QLT-0267

Integrin linked kinase (ILK); DYRK1

QLT0267 (ILK-IN-3)（化合物 4，10 μM）可将 DYRK1、GSK3α/β 和 CDK5/p25 的活性抑制至 17%、51%、47% 和 95%[2]。

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EMO对HG刺激足细胞nephrin、desmin和ILK表达的影响[2]
为了研究EMO对HG诱导的足细胞EMT的影响，我们检测了上皮标志物nephrin、间充质标志物desmin和ILK。与在NG中孵育相比，暴露于HG 24小时可提高结蛋白和ILK的蛋白表达，同时降低足突细胞中nephrin蛋白的表达。用EMO处理的足细胞显示出结蛋白和ILK蛋白表达的显著降低，以及nephrin表达的增加。同样，ILK抑制剂QLT0267也降低了HG刺激的足突细胞中结蛋白的表达，并提高了nephrin蛋白的表达（图1）。免疫荧光分析进一步证实，HG诱导足细胞结蛋白表达增加。然而，EMO或QLT0267处理缓解了HG诱导的结蛋白表达增加（图2）。这些结果表明，EMO部分恢复了HG刺激的足突细胞中上皮标志物nephrin的表达，并抑制了间充质标志物结蛋白和ILK的表达。

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EMO对HG刺激足细胞nephrin、desmin和ILK mRNA表达的影响[2]
HG治疗24小时显著增加了足突细胞中结蛋白和ILK的mRNA表达，同时降低了nephrin mRNA的表达。然而，HG诱导的nephrin mRNA表达的减少被EMO处理部分恢复（图3）。EMO还显著降低了HG刺激的足突细胞中结蛋白和ILK mRNA的表达。ILK抑制剂QLT0267对HG刺激的足突细胞中结蛋白和肾上腺素的mRNA表达具有相似的影响。

在原位 LCC6 模型中，ILK-IN-3 (QLT0267)（200 mg/kg，界面，28 天）抑制肿瘤生长 [1]。

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评估转移模型是否可以通过将其与ILK抑制剂QLT0267联合使用而对多西他赛致敏。[1]
迄今为止的结果表明，当以接近最大耐受剂量的剂量使用时，转移性疾病对Dt的敏感性最低。这可能部分是由于对已确诊疾病组织的药物输送有限（图3）。为了确定是否可以改善实验性转移模型的治疗，Dt与QLT0267联合使用，QLT0267是一种靶向ILK的药物，可以通过抑制AKT途径使细胞对细胞毒性药物敏感。先前的研究表明，QLT0267在治疗原位LCC6模型时提高了Dt的疗效。在本研究中，QLT0267和Dt单独或联合使用，治疗已确诊LCC6WT-luc转移瘤的动物。转移性疾病（i.c.）按照方法中的描述进行建立和治疗。图6总结了这项体内疗效研究的结果。使用BLI监测肿瘤生长（图6A和B）。存活率（图6C）是根据动物因健康状况不佳而终止试验前的天数确定的。与载体对照治疗的小鼠相比，用Dt、QLT0267和Dt/QLT0267治疗的动物的肿瘤在细胞注射后第21天显示出生物发光减少。总光通量的量化表明，与用载体对照治疗的小鼠相比，接受治疗的小鼠在第21天的肿瘤负担明显减轻（p<0.0001），但用Dt/QLT0267联合治疗的动物没有表现出明显优于单独使用Dt的益处。这可能是因为在这个时间点评估治疗时，Dt治疗非常有效。有趣的是，对生存数据的分析（图6C）（由动物健康定义）表明，肿瘤负担的减轻，如Dt治疗所示，对生存的影响很小。对此的一种可能解释是，10mg/kg能够减缓肿瘤生长，从而在拍摄图像的第21天观察到最小的疾病负担，但后来的图像表明，在第21天之后，Dt治疗的动物的疾病仍在继续发展。此外，对于用QLT0267（200mg/kg）治疗的动物，LCC6WT-luc的中位存活时间为31天（n=5），而对照组动物为23天（n=13）。用Dt治疗的动物LCC6WT-luc的中位存活时间为45天。用QLT0267/Dt组合治疗的动物的中位存活时间并不明显优于单独使用QLT0267，令人惊讶的是，这表明使用药物组合时的治疗结果比单独使用Dt时的治疗效果差。

