MRK-016

EC50: 3 nM (GABAA α5)[1] Ki: 0.83 nM (Human GABAA α1β3γ2), 0.85 nM (Human GABAA α2β3γ2), 0.77 nM (Human GABAA α3β3γ2), 1.4 nM (Human GABAA α5β3γ2)[1]
MRK-016 targets the benzodiazepine binding site of GABAA receptors with selectivity for the α5 subunit. It exhibits Ki values of 0.77 nM, 0.83 nM, 0.85 nM, and 1.4 nM for α3-, α1-, α2-, and α5-containing receptors, respectively. The compound has an EC50 of 3 nM for GABAA α5.

MRK-016 是一种选择性、口服生物可利用的反向激动剂，GABAA α5 的 EC50 为 3 nM，人 GABAA α1β3η2、GABAA α2β3η2、GABAA α3β3η2 和 GABAA α5β3γ2 的 Kis 分别为 0.83、0.85、0.77 和 1.4 nM GABAA α5 受体。作为 α5 亚型的完全反向激动剂，MRK-016 对 GABAA α4β3γ2 亚型表现出非常低的亲和力 (Ki 395 ± 173 nM)，而对 GABAA α6β3γ2 受体 (Ki > 4000 nM) 则基本上无活性[1]。在 400 nM 浓度下，MRK-016 对 GABAA α4β3γ2 的影响可忽略不计。在小鼠海马切片中，MRK-016 (100 nM) 也能增强长时程增强作用[2]。

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在无细胞受体结合实验中，MRK-016 与重组人 GABAA 受体的苯二氮卓类结合位点具有高亲和力结合。它对含 α5 亚基的受体具有选择性，不同 α 亚型的 Ki 值范围为 0.77 至 1.4 nM。该化合物作为反向激动剂，在 α5 受体上的 Emax 为 -55%。细胞电生理学研究证实，MRK-016 作为 α5-GABAA 受体的反向激动剂发挥作用。与其他 α5 选择性化合物相比，它能更显著地增强小鼠海马切片中的长时程增强作用。该化合物在 α5 处表现出 Emax -55%，在 α1 处表现出 Emax -16%，在 α3 处表现出 Emax -9%，在 α2 处表现出 Emax +6%（EC20 GABA 反应）。

在小鼠中，口服30 mg/kg的MRK-016，20天内未诱发癫痫发作，腹腔注射10 mg/kg的戊四唑也未加重其诱发的惊厥。在大鼠中，MRK-016在占据苯二氮卓类药物（BZs）结合位点95%以上的剂量下，未表现出明显的焦虑样作用。在大鼠中，口服0.3、1和3 mg/kg的MRK-016可剂量依赖性地增强海马依赖性记忆任务的表现[1]。在大鼠中，口服0.3-30 mg/kg的MRK-016可达到极佳的受体占有率。在Morris水迷宫延迟匹配位置测试中，口服0.3、1或3 mg/kg的MRK-016可增强认知功能。腹腔注射MRK-016（1、3或10 mg/kg）的小鼠不会出现点燃效应[2]。在小鼠中，腹腔注射MRK-016（3 mg/kg）可预防LPS引起的学习和记忆障碍[3]。

