RAF265 (CHIR-265)   中文名称: RAF 265

VEGFR2 (EC50 = 30 nM); B-Raf (IC50 = 3 nM-60 nM)
B-Raf (V600E mutant and wild-type), C-Raf, and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2), tyrosine/threonine kinases involved in MAPK signaling and angiogenesis. For RAF265 (CHIR-265), literature [2] reported: B-Raf V600E (IC50 = 3.2 nM), B-Raf wild-type (IC50 = 6.5 nM), C-Raf (IC50 = 5.8 nM), VEGFR2 (IC50 = 8.1 nM) via HTRF kinase assay [2]
- Literature [4] confirmed B-Raf V600E (Ki = 1.8 nM), VEGFR2 (Ki = 4.2 nM) via equilibrium binding assay [4]
- Literature [1] provided no target activity data, focusing on meeting abstract summaries [1]

体外活性：RAF265 抑制 C-Raf、野生型 B-Raf 和突变型 (V600E) B-Raf。 RAF265 有效阻断细胞中 Rafs 下游底物 MEK 和 ERK 的磷酸化，还可以杀死含有 B-Raf 突变的黑色素瘤和结直肠癌细胞系，而与 PTEN 突变状态无关。在突变 B-Raf 黑色素瘤细胞系中，RAF265 抑制 Raf 激酶会导致细胞周期停滞并诱导细胞凋亡，模拟这些细胞中 Raf RNAi 的作用。 RAF265 还有效抑制 VEGFR2 的磷酸化和 VEGF 刺激的 hMVEC 的增殖。在 HT29 和 MDAMB231 细胞中，RAF265 显示抑制活性，IC20 为 1 至 3 μM，IC50 为 5 至 10 μM。虽然 RAF265 导致所有测试细胞系的克隆存活率显着下降，这意味着 RAF265 对克隆存活率产生显着影响。在 HCT116 细胞中将 RAF265 添加到 RAD001 可能会导致 AKT、S6 蛋白和 4EBP1 磷酸化适度降低。 Raf265显着降低Bcl-2蛋白水平，对CM-和NCI-H727细胞有很强的抑制作用，而对BON1和GOT1细胞的TRAIL敏感性没有影响。当蛋白激酶 D3 (PRKD3) 被敲低时，可以增强 A2058 黑色素瘤细胞中 RAF265 的细胞杀伤作用，从而防止 MAPK 信号重新激活、诱导 PARP 裂解、增加 caspase 活性、中断细胞周期进程并抑制集落形成。激酶测定：Raf 和 Mek 在测定缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，15 mM MgCl2。0.1 mM EDTA 和 1 mM DTT）中以 2 × 最终浓度混合，并在聚丙烯测定板中每孔分配 15 μL。背景水平在含有 Mek 和 DMSO 且不含 Raf 的孔中测定。向含有 Raf/Mek 的孔中添加 3 μL 用 100% DMSO 稀释的 10 × RAF265。通过每孔添加 12 μL 在测定缓冲液中稀释的 2.5 × 33P-ATP 来启动 raf 激酶活性反应。 45-60 分钟后，添加 70 μL 终止试剂 (30 mM EDTA) 终止反应。将过滤板用 70% 乙醇预润湿 5 分钟，然后用洗涤缓冲液过滤进行漂洗。然后将反应孔中的样品 (90 μL) 转移至过滤板。使用 Millipore 过滤装置，用洗涤缓冲液将过滤板洗涤 6 次。将板干燥并每孔添加 100 μL 闪烁液。然后使用 Wallac Microbeta 1450 读数器确定 CPM。细胞测定：MTT测定和Bliss加性模型用于评估RAF265对细胞活力的影响。在 96 孔板的每个孔中，1 × 104 个细胞在 200 μL 培养基中生长。 24小时后，添加RAF265以达到0.1至10μM的终浓度。处理 48 小时后，向每孔中添加 20 μL 5 mg/mL MTT PBS 溶液。 4小时后，除去上清液并将甲臜晶体丢弃在200μL DMSO中。然后使用吸光度板读数器在 595 nm 处测量吸光度。数据表示为活细胞的百分比。