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EMO对糖尿病大鼠生化指标的影响[3]
如图4所示，糖尿病大鼠的血糖（BG）水平明显高于非糖尿病对照动物。然而，在EMO治疗和未治疗的STZ诱导的糖尿病大鼠之间没有观察到BG水平的差异（图4A）。此外，与正常对照组大鼠相比，STZ诱导的糖尿病大鼠表现出严重的尿白蛋白/肌酐比值（ACR）（P<0.05）。然而，EMO或QLT0267治疗显著降低了STZ诱导的糖尿病大鼠的尿ACR（以mg/g Cr表示），这表明EMO降低了蛋白尿，与QLT0267相似。

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EMO对糖尿病大鼠肾脏组织病理学和足突消失的影响。[3]
与正常对照组大鼠相比，STZ诱导的糖尿病大鼠表现出局灶性系膜基质扩张。然而，与未经治疗的STZ诱导的糖尿病大鼠相比，EMO治疗显著减轻了系膜扩张（图5）。此外，通过电子显微镜（EM）观察足细胞超微结构显示，糖尿病大鼠足细胞足突明显消失，而用EMO治疗的大鼠足突消失明显减少。QLT0267抑制ILK对肾脏组织病理学和足细胞足突的影响与EMO相似（图5）。

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EMO对糖尿病大鼠nephrin、desmin和ILK表达的影响[3]
通过免疫组织化学染色，我们观察到与正常对照组大鼠相比，STZ诱导的糖尿病大鼠肾组织中结蛋白和ILK的表达显著升高，而nephrin的表达降低。然而，所有这些异常都通过EMO治疗得到了部分恢复。ILK抑制剂QLT0267对糖尿病大鼠肾脏nephrin、desmin和ILK的表达具有相似的影响（图6）。蛋白质印迹分析的结果进一步证实了这些发现（图7）。与正常对照组大鼠相比，糖尿病大鼠肾脏中结蛋白和ILK的蛋白表达增加，EMO治疗部分消除了这一现象。此外，糖尿病大鼠的nephrin蛋白水平显著降低，而接受EMO的大鼠nephrin蛋白质产量显著增加（图7）。此外，通过实时定量RT-PCR定量分析nephrin、desmin和ILK mRNA表达的变化。同样，糖尿病大鼠肾皮质结蛋白和ILK的mRNA表达上调，而nephrin的表达下调，EMO治疗后部分减弱（图8）。上述结果表明，EMO对糖尿病大鼠足细胞EMT和随后足细胞减少的保护作用与ILK和结蛋白的抑制以及nephrin的上调有关。

体外研究：细胞培养和EMO治疗[3]
条件永生化小鼠足细胞由Peter Mundel博士提供，并按照上述方法进行[12]。简而言之，足细胞在RPMI 1640中培养，RPMI 1640补充了10%热灭活胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。在10 U/ml小鼠重组干扰素-γ（IFN-γ）存在下，细胞在33°C下生长。为了诱导分化，足突细胞在不含IFN-γ的胶原涂层培养皿上保持在37°C，以允许分化至少7天。分化的细胞通过其大的树枝状形状和已知分化标记突触蛋白的细胞表达进行鉴定。分化的足细胞在含有5mM D-葡萄糖和1%FCS的RPMI 1640培养基中培养24小时，然后暴露于各种实验条件。 然后将细胞分为四组：（1）正常葡萄糖组（NG）作为对照，在含有5 mM葡萄糖的RPMI 1640中孵育。所有实验组均培养4只。

