MRK-016

EC50: 3 nM (GABAA α5)[1] Ki: 0.83 nM (Human GABAA α1β3γ2), 0.85 nM (Human GABAA α2β3γ2), 0.77 nM (Human GABAA α3β3γ2), 1.4 nM (Human GABAA α5β3γ2)[1]

mk-016 的市场 α5 的 ec50 为 3 nm，人权 α1β3η2、营销 α3β3η2、市场 α3β3γ22 和市场 α5β3γ2 的 kis 分别为 0.83、0.85、0.77 和 1.4 NM，mk-016 是一种选择性口服生物利用度 Verse 激动剂市场α5受体。作为 α5 亚型的完全反向激动剂，MRK-016 对 GABAA α4β3γ2 亚型表现出非常低的亲和力 (Ki 395 ± 173 nM)，并且对 GABAA α6β3γ2 受体 (Ki > 4000 nM) 基本上没有活性。 1]在 400 nM 时，MRK-016 对 α4β3γ2 市场的影响可以忽略不计。在小鼠海马切片中，MRK-016 (100 nM) alao 增强了长时程增强作用[2]。

在小鼠体内，连续 20 天，口服 30 mg/kg 剂量的 MRK-016 没有引起癫痫发作，也没有使 ip 注射 10 mg/kg 戊四唑引起的惊厥恶化。在大鼠中，当 MRK-016 占据超过 95% 的苯二氮卓类 (BZ) 结合位点的剂量时，MRK-016 并未表现出明显的类焦虑作用。在大鼠中，MRK-016（0.3、1 和 3 mg/kg，口服）剂量依赖性地增强海马依赖性记忆任务表现[1]。在大鼠中，MRK-016（0.3–30 mg/kg，口服）可产生出色的受体占据率。当以 0.3、1 或 3 mg/kg 口服剂量给药时，Morris 水迷宫的延迟匹配位置版本表现出认知增强活性。用 MRK -016（1、3 或 10 mg/kg ip）处理的小鼠不会产生引火物[2]。在小鼠中，MRK-016（3 mg/kg，腹膜内注射）可预防 LPS 引起的学习和记忆缺陷[3]。

化合物13（MRK-016）在所有四种BZ敏感的GABAA受体亚型上具有高的体外结合亲和力32，范围为0.8至1.4 nM。它对GABAAα4β3γ2亚型的亲和力非常弱（Ki 395±173 nM），对GABAAα6β3γ2中受体基本无活性（Ki>4000 nM）。此外，在147次放射性配体结合和酶测定中检测时，3313没有显示出明显的脱靶活性（IC50值>10μM）。表1所示的疗效值是使用稳定表达人GABAA受体亚型的小鼠成纤维细胞的全细胞膜片钳记录34确定的。32体外疗效是通过使用次最大（EC20）GABA浓度对GABA诱发电流的最大调制百分比来测量的。正值表示GABA诱导电流的增强（激动剂），而负值表示衰减（反向激动剂）。将13的值与临床化合物5、非选择性完全反向激动剂2、9和非选择性完全激动剂氯氮卓（CDZ；14）进行比较。13是α5-亚型的完全反向激动剂，对α1-、α2-和α3-亚型具有功能选择性。在表达α5β3γ2亚型的小鼠成纤维细胞L（tk-）中，13使GABA诱发电流衰减了55%（疗效=-55%），这与完全反向激动剂2基本相同（疗效=-157%），并且大于5产生的电流（疗效=-40%）。相比之下，α1-、α2-和α3-亚型的疗效要低得多，分别为-16%、+6%和-9%的疗效值在弱部分反向激动剂或拮抗剂的范围内。13在α1-和α3-亚型上的疗效与5的记录相当；而α2亚型13基本上是拮抗剂（疗效=+6%），5表现出部分激动作用（疗效=+16%）。事实上，在我们寻找一种在α5亚型具有完全反向激动作用，在其他GABAA受体亚型具有很少功能活性的化合物的过程中，吡唑三嗪13与临床化合物5相比具有更令人印象深刻的疗效。α5-亚型的EC50值为13，为3.0 nM，这补充了其1.4 nM的体外结合亲和力[1]。