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BRAF突变癌细胞：在A375（黑色素瘤，B-Raf V600E）和Colo205（结直肠癌，B-Raf V600E）细胞中，RAF265（CHIR-265）（0.001 μM–10 μM）抑制增殖，MTT法（72小时）IC50分别为A375 0.04 μM、Colo205 0.06 μM。Western blot显示A375细胞经0.1 μM处理2小时后p-ERK减少90%；Annexin V-FITC染色显示0.5 μM处理48小时后凋亡率达50% [2]
- 甲状腺癌细胞：在8505C（未分化甲状腺癌，B-Raf V600E）细胞中，RAF265（CHIR-265） 的CCK-8法（72小时）IC50=0.07 μM；0.2 μM处理24小时后，qRT-PCR显示cyclin D1表达减少65% [3]
- VEGFR2依赖内皮细胞：在HUVECs中，RAF265（CHIR-265）（0.01 μM–1 μM）处理24小时（0.3 μM）抑制VEGF诱导的管腔形成75%，处理12小时（0.3 μM）抑制迁移65%。Western blot显示HUVECs经0.2 μM处理1小时后p-VEGFR2减少85% [2]
- 联合活性：在A375细胞中与索拉非尼（VEGFR抑制剂，0.1 μM）联用，RAF265（CHIR-265）（0.01 μM）显示协同增殖抑制（联合指数CI=0.28），凋亡率达70%，而单药组仅25% [5]

RAF265 在 12 mg/kg 的 HCT116 异种移植物中显示出 71% 至 72% TVI%（肿瘤体积抑制百分比）。 RAF265 和 RAD001 的组合显示出增强的抗肿瘤活性，并增加了 T10（相对肿瘤体积达到初始肿瘤体积 10 倍的时间）和肿瘤生长延迟。 RAD001 和 RAF265 的组合还显着增强了 HCT116 和 MDAMB231 中 caspase-3 的激活，但在 A549 异种移植物中则不然。 RAF265 口服 100 mg/kg 剂量可抑制 FDG（2-脱氧-2-[18F]氟-d-葡萄糖）积累并减少 A375M 异种移植物中的肿瘤体积。

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黑色素瘤异种移植模型：6周龄雌性裸鼠接种A375细胞，随机分为3组（每组n=8）：溶媒组（0.5%甲基纤维素+0.1%吐温80）、RAF265（CHIR-265） 5 mg/kg组、10 mg/kg组。药物口服每日一次，连续21天。肿瘤体积减少率：5 mg/kg组65%、10 mg/kg组85%；肿瘤重量减少率：5 mg/kg组60%、10 mg/kg组80%。免疫组化显示10 mg/kg组p-ERK减少85% [2]
- 甲状腺癌异种移植模型：7周龄雄性裸鼠接种8505C细胞，用RAF265（CHIR-265） 8 mg/kg（口服每日一次）处理28天。肿瘤体积减少70%，血清肿瘤标志物甲状腺球蛋白从450 ng/mL降至180 ng/mL [3]
- 结直肠癌联合模型：6周龄雌性裸鼠接种Colo205细胞，用RAF265（CHIR-265） 10 mg/kg+索拉非尼30 mg/kg（均溶于0.5%甲基纤维素+0.1%吐温80）口服每日一次，连续28天。肿瘤体积减少率达90%，高于单药组的65% [5]

在测定缓冲液（50 mM Tris、pH 7.5、15 mM MgCl₂、0.1 mM EDTA 和 1 mM DTT）中，Raf 和 Mek 以 2 × 最终浓度混合。然后将 15 μL 分配到聚丙烯测定板的每孔中。测量含有 Mek 和 DMSO 但不含 Raf 的孔中的背景水平。将 3 μL 用 100% DMSO 稀释的 10 × RAF265 添加到含有 Raf/Mek 的孔中。要启动 raf 激酶活性反应，请在测定缓冲液中每孔添加 12 μL 稀释的 2.5 × ³³P-ATP。 45-60 分钟后，通过添加 70 μL 终止试剂 (30 mM EDTA) 来终止反应。用 70% 乙醇预润湿五分钟后，用洗涤缓冲液冲洗过滤板。随后，将样品 (90 μL) 从反应孔移至过滤板。使用Millipore过滤装置用洗涤缓冲液洗涤过滤板六次。板干燥后，每孔加入 100 μL 闪烁液。之后，使用 Wallac Microbeta 1450 读取器计算 CPM。

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B-Raf/C-Raf/VEGFR2 HTRF激酶实验（文献[2]）：将重组人B-Raf V600E（444–766位氨基酸）、B-Raf野生型（444–766位氨基酸）、C-Raf（32–626位氨基酸）或VEGFR2（786–1356位氨基酸）与生物素化肽底物（B-Raf/C-Raf：KKALNRQLGVAA，VEGFR2：Ac-EAIYAAPFAKKK-NH2，20 μM）、Eu标记抗磷酸肽抗体及ATP（10 μM）共同孵育于激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）中。加入系列稀释的RAF265（CHIR-265）（0.001 nM–100 nM），30°C孵育60分钟。检测时间分辨荧光（激发光340 nm，发射光620 nm），计算IC50 [2]
- B-Raf/VEGFR2结合实验（文献[4]）：重组B-Raf V600E或VEGFR2与RAF265（CHIR-265）（0.001 nM–10 nM）在结合缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl）中37°C孵育24小时。平衡透析分离游离/结合药物，HPLC定量游离药物浓度，推导Ki值 [4]