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生长曲线和细胞活力测定。[1]
根据制造商提供的说明，使用Alamar Blue®测定运行来确定代谢活性（用作细胞存活率的衡量标准）。对于生长曲线，将1000个细胞一式三份接种到96孔平底组织培养板上，并在正常生长条件下（37°C和5%CO2在加湿气氛中）粘附在基质上24小时。此后，用Alamar蓝估计活细胞的数量7天。对于细胞毒性试验，6000个细胞/孔（一式三份接种在96孔平底组织培养板上）在正常生长条件下（37°C和5%CO2在加湿气氛中）粘附24小时。将稀释在DMEM细胞培养基中的Dt或载体对照的连续稀释液加入孔中，在测量细胞存活率之前，将细胞再生长72小时。为了评估细胞存活率，细胞在37°C下与10%的刃天青溶液一起孵育4小时，并使用Optima荧光板读数器在560/590 nm下测量荧光。将药物处理细胞测定的相对荧光归一化为对照细胞（在没有添加药物的情况下生长的细胞）测定的荧光，并测定细胞存活率相对于载体对照处理细胞（100%存活率）的百分比（%）。从所有样品中减去背景荧光，并将至少三次重复进行的实验结果取平均值。

在第二项研究（图 3）中，小鼠根据肿瘤接种部位（腹腔注射、耳道注射或脑室内注射）随机分为三组（每组 20 只）。肿瘤的建立方法如上所述，并在第 7 天，所有动物均接受 10 mg/kg 的氚标记氚处理。分别在治疗后 0.5、1、2、4 和 24 小时，每组取出 4 只动物，通过心脏穿刺采集血液，并按照下述方法收集器官。在第三项研究（图 4）中，小鼠根据肿瘤接种部位（腹腔注射、耳道注射或脑室内注射）随机分为三组，并进一步随机分为两个亚组（每组 6 只）（载体组和 5 mg/kg 组）。肿瘤的建立方法如上所述，并在接种后 24 小时和 7 天，所有动物的肿瘤均可通过发光法轻松检测到。在第7天，动物接受赋形剂或Dt（5 mg/kg）（静脉注射，每7天一次，共4次）治疗，该剂量耐受性良好，旨在更好地区分药物在不同模型中的活性。监测动物的生长、体重和存活情况。使用IVIS 200监测肿瘤生长。在第四项研究（图5）中，小鼠根据肿瘤接种部位（腹腔注射或脑室内注射）随机分为两组，然后根据多西他赛的剂量（5、10、15 mg/kg）进一步随机分为四个亚组（每组6只小鼠）。肿瘤的建立方法如上所述，在第7天，动物接受Dt或赋形剂对照治疗（静脉注射，每7天一次，共4次）。监测动物的生长、体重和存活情况。使用 IVIS 200 监测肿瘤生长。在第五项研究（图 6）中，将小鼠随机分为两组，接种 LCC6WT-luc 细胞，然后根据治疗方案（载体、10 mg/kg Dt、200 mg/kg QLT0267 或 10 mg/kg Dt 和 200 mg/kg QLT0267 的组合）进一步随机分为四个亚组（每组五只小鼠）。QLT0267 的剂量（200 mg/kg）和给药方案（每日一次，持续 28 天）的选择基于既往研究，这些研究表明该方案在不同的人源异种移植模型中具有疗效。如上所述建立肿瘤模型，并在第7天对动物进行以下治疗：（载体；Dt-10 mg/kg [静脉注射] [每7天一次，共4次]；QLT0267-200 mg/kg [口服] [每日一次，共28次]；或Dt-10 mg/kg [静脉注射] [每7天一次，共4次]和QLT0267-200 mg/kg [口服] [每日一次，共28次]的组合）。监测动物的肿瘤生长情况（IVIS 200）、体重和整体健康状况。[1]

