实验按照先前描述的方法进行（Wierońska 等，2012，2013）。经过 30 分钟的适应期后，立即腹腔注射 DOI（2.5 mg/kg）以诱导头部抽搐。然后计数 20 分钟内的头部抽搐次数。在 DOI 前 30 分钟腹腔注射 MMPIP（5、10 和 15 mg/kg）或 ADX71743（2.5、5 和 10 mg/kg）。随后，分别以两种有效剂量（MMPIP 5 和 10 mg/kg 以及 ADX71743 2.5 和 5 mg/kg）对化合物进行慢性给药（持续 10 天）。在第 11 天，最后一次给药后 30 分钟进行测试。

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改良强迫游泳试验[2]
改良强迫游泳试验按照 Noda 等人提出的方法进行（Noda 等，1995，1997；Wierońska 等，2015a；Woźniak 等，2016a）。游泳测试在一个装有11厘米深水的玻璃圆筒（高20厘米，内径15厘米）中进行，水温维持在23–24°C。经过适应期后，动物进行第一次游泳测试，测量3分钟内的静止时间（T1）。第二天，开始持续（13天）给予MK-801（0.4毫克/千克，腹腔注射）。休息一天后，在实验的第15天进行第二次游泳测试，再次测量3分钟内的静止时间（T2）。T2与T1的差值作为实验结果。在T2实验前30分钟，分别腹腔注射MMPIP（1、5和15 mg/kg）或ADX71743（5、10和15 mg/kg）。

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社交互动测试[2]
该方法参考了de Moura Linck等人（2008）和Woźniak等人（2016b）的研究。经过2天的适应性训练（每天10分钟）后，将一对小鼠放入开放场中5分钟。根据小鼠参与社交行为（例如生殖器探索、嗅闻、追逐和互相打斗）的总时间来确定两只小鼠之间的社交互动。同时记录社交事件的总数。测试过程被录像，并由训练有素的观察员进行观看。在注射 MK-801（0.3 mg/kg，腹腔注射）前 30 分钟，分别腹腔注射 MMPIP（5、10 和 20 mg/kg）或 ADX71743（1、5 和 15 mg/kg）。MK-801 于测试前 30 分钟注射。

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新物体识别测试[2]
该实验参照 Nilsson 等人（2007）的方法进行，并稍作修改（Woźniak 等人，2016b）。经过 2 天的适应期（每天 10 分钟）后，进行训练试验，小鼠被允许探索两个相同的物体 5 分钟。约 1 小时后，进行测试试验，其中一个熟悉的物体被替换为一个新物体。然后，动物被允许探索这些物体 5 分钟。在注射 MK-801 (0.3 mg/kg，腹腔注射) 前 30 分钟，分别腹腔注射 MMPIP (5、10 和 15 mg/kg) 和 ADX71743 (1、5 和 10 mg/kg)，MK-801 则在训练试验前 30 分钟注射。由训练有素的观察员测量小鼠探索（即嗅闻或触摸）熟悉物体 (Tfamiliar) 或新奇物体 (Tnovel) 的时间，然后计算每只小鼠的识别指数 [(Tnovel - Tfamiliar)/(Tfamiliar + Tnovel)] × 100。

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转棒测试[2]
小鼠以 18 rpm 的速度连续训练 3 天，每天一次，每次 3 分钟。如果小鼠在适应期内跌落，则将其放回装置上。第二天进行正式测试。将小鼠置于转速为 12 rpm 的旋转杆装置（Mouse Rota-Rod NG，UGO BASILE SRL）上后，启动加速模式（最大转速 24 rpm）。在 3 分钟的测试过程中测量小鼠跌落潜伏期。在测试前 30 分钟，小鼠腹腔注射 MMPIP（5、15 和 30 mg/kg）或 ADX71743（5、15 和 30 mg/kg）。