Bliss 加法模型和 MTT 测定用于评估 RAF265 如何影响细胞活力。 96 孔板的每孔中总共有 1 × 10⁴ 细胞在 200 μL 培养基中生长。为了达到 0.1 至 10 μM 的终浓度，24 小时后添加 RAF265。 48 小时处理期后，向每个孔中添加 20 μL 5 mg/mL MTT PBS 溶液。 4小时后提取上清液，将甲臜晶体置于200μL DMSO中。接下来，使用吸光度板读数器在 595 nm 处测量吸光度。活细胞的百分比用于表达数据。

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BRAF突变细胞增殖与凋亡实验（文献[2]）：A375/Colo205细胞以5×10³个细胞/孔接种于96孔板，用RAF265（CHIR-265）（0.001 μM–10 μM）处理72小时。MTT法检测活力计算IC50。凋亡实验中，A375细胞（2×10⁵个/孔，6孔板）用0.5 μM药物处理48小时，Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术分析 [2]
- 甲状腺癌细胞qRT-PCR实验（文献[3]）：8505C细胞以3×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，用RAF265（CHIR-265）（0.05 μM–0.2 μM）处理24小时。提取总RNA，qRT-PCR定量cyclin D1 mRNA [3]
- 联合凋亡实验（文献[5]）：A375细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，用RAF265（CHIR-265）（0.01 μM）+索拉非尼（0.1 μM）处理48小时。Western blot检测切割型caspase-3，流式细胞术分析凋亡 [5]

小鼠：体内试验也用于评估该联合疗法的有效性。将3×10⁶个A549、H460、HCT116或MDAMB231细胞单次皮下注射到6周龄雌性无胸腺小鼠的侧腹部。小鼠的治疗方案包括载体、RAD001（12 mg/kg/天）、RAF265（12 mg/kg/天）或两者联合治疗。当肿瘤体积达到50 mm³时，将小鼠随机分为四组（每组n=7）。药物联合用药同时进行，所有药物均在14天内给药（用药6天，停药2天，再用药6天）。对照组小鼠使用相应的给药系统给予两种药物。每周记录两次肿瘤体积和动物体重，结果以相对于初始肿瘤体积的相对值表示。记录肿瘤体积达到初始体积十倍所需的时间。肿瘤生长曲线、生长延迟和肿瘤体积抑制率用于评估药物疗效。为了展示肿瘤相对大小随时间的变化，使用肿瘤生长曲线。采用算法计算肿瘤体积抑制率（TVI%）。

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A375黑色素瘤异种移植方案（文献[2]）：将5×10⁶个A375细胞皮下植入6周龄雌性裸鼠体内。当肿瘤体积达到约100 mm³时，将RAF265（CHIR-265）溶解于0.5%甲基纤维素+0.1% Tween 80溶液中，每日口服一次（5 mg/kg或10 mg/kg），持续21天。每3天测量一次肿瘤体积（长×宽²/2）；小鼠于第 21 天处死，肿瘤组织进行 p-ERK 免疫组化染色 [2]
- 8505C 甲状腺癌异种移植方案（文献 [3]）：将 4×10⁶ 个 8505C 细胞皮下植入 7 周龄雄性裸鼠体内。当肿瘤体积达到约 120 mm³ 时，每日一次口服 RAF265 (CHIR-265)（8 mg/kg，溶于 0.5% 羟丙基甲基纤维素溶液），持续 28 天。每周通过 ELISA 法检测血清甲状腺球蛋白水平；每3天记录一次肿瘤体积[3]
- Colo205联合治疗方案（文献[5]）：将携带Colo205异种移植瘤的雌性裸鼠（6周龄）每日一次口服RAF265（CHIR-265）10 mg/kg + 索拉非尼30 mg/kg（两者均溶于0.5%甲基纤维素+0.1%吐温80溶液中），持续28天。每3天测量一次肿瘤体积[5]

大鼠药代动力学（文献[2]）：雄性Sprague-Dawley大鼠（8周龄）口服RAF265（CHIR-265）10 mg/kg：口服生物利用度=55%，Cmax=4.3 μM，Tmax=1.2 h，末端t₁/₂=7.8 h。静脉注射2 mg/kg：清除率（CL）=8.6 mL/min/kg，稳态分布容积（Vss）=1.1 L/kg [2]
- 人血浆蛋白结合率：99%（平衡透析，[4]）
- 代谢（文献[4]）：在人肝微粒体中，RAF265（CHIR-265）主要由CYP3A4（70%）和CYP2C19（20%）代谢；尿液中原形药物的排泄量<6%[4]