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健康的雄性Sprague-Dawley大鼠，体重200至220克，饲养于温度为23 ± 1°C、光暗周期为12:12小时的空调房内。动物饲喂标准饲料，并自由饮水。通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ，溶于0.1M柠檬酸缓冲液，pH 4.5，剂量为60 mg/kg）诱导大鼠糖尿病，正常对照组大鼠注射0.1M柠檬酸缓冲液。注射STZ 72小时后，从尾静脉测定血糖水平。血糖水平超过300 mg/dl的大鼠被判定为糖尿病，并纳入研究。随后，将糖尿病大鼠随机分为四组（每组n=12）：（1）STZ诱导的糖尿病大鼠（DM组）； (2) 链脲佐菌素 (STZ) 诱导的糖尿病大鼠接受 EMO 治疗，剂量为 20 mg·kg⁻¹·d⁻¹ (DM+EMO)；(3) STZ 诱导的糖尿病大鼠接受 ILK 抑制剂 QLT0267 治疗，剂量为 10 mg·kg⁻¹·d⁻¹ (DM+QLT0267)；(4) 选择正常 Sprague-Dawley 大鼠作为对照组 (Normal)。EMO 和 QLT0267 均在 STZ 注射后 2 周开始给药，每日一次，连续 12 周。正常对照组 (Normal) 和糖尿病对照组 (DM) 大鼠在相同时间内接受等体积生理盐水治疗。12 周治疗结束后，处死动物并立即取出肾脏。[3]

[1]. Validating the Use of a Luciferase Labeled Breast Cancer Cell Line, MDA435LCC6, as a Means to Monitor Tumor Progression and to Assess the Therapeutic Activity of an Established Anticancer Drug, Docetaxel (Dt) Alone or in Combination With the ILK Inhibitor, QLT0267. Cancer Biol Ther. 2011 May 1;11(9):826-38.

[2]. A facile consensus ranking approach enhances virtual screening robustness and identifies a cell-active DYRK1α inhibitor. Future Med Chem. 2018 Oct;10(20):2411-2430.

[3]. Emodin ameliorates high glucose induced-podocyte epithelial-mesenchymal transition in-vitro and in-vivo. Cell Physiol Biochem. 2015;35(4):1425-36.

药物疗效研究中的一个重要问题是动物实验设计。我们假设，在评估用于治疗癌症的新药或现有疗法时，疾病负荷的部位会影响药物疗效。为了验证这一假设，我们分别将荧光素酶阳性的人乳腺癌细胞（LCC6WT-luc）接种到雌性NCr裸鼠体内，采用原位（ot）、腹腔（ip）或心内（ic）接种，以建立局部、腹水或播散性疾病模型。利用生物发光成像技术监测肿瘤的生长情况。测定了多西他赛（Dt）的药代动力学及其在肿瘤生长部位的分布。我们观察了单独使用Dt治疗以及Dt联合整合素连接激酶抑制剂QLT0267治疗的动物的疾病进展情况。结果显示，当细胞采用心内接种时，肿瘤相关并发症进展最快，在脑、卵巢、肾上腺和肺中均观察到了疾病进展。无论采用何种模型，Dt 的药代动力学特征均相似（平均血浆 AUC0-24 小时为 482.6 ng/mlhr），然而，在脑室内注射细胞后发生疾病的组织中，Dt 水平最低。低剂量 Dt (5 mg/kg) 治疗可提高所有三种模型的总生存期并抑制肿瘤细胞生长，但对原位肿瘤小鼠的疗效最为显著。较高剂量 Dt (15 mg/kg) 可延长腹腔注射肿瘤动物的生存期，但对脑室内肿瘤动物无效。在播散性肿瘤模型中，添加 QLT0267 并未带来优于单独使用 Dt 的额外益处。这些研究强调需要开展更全面的体内疗效研究，以评估多种疾病模型和多个终点，并将药物参数分析的重点放在最具化疗耐药性的疾病上。 [1]