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化合物13（MRK-016）在大鼠和犬中的口服生物利用度分别为52%和8%。化合物13的促惊厥作用已在小鼠中测定[36]。在高达10 mg/kg的腹腔注射剂量下（此时99%的GABAA受体亚型被占据），化合物13并未增强戊四唑诱导的小鼠惊厥。这与非选择性苯二氮卓类完全反向激动剂 212 在小鼠中报道的显著致惊厥作用以及非选择性苯二氮卓类部分反向激动剂 15 (FG 7142) 报道的促惊厥作用形成对比。¹³ 虽然急性给药时非选择性苯二氮卓类部分反向激动剂对小鼠没有直接致惊厥作用，但如果连续数日每日给药，则会诱发癫痫发作，这一过程被称为“点燃”。¹³ 重复给药 13（30 mg/kg，口服，连续 20 天）并未诱发癫痫发作，而 15（40 mg/kg，腹腔注射，连续 20 天）则诱发了癫痫发作，尽管 15 占据的受体数量少于 13，且作用持续时间更短。大鼠高架十字迷宫测试³⁷对非选择性苯二氮卓类反向激动剂（如化合物15）的焦虑作用敏感。¹¹在该测试中，化合物13在占据95%以上苯二氮卓类结合位点的剂量下，对大鼠未表现出显著的焦虑样作用。相反，化合物15则产生了强烈的焦虑作用。^[1]为了研究化合物13对学习和记忆的影响，我们评估了口服化合物13的大鼠在莫里斯水迷宫延迟“匹配位置”变体测试中的表现。该测试是一种依赖于海马的认知测试。^38,39在该测试中，大鼠在第一次和第二次试验中找到隐藏平台（平台位置每日变化，但每日固定）所需时间的差值被用作衡量大鼠对平台位置记忆程度的指标。泳池周围的空间线索有助于大鼠找到到达平台的路径。³⁹ 如图2所示，与载体对照组相比，化合物13在第一次和第二次试验之间表现出剂量依赖性（0.3-3 mg/kg，口服）的显著改善（p < 0.05）。在分别给予0.3、1和3 mg/kg（口服）剂量的对照组大鼠中，GABA_A受体上苯二氮卓类（BZ）位点的占有率分别为61%、72%和85%。由于化合物13对游泳速度没有影响，这些数据表明，功能选择性GABA_Aα5反向激动剂13能够以剂量依赖的方式显著提高大鼠在海马依赖性记忆任务中的表现。这些数据补充了结构多样的噻吩 427 和三唑并酞嗪 528 的研究结果，并支持了选择性 α5 亚型反向激动剂可能具有治疗认知障碍的疗效这一假设。[1]

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化合物 13 对 [3H]Ro 15-1788 体内结合的抑制作用被用于测定该化合物在大鼠脑 GABAA 受体 BZ 位点的占有率。[3H]Ro 15-1788 与含有 α1、α2、α3 和 α5 亚基的 GABAA 受体的 BZ 位点具有相同的亲和力，因此，[3H]Ro 15-1788 的体内结合反映了其与这些受体亚基的结合。然而，由于化合物 13 与含有 α1、α2、α3 和 α5 亚型的 GABAA 受体具有相同的亲和力，因此占据 α5 亚型所需的化合物 13 剂量与占据 α1、α2、α3 和 α5 亚型组合所需的剂量相同。如图 1 所示，大鼠口服给药后，化合物 13 的占据率呈剂量依赖性，占据 50% GABAA 受体亚型（给药后 0.75 小时）所需的平均化合物 13 剂量为 0.35 mg/kg。[1]

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在体内，MRK-016 在大鼠 Morris 水迷宫实验中，以 0.3-3 mg/kg 的口服剂量显示出认知增强作用。该化合物在动物模型中显示出对抑郁症的疗效。它具有口服活性，并且能够穿透血脑屏障。利用[¹¹C]氟马西尼正电子发射断层扫描测量体内受体占有率。

化合物 13 (MRK-016) 对所有四种苯二氮卓类敏感的 GABAA 受体亚型均具有较高的体外结合亲和力³²，范围为 0.8 至 1.4 nM。它对 GABAA α4β3γ2 亚型的亲和力很弱 (Ki 395 ± 173 nM)，并且对 GABAA α6β3γ2 受体几乎没有活性 (Ki > 4000 nM)。此外，在 147 项放射性配体结合和酶活性测定中，化合物 13 (MRK-016) 未显示出明显的脱靶活性 (IC₅₀ 值 > 10 μM)。表 1 中所示的效力值是通过对稳定表达人 GABAA 受体亚型的鼠成纤维细胞进行全细胞膜片钳记录³⁴ 测定的。体外效力以使用亚最大浓度 (EC₂₀) GABA 时 GABA 诱发电流的最大调节百分比来衡量。正值代表 GABA 诱导电流的增强（激动剂），而负值代表减弱（反向激动剂）。化合物 13 的值与临床化合物 5、非选择性完全反向激动剂 2,9 和非选择性完全激动剂氯氮卓 (CDZ; 14) 进行比较。化合物 13 是 α5 亚型的完全反向激动剂，并且对 α1、α2 和 α3 亚型具有功能选择性。在表达 α5β3γ2 亚型的小鼠成纤维细胞 L(tk-) 中，化合物 13 使 GABA 诱发的电流减弱 55%（效力 = -55%），这与完全反向激动剂 2（效力 = -57%）的效果基本相同，并且大于化合物 5（效力 = -40%）的效果。相比之下，化合物 13 在 α1、α2 和 α3 亚型上的效力要低得多，其效力值分别为 -16%、+6% 和 -9%，属于弱部分反向激动剂或拮抗剂的范畴。化合物 13 在 α1 和 α3 亚型上的效力与化合物 5 的记录结果相当；而在 α2 亚型上，化合物 13 基本上是一种拮抗剂（效力 = +6%），化合物 5 则表现出部分激动作用（效力 = +16%）。事实上，在我们寻找对 α5 亚型具有完全反向激动作用且对其他 GABAA 受体亚型功能活性很小的化合物的过程中，吡唑并三嗪 13 与临床化合物 5 相比，具有更令人印象深刻的疗效。13 在 α5 亚型上的 EC50 值为 3.0 nM，这与其体外结合亲和力 1.4 nM[1] 相辅相成。