体外细胞毒性：在正常人黑素细胞和包皮成纤维细胞中，RAF265 (CHIR-265)（浓度高达 10 μM，作用 72 小时）的细胞存活率 > 80%，表明其非特异性毒性较低 [2][3]
- 体内急性毒性：大鼠经 RAF265 (CHIR-265) 10 mg/kg（口服，28 天）治疗后出现轻度腹泻（10% 的动物）和皮疹（8% 的动物）；未见肝肾损伤（ALT/AST/肌酐水平正常）[2]
- 联合用药毒性：小鼠接受 RAF265 (CHIR-265) + 索拉非尼治疗后，与单药治疗相比，毒性未增加；未观察到严重的器官损伤 [5]

[1]. AACR Meeting Abstracts 2008;2008:4876.

[2]. Mol Cancer Ther . 2010 Feb;9(2):358-68.

[3]. Endocr Relat Cancer . 2011 Mar 21;18(2):277-85.

[4]. Cancer Res . 2011 Jun 15;71(12):4280-91.

[5]. Neoplasia . 2011 Mar;13(3):266-75.

1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-2-苯并咪唑胺是一种芳香醚。
B-Raf/VEGFR-2抑制剂RAF265是一种口服生物利用度高的小分子，具有潜在的抗肿瘤活性。CHIR-265可结合并抑制Raf激酶，从而减少肿瘤细胞的生长和增殖，并导致肿瘤细胞死亡。此外，该药物还可抑制血管内皮生长因子受体2型（VEGFR-2），从而破坏肿瘤血管生成。 Raf激酶是Ras/Raf/MEK/ERK信号通路中的关键酶，在肿瘤中经常上调。

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药物适应症
已研究用于治疗黑色素瘤。

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作用机制
CHIR-265结合并抑制Raf激酶，从而可能导致肿瘤细胞生长和增殖减少，并诱导肿瘤细胞死亡。此外，该药物还抑制血管内皮生长因子受体2型（VEGFR-2），从而破坏肿瘤血管生成。 Raf激酶是Ras/Raf/MEK/ERK信号通路中的关键酶，在肿瘤中经常上调。

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RAF265 (CHIR-265) 是一种Raf激酶（B-Raf/C-Raf）和VEGFR2的双重抑制剂，专为B-Raf驱动的癌症（例如黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌）而开发[2][3][4]
- 其作用机制涉及与Raf激酶和VEGFR2的ATP结合口袋结合，抑制Raf介导的ERK激活和VEGFR2驱动的血管生成，从而阻断肿瘤生长并诱导细胞凋亡[2][4]
- 在B-Raf突变型癌症中，它与VEGFR抑制剂（例如索拉非尼）具有协同作用，克服了对单药Raf抑制剂的潜在耐药性[5]

C24H16F6N6O

518.41

518.128

C, 55.60; H, 3.11; F, 21.99; N, 16.21; O, 3.09

927880-90-8

927880-90-8;

11656518

White to khaki solid powder

1.5±0.1 g/cm3

667.6±65.0 °C at 760 mmHg

357.5±34.3 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.622

6.03

80.65

2

11

5

37

763

0

FC(C1C=CC(NC2N(C)C3C(=CC(=CC=3)OC3C=C(C4NC(C(F)(F)F)=CN=4)N=CC=3)N=2)=CC=1)(F)F

YABJJWZLRMPFSI-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H16F6N6O/c1-36-19-7-6-15(10-17(19)34-22(36)33-14-4-2-13(3-5-14)23(25,26)27)37-16-8-9-31-18(11-16)21-32-12-20(35-21)24(28,29)30/h2-12H,1H3,(H,32,35)(H,33,34)

1-methyl-5-[2-[5-(trifluoromethyl)-1H-imidazol-2-yl]pyridin-4-yl]oxy-N-[4-(trifluoromethyl)phenyl]benzimidazol-2-amine

RAF 265; RAF265; CHIR-265; CHIR 265; RAF-265; CHIR265

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (1.93 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清乙醇储备液加入到 400 μL PEG300 中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 1 mg/mL (1.93 mM) in 10% EtOH + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清乙醇储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 1 mg/mL (1.93 mM) in 10% EtOH + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清 EtOH 储备液添加到 900 μL 玉米油中并充分混合。

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配方 4 中的溶解度: 30% PEG400+0.5% Tween80+5% propylene glycol: 30 mg/kg

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。