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背景：虚拟筛选对于现代药物发现至关重要，但其性能波动显著，难以准确应用。结果与方法：本文提出了一种概念框架，将具有正交性特征的筛选算法（对接评分计算、3D形状相似性、2D指纹相似性）整合到一个简单、高效且可扩展的基于Python的共识排序方案中。我们创建了一个原创实验数据集，用于比较各种筛选方法与该新方法。该数据集的应用最终鉴定出一种具有细胞活性的DYRK1α抑制剂，并对其进行了磷酸化蛋白质组学评估。结论：共识排序能够以合理的计算成本显著稳定筛选性能，而各种筛选方法则严重依赖于计算设置。结果表明，该新方法目前以免费在线工具的形式提供，非常适合非专业人员进行前瞻性筛选。 [2]

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背景：上皮间质转化（EMT）是导致糖尿病肾病（DKD）中足细胞耗竭和蛋白尿的潜在途径。本研究旨在探讨大黄素（EMO）对高糖（HG）诱导的足细胞EMT在体外和体内的保护作用。方法：将条件永生化的小鼠足细胞暴露于含有30 μg/ml EMO和1 μmol/ml整合素连接激酶（ILK）抑制剂QLT0267的高糖环境中24小时。链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠分别以20 mg·kg⁻¹·d⁻¹的剂量口服EMO，并以10 mg·kg⁻¹·w⁻¹的剂量口服QLT0267，持续12周。检测白蛋白尿和血糖水平。采用免疫组织化学、免疫荧光、蛋白质印迹和实时定量PCR技术，在体外和体内检测ILK、肾素（上皮标志物）和结蛋白（间质标志物）的表达。结果显示：高糖（HG）可增加足细胞ILK和结蛋白的表达，同时降低肾素的表达。然而，EMO可显著抑制高糖刺激的足细胞中ILK和结蛋白的表达，并部分恢复肾素的表达。这些体外观察结果在体内实验中得到了进一步证实。EMO治疗12周可减轻糖尿病大鼠的蛋白尿、肾脏组织病理学改变和足细胞足突消失。 EMO还能抑制肾脏ILK和结蛋白的表达，维持肾素的表达，并改善STZ诱导的糖尿病大鼠的蛋白尿。结论：EMO部分通过抑制ILK和结蛋白以及上调肾素，改善葡萄糖诱导的EMT和随后的足细胞功能障碍，这可能为DKD提供一种潜在的新治疗选择。[3]

C10H12N6O

232.24188

232.107

C, 51.72; H, 5.21; N, 36.19; O, 6.89

6975-75-3

6975-75-3; 866409-68-9;

228619

Light yellow to yellow solid powder

1.5g/cm3

420.4ºC at 760 mmHg

208ºC

1.715

3.16

114.67

3

6

3

17

266

0

COC1=CC=C(C=C1)N=NC2=C(NN=C2N)N

QNRNTYHAOBVOKW-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C10H12N6O/c1-17-7-4-2-6(3-5-7)13-14-8-9(11)15-16-10(8)12/h2-5H,1H3,(H5,11,12,15,16)

4-(4-Methoxy-phenylazo)-1H-pyrazole-3,5-diamine

NSC 21678; NSC-21678; 6975-75-3; ILK-IN-3; 4-((4-Methoxyphenyl)diazenyl)-1H-pyrazole-3,5-diamine; 866409-68-9; 4-[(4-methoxyphenyl)hydrazono]-4h-pyrazole-3,5-diamine; MLS000737992; 4-(4-Methoxy-phenylazo)-1H-pyrazole-3,5-diamine; NSC21678; ILK-IN-3; QLT-0267; QLT 0267; QLT0267; QLT-267; QLT 267; QLT267

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~83.33 mg/mL (~358.81 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.96 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.96 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。