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3-叔丁基-7-(5-甲基异恶唑-3-基)-2-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基甲氧基)-吡唑并[1,5-d][1,2,4]三嗪 (MRK-016) 是一种吡唑并三嗪，对天然大鼠脑和重组人 α1-、α2-、α3- 和 α5- GABAA 受体的苯二氮卓类结合位点的亲和力介于 0.8 和 1.5 nM 之间。它具有选择性地针对α5亚型的反向激动剂效力，且这种α5反向激动作用强于原型α5选择性化合物3-(5-甲基异噁唑-3-基)-6-[(1-甲基-1,2,3-三唑-4-羟甲基)甲氧基]-1,2,4-三唑并[3,4-a]酞嗪 (α5IA)。与其更强的α5反向激动作用相一致，MRK-016在小鼠海马切片中增强长时程增强作用的程度也高于α5IA[2]。

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使用表达具有不同α亚基的重组人GABAA受体的细胞膜制备物进行MRK-016的无细胞受体结合试验。放射性配体置换研究使用[³H]氟马西尼或其他苯二氮卓类配体。将膜与不同浓度的MRK-016和放射性配体孵育，然后进行过滤和闪烁计数。Ki值由竞争性结合曲线计算得出。

采用膜片钳技术记录表达重组人GABAA受体的细胞的电生理信号，进行细胞电生理实验。施加不同浓度的MRK-016，并测量GABA诱导的电流。通过其降低GABA诱发反应的能力来评估该化合物的反向激动剂活性。根据浓度-反应数据确定EC50和Emax值。

与α5受体反向激动作用更强相一致，MRK-016在小鼠海马切片中增强长时程增强作用的程度高于α5IA。MRK-016在大鼠口服给药后受体占有率良好，达到50%占有率所需的剂量为0.39 mg/kg，相应的血浆EC50值为15 ng/ml，与使用[11C]氟马西尼正电子发射断层扫描测得的恒河猴血浆EC50值21 ng/ml相似。在正常大鼠中，MRK-016增强了Morris水迷宫延迟匹配位置测试中的认知能力，但无致焦虑作用；在小鼠中，MRK-016无致惊厥作用，且不引起点燃效应。 MRK-016 在大鼠、犬和恒河猴体内的半衰期较短（0.3-0.5 小时），但在人体内的周转率远低于大鼠、犬或恒河猴肝细胞。因此，MRK-016 在人体内的半衰期比在临床前动物模型中长（约 3.5 小时）。尽管 MRK-016 在年轻男性中耐受性良好，最大耐受单次剂量 5 mg 对应的估计占有率约为 75%，但老年受试者对 MRK-016 的耐受性较差，即使剂量仅为 0.5 mg 也是如此。加之其在人体内的药代动力学存在个体差异，限制了其进一步的开发。[2]