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3-叔丁基-7-（5-甲基异恶唑-3-基）-2-（1-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基甲氧基）-吡唑并[1,5-d][1,2,4]三嗪（MRK-016）是一种吡唑三嗪，对天然大鼠脑和重组人含α1-、α2-、α3-和α5-的GABAA受体的苯二氮卓结合位点的亲和力为0.8至1.5 nM。它对α5亚型具有选择性的反向激动作用，这种α5反向激动作用大于原型α5-选择性化合物3-（5-甲基异恶唑-3-基）-6-[（1-甲基-1,2,3-三唑-4-羟基）甲氧基]-1,2,4-三唑并[3,4-a]酞嗪（α5IA）。与其更大的α5反向激动作用一致，MRK-016在小鼠海马脑片中的长期增强作用比α5IA[2]更大。[2]

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13（MRK-016）在大鼠和狗体内的口服生物利用度分别为52%和8%。 在小鼠中测定了13的促惊厥潜力。36在高达10mg/kg ip的剂量下，其中99%的GABAA受体亚型被占据，13不会增强戊四唑诱导的小鼠惊厥。这与非选择性BZ完全反向激动剂212在小鼠中报告的显著惊厥作用和非选择性BZ-部分反向激动剂15（FG 7142）报告的促惊厥作用形成鲜明对比。13虽然非选择性BZ/部分反向激动药在急性给药时在小鼠中没有直接的惊厥作用，但如果连续几天每天给药，它们可以诱导癫痫发作，这一过程被称为“点燃”。13重复给药13（30 mg/kg po，持续20天）不会诱导癫痫发作。尽管15（40 mg/kg ip，20天）诱发癫痫发作，其受体少于13，持续时间较短。大鼠高架迷宫试验37对非选择性BZ反向激动剂（如15.11）的致焦虑作用敏感。在该试验中，13只大鼠在占据BZ结合位点>95%的剂量下没有明显的致焦虑样作用。相比之下，15产生了强烈的抗焦虑作用[1]。
为了研究13对学习和记忆的影响，我们评估了口服13的大鼠在Morris水迷宫延迟“匹配位置”变体（一种海马依赖性认知测试）中的表现。38,39在这项测试中，在第一次和第二次试验中找到隐藏平台（其位置每天都在变化，但在任何一天都是固定的）所需的时间差异被用作大鼠记忆平台位置的指标。池周围的空间线索有助于大鼠导航到平台。39如图2所示，与赋形剂处理的动物相比，试验1和试验2的表现呈剂量依赖性（0.3-3 mg/kg po）改善（p<0.05）。在口服0.3、1和3 mg/kg的大鼠卫星组中，GABAA受体上BZ位点的占有率分别为61%、72%和85%。由于13对游泳速度没有影响，这些数据表明，功能选择性GABAAα5反向激动剂13在这种海马依赖性记忆任务中以剂量依赖的方式显著提高了表现。这些数据补充了结构多样的噻吩427和三唑酞嗪528的研究结果，并支持了选择性α5-亚型反向激动剂可能对治疗认知障碍具有治疗作用的假设。[1]

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13对[3H]Ro 15-1788体内结合的抑制作用用于确定该化合物在大鼠脑GABAA受体BZ位点的占有率。[3H]Ro 15-1788以相等的亲和力与含有α1-、α2-、α3-和α5-亚基的GABAA受体的BZ位点结合，因此，[3H]Ro15-1788的体内结合反映了与这种组合受体群体的结合。然而，由于13也以相同的亲和力与含有α1-、α2-、α3-和α5-亚型的GABAA受体结合，因此占据α5-亚基所需的13剂量与占据α1-、β2-、α-3-和α5-联合亚型所需的剂量相同。如图1所示，口服给药后，大鼠体内13的占据率呈剂量依赖性，占据50%GABAA受体亚型所需的13的平均剂量（给药后0.75小时）为0.35 mg/kg。[1]

与α5受体反向激动作用更强相一致，MRK-016在小鼠海马切片中增强长时程增强作用的程度高于α5IA。MRK-016在大鼠口服给药后受体占有率良好，达到50%占有率所需的剂量为0.39 mg/kg，相应的血浆EC50值为15 ng/ml，与使用[11C]氟马西尼正电子发射断层扫描测得的恒河猴血浆EC50值21 ng/ml相似。在正常大鼠中，MRK-016增强了Morris水迷宫延迟匹配位置测试中的认知能力，但无致焦虑作用；在小鼠中，MRK-016无致惊厥作用，且不引起点燃效应。 MRK-016 在大鼠、犬和恒河猴体内的半衰期较短（0.3-0.5 小时），但在人体内的周转率远低于大鼠、犬或恒河猴肝细胞。因此，MRK-016 在人体内的半衰期比在临床前动物模型中长（约 3.5 小时）。尽管 MRK-016 在年轻男性中耐受性良好，最大耐受单次剂量 5 mg 对应的估计占有率约为 75%，但老年受试者对 MRK-016 的耐受性较差，即使剂量仅为 0.5 mg 也是如此。加之其在人体内的药代动力学存在个体差异，限制了其进一步的开发。[2]