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空间延迟交替测试[2]
空间延迟交替测试采用木制 T 型迷宫进行，方法参照 Sławińska 等，2013 和 Wierońska 等，2015b。在为期 3 天的适应期内，允许动物在迷宫中自由探索 10 分钟。接下来的两天，将大鼠限制在两个末端臂中的任意一个，并允许其每天两次饮用10%的蔗糖溶液，每次10分钟。第二天，开始为期两周的训练阶段。动物每天进行一次训练，训练包括一次强制试验（即关闭其中一个末端臂）和十次自由选择试验。在自由选择试验中，将动物放入起始臂，在闸门升起后，允许其选择进入其中一个末端臂。做出选择后，将大鼠放回起始臂，并使其停留10秒。如果选择的末端臂与之前访问的末端臂相反，则计为一次正确选择，并将动物关入该臂中，允许其饮用蔗糖溶液5秒。如果选择错误，则将动物轻轻放回起始臂。训练阶段持续进行，直至动物连续两天在训练中均获得7次正确反应。测试当天，给动物注射MMPIP和/或MK-801，并重复上述10次试验。MMPIP的给药剂量为5或10 mg/kg，在注射MK-801（0.1 mg/kg）前30分钟给药。MK-801注射后30分钟开始测试。

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前脉冲抑制[2]
该实验程序参照Czyrak等人（2003）的方法进行。实验前一天，对动物进行一次惊吓反射测试，该测试包含两次试验，每次试验重复20次。第一次试验中，呈现一个120 dB、40 ms的脉冲；第二次试验中，该脉冲之前呈现一个75 dB、20 ms的前脉冲。实验当天，动物先适应背景白噪声（65 dB）5分钟（此过程贯穿整个测试），之后按照上述方法进行惊吓反射测试。惊吓反射幅度定义为记录窗口内检测到的最大力与刺激开始前瞬间测得的力之差（阈值设定为10 g）。每只动物的每次试验的幅度分别取平均值。 PPI 的计算方法为：脉冲 (P) 与前脉冲加脉冲 (PP+P) 的振幅之差，除以脉冲本身的振幅 [([P - (PP + P)]/P)×100]。在 MK-801 (0.3 mg/kg) 给药前 30 分钟，分别给予 MMPIP (5、10 和 15 mg/kg) 和 ADX71743 (2.5、5 和 10 mg/kg)；MK-801 给药前 30 分钟，即在适应期开始前 30 分钟。

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在啮齿动物模型中进行体内研究，以探索 mGluR7 的行为和生理作用。MMPIP 通常通过全身途径（例如腹腔注射或口服）或直接注射到特定脑区，以评估其对焦虑样行为、抑郁样行为和认知功能的影响。给药方案根据化合物的药代动力学特性和既往研究确定。

表11显示了小鼠血浆和脑组织中MMPIP的浓度。注射ADX71743后0.25小时，以及注射MMPIP后0.5小时，均在脑组织和血浆中观察到Cmax。图33比较了给药后特定时间点脑组织中ADX71743和MMPIP的浓度。[2] 表22的数据表明，ADX71743和MMPIP具有不同的细胞色素P450抑制谱。对于两种NAM mGluR7标准品，在亚型1A2、2B6、2C9和2D6中均观察到较弱的细胞色素P450抑制作用（IC50 > 10 μM）。 ADX71743 标准品对 2C19 亚型表现出轻微抑制作用（3.3 < IC50 < 10），而 MMPIP 对 3A4 和 2C19 亚型表现出强抑制作用（IC50 < 1.1）。[2]目前尚无 MMPIP 盐酸盐的详细药代动力学数据公开。作为一种具有潜在中枢神经系统活性的研究化合物，其吸收、分布、代谢和排泄 (ADME) 特性将在标准的临床前药代动力学研究中进行评估，以指导体内实验。

目前尚无该化合物的具体毒性数据公开。作为一种选择性mGluR7拮抗剂，其毒性预计与其作用机制相关。在治疗药物开发过程中，需要进行标准的安全性评估，以评价其潜在的中枢神经系统不良反应或其他毒性。

[1]. In vitro pharmacological characterization of novel isoxazolopyridone derivatives as allosteric metabotropic glutamate receptor 7 antagonists. J Pharmacol Exp Ther. 2007 Oct;323(1):147-56.