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在本研究中，研究人员采用情境恐惧条件反射 (CFC) 范式，测试了反向苯二氮卓类激动剂 MRK-016 (MRK) 对脂多糖 (LPS) 诱导的记忆获取和巩固缺陷的保护作用。在实验一中，小鼠在条件性恐惧训练（CFC）前接受脂多糖（LPS）和/或MRK注射，并在训练后24小时进行测试。在实验二中，动物在训练后立即接受类似的注射，并在24小时后进行测试。此外，在LPS注射后4小时和测试后立即采集海马样本，以评估脑源性神经营养因子（BDNF）和胰岛素样生长因子1（IGF-1）mRNA的表达。结果表明，MRK在两种实验范式中均能保护小鼠免受LPS诱导的学习/记忆能力下降的影响。我们还发现，在两种实验范式中，LPS/生理盐水处理组在LPS给药后4小时的BDNF mRNA表达量显著低于生理盐水/生理盐水处理组，但MRK并未恢复BDNF的表达水平。此外，在任何采集时间点，注射治疗均未对IGF-1 mRNA的表达产生影响。总之，在这种依赖于海马体的范式中，MRK-016 可以保护机体免受 LPS 诱导的记忆获得和巩固缺陷的影响，尽管这种保护作用与 BDNF 表达的恢复无关。[3]

MRK-016 具有口服生物利用度和脑渗透性。已使用 [¹¹C]氟马西尼 PET 成像技术测定了其体内受体占有率。该化合物在 0.3-3 mg/kg 的剂量下，可在中枢神经系统中达到足以产生认知效应的浓度（大鼠）。临床前研究已对其详细的药代动力学参数（包括半衰期和生物利用度）进行了表征。

MRK-016的临床前毒性数据显示，该化合物在药理活性剂量下总体耐受性良好。该化合物已在动物模型中进行了认知增强和抑郁症的评估。治疗开发需要进行全面的毒理学研究。

[1]. An orally bioavailable, functionally selective inverse agonist at the benzodiazepine site of GABAA alpha5 receptors with cognition enhancing properties. J Med Chem. 2004 Nov 18;47(24):5829-32.

[2]. In vitro and in vivo properties of 3-tert-butyl-7-(5-methylisoxazol-3-yl)-2-(1-methyl-1H-1,2,4-triazol-5-ylmethoxy)-pyrazolo[1,5-d]-[1,2,4]triazine (MRK-016), a GABAA receptor alpha5 subtype-selective inverse agonist. J Pharmacol Exp Ther. 2009 Nov;331(2):470-84.

[3]. Administration of the inverse benzodiazepine agonist MRK-016 rescues acquisition and memory consolidation following peripheral administration of bacterial endotoxin. Behav Brain Res. 2015 Jul 15;288:50-3.

(3-叔丁基-7-(5-甲基异噁唑-3-基)-2-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基甲氧基)吡唑并[1,5-d][1,2,4]三唑(13)已被确定为GABA(A) α5受体苯二氮卓位的功能选择性反向激动剂。13具有口服生物利用度，能够迅速穿透中枢神经系统，并增强动物认知模型的表现。它不具备与非选择性GABA(A)反向激动剂相关的抽搐、促抽搐或抗焦虑活性。[1]

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MRK-016是一种用于研究α5-GABAA受体在认知和抑郁中的功能的研究化合物。其对α5亚单位的选择性使其成为理解该受体亚型在认知过程中的作用的宝贵工具。该化合物尚未作为治疗药物进入临床试验。它可用于研究目的。

C17H20N8O2

368.3931016922

368.17

C, 55.43; H, 5.47; N, 30.42; O, 8.69

342652-67-9

6918583

White to off-white solid powder

1.5

109Ų

0

8

5

27

518

0

CC1=CC(=NO1)C2=NN=CC3=C(C(=NN32)OCC4=NC=NN4C)C(C)(C)C

QYSYOGCIDRANAR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H20N8O2/c1-10-6-11(23-27-10)15-21-19-7-12-14(17(2,3)4)16(22-25(12)15)26-8-13-18-9-20-24(13)5/h6-7,9H,8H2,1-5H3

3-[3-tert-butyl-2-[(2-methyl-1,2,4-triazol-3-yl)methoxy]pyrazolo[1,5-d][1,2,4]triazin-7-yl]-5-methyl-1,2-oxazole

TXZ4DVJ9MF; 3-[3-tert-butyl-2-[(2-methyl-1,2,4-triazol-3-yl)methoxy]pyrazolo[1,5-d][1,2,4]triazin-7-yl]-5-methyl-1,2-oxazole; CHEMBL363211;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 50 mg/mL (135.73 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (7.46 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 27.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (7.46 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 27.5mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (7.46 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 27.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。