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在本研究中，研究人员采用情境恐惧条件反射 (CFC) 范式，测试了反向苯二氮卓类激动剂 MRK-016 (MRK) 对脂多糖 (LPS) 诱导的记忆获取和巩固缺陷的保护作用。在实验一中，小鼠在条件性恐惧训练（CFC）前接受脂多糖（LPS）和/或MRK注射，并在训练后24小时进行测试。在实验二中，动物在训练后立即接受类似的注射，并在24小时后进行测试。此外，在LPS注射后4小时和测试后立即采集海马样本，以评估脑源性神经营养因子（BDNF）和胰岛素样生长因子1（IGF-1）mRNA的表达。结果表明，MRK在两种实验范式中均能保护小鼠免受LPS诱导的学习/记忆能力下降的影响。我们还发现，在两种实验范式中，LPS/生理盐水处理组在LPS给药后4小时的BDNF mRNA表达量显著低于生理盐水/生理盐水处理组，但MRK并未恢复BDNF的表达水平。此外，在任何采集时间点，注射治疗均未对IGF-1 mRNA的表达产生影响。总之，在这种依赖于海马体的范式中，MRK-016 可以保护机体免受 LPS 诱导的记忆获得和巩固缺陷的影响，尽管这种保护作用与 BDNF 表达的恢复无关。[3]

[1]. An orally bioavailable, functionally selective inverse agonist at the benzodiazepine site of GABAA alpha5 receptors with cognition enhancing properties. J Med Chem. 2004 Nov 18;47(24):5829-32.

[2]. In vitro and in vivo properties of 3-tert-butyl-7-(5-methylisoxazol-3-yl)-2-(1-methyl-1H-1,2,4-triazol-5-ylmethoxy)-pyrazolo[1,5-d]-[1,2,4]triazine (MRK-016), a GABAA receptor alpha5 subtype-selective inverse agonist. J Pharmacol Exp Ther. 2009 Nov;331(2):470-84.

[3]. Administration of the inverse benzodiazepine agonist MRK-016 rescues acquisition and memory consolidation following peripheral administration of bacterial endotoxin. Behav Brain Res. 2015 Jul 15;288:50-3.

(3-叔丁基-7-(5-甲基异噁唑-3-基)-2-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基甲氧基)吡唑并[1,5-d][1,2,4]三嗪 (13) 已被鉴定为 GABA(A) α5 受体苯二氮卓类位点的功能选择性反向激动剂。13 具有口服生物利用度，易于穿透中枢神经系统，并能增强动物认知模型的表现。它不具有非选择性 GABA(A) 反向激动剂相关的致惊厥、促惊厥或致焦虑活性。[1]

C17H20N8O2

368.3931016922

368.17

C, 55.43; H, 5.47; N, 30.42; O, 8.69

342652-67-9

6918583

White to off-white solid powder

1.5

109Ų

0

8

5

27

518

0

QYSYOGCIDRANAR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H20N8O2/c1-10-6-11(23-27-10)15-21-19-7-12-14(17(2,3)4)16(22-25(12)15)26-8-13-18-9-20-24(13)5/h6-7,9H,8H2,1-5H3

3-[3-tert-butyl-2-[(2-methyl-1,2,4-triazol-3-yl)methoxy]pyrazolo[1,5-d][1,2,4]triazin-7-yl]-5-methyl-1,2-oxazole

TXZ4DVJ9MF; 3-[3-tert-butyl-2-[(2-methyl-1,2,4-triazol-3-yl)methoxy]pyrazolo[1,5-d][1,2,4]triazin-7-yl]-5-methyl-1,2-oxazole; CHEMBL363211;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 50 mg/mL (135.73 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (7.46 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 27.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (7.46 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 27.5mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (7.46 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 27.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。