[2]. Negative Allosteric Modulators of mGlu 7 Receptor as Putative Antipsychotic Drugs. Front Mol Neurosci. 2018 Sep 20;11:316.

关于mGlu7受体负向别构调节剂（NAMs）/拮抗剂的抗精神病样活性数据有限。目前，仅MMPIP和ADX71743被知晓为该受体的配体。在本研究中，我们使用稳定表达mGlu7受体的细胞系，结果显示这两种化合物以剂量依赖的方式增强了T-REx 293细胞中福斯可林（forskolin）引起的cAMP浓度升高，证明了它们的反向激动剂特性。随后，我们进行了药代动力学研究。这两种化合物以10 mg/kg的剂量通过腹腔注射（ip）给药，达到峰值血浆浓度（Cmax）在给药后0.25–0.5小时，随后迅速下降。ADX71743在给药2小时后几乎无法检测，而MMPIP仍然可检测，表明MMPIP浓度更为稳定。最后，我们在精神分裂症动物模型中研究了这两种mGlu7受体NAMs的效果。本研究包括在抗精神病药物开发中常用的行为测试。这两种测试化合物以剂量依赖的方式抑制MK-801诱导的过度活跃（MMPIP在15 mg/kg；ADX在5和15 mg/kg）和DOI诱导的头部抽动（MMPIP在5、10和15 mg/kg；ADX在2.5、5和10 mg/kg）。此外，在新物体识别测试中也观察到了类似的效果，MMPIP（5、10和15 mg/kg）和ADX71743（1、5和15 mg/kg）均逆转了MK-801诱导的认知损害。在社交互动测试中，只有ADX71743（5和15 mg/kg）表现出抗精神病活性。ADX71743在2.5 mg/kg的剂量下逆转了MK-801诱导的预脉冲抑制障碍，而MMPIP在10 mg/kg的剂量下逆转了MK-801诱导的空间延迟交替障碍。本研究表明，mGlu7受体可能被视为抗精神病药物的潜在靶点，但由于可用配体数量有限，仍需进一步研究。[2]

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MMPIP盐酸盐是研究mGluR7的关键研究工具，该受体与多种中枢神经系统疾病相关，包括焦虑、抑郁和癫痫。其高亲和力（KB = 24-30 nM）和选择性使其在剖析mGluR7特定通路方面具有重要价值。它尚未获得临床使用批准，仅限于临床前研究目的。该化合物通常用于区分mGluR7的功能与其他III组mGluR的功能。

C19H16CLN3O3

369.80

466.072

C, 61.71; H, 4.36; Cl, 9.59; N, 11.36; O, 12.98

1215566-78-1

MMPIP;479077-02-6

52974245

Light yellow to green yellow solid powder

68.5Ų

1

5

3

26

524

0

CN1C(=CC2=C(C1=O)C(=NO2)C3=CC=NC=C3)C4=CC=C(C=C4)OC.Cl

HXHQNERSIJXMTQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H15N3O3.ClH/c1-22-15(12-3-5-14(24-2)6-4-12)11-16-17(19(22)23)18(21-25-16)13-7-9-20-10-8-13;/h3-11H,1-2H3;1H

6-(4-methoxyphenyl)-5-methyl-3-pyridin-4-yl-[1,2]oxazolo[4,5-c]pyridin-4-one;hydrochloride

MMPIPHYDROCHLORIDE; MMPIP (hydrochloride); 1215566-78-1; 6-(4-METHOXYPHENYL)-5-METHYL-3-(4-PYRIDINYL)-ISOXAZOLO[4,5-C]PYRIDIN-4(5H)-ONE HYDROCHLORIDE; 6-(4-methoxyphenyl)-5-methyl-3-pyridin-4-yl-[1,2]oxazolo[4,5-c]pyridin-4-one;hydrochloride; SCHEMBL20836388;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 10 mg/mL (27.04 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (2.70 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。