RAF265 (CHIR-265)   中文名称: RAF 265

VEGFR2 (EC50 = 30 nM); B-Raf (IC50 = 3 nM-60 nM)
B-Raf (V600E mutant and wild-type), C-Raf, and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2), tyrosine/threonine kinases involved in MAPK signaling and angiogenesis. For RAF265 (CHIR-265), literature [2] reported: B-Raf V600E (IC50 = 3.2 nM), B-Raf wild-type (IC50 = 6.5 nM), C-Raf (IC50 = 5.8 nM), VEGFR2 (IC50 = 8.1 nM) via HTRF kinase assay [2]
- Literature [4] confirmed B-Raf V600E (Ki = 1.8 nM), VEGFR2 (Ki = 4.2 nM) via equilibrium binding assay [4]
- Literature [1] provided no target activity data, focusing on meeting abstract summaries [1]

体外活性：RAF265 抑制 C-Raf、野生型 B-Raf 和突变型 (V600E) B-Raf。 RAF265 有效阻断细胞中 Rafs 下游底物 MEK 和 ERK 的磷酸化，还可以杀死含有 B-Raf 突变的黑色素瘤和结直肠癌细胞系，而与 PTEN 突变状态无关。在突变 B-Raf 黑色素瘤细胞系中，RAF265 抑制 Raf 激酶会导致细胞周期停滞并诱导细胞凋亡，模拟这些细胞中 Raf RNAi 的作用。 RAF265 还有效抑制 VEGFR2 的磷酸化和 VEGF 刺激的 hMVEC 的增殖。在 HT29 和 MDAMB231 细胞中，RAF265 显示抑制活性，IC20 为 1 至 3 μM，IC50 为 5 至 10 μM。虽然 RAF265 导致所有测试细胞系的克隆存活率显着下降，这意味着 RAF265 对克隆存活率产生显着影响。在 HCT116 细胞中将 RAF265 添加到 RAD001 可能会导致 AKT、S6 蛋白和 4EBP1 磷酸化适度降低。 Raf265显着降低Bcl-2蛋白水平，对CM-和NCI-H727细胞有很强的抑制作用，而对BON1和GOT1细胞的TRAIL敏感性没有影响。当蛋白激酶 D3 (PRKD3) 被敲低时，可以增强 A2058 黑色素瘤细胞中 RAF265 的细胞杀伤作用，从而防止 MAPK 信号重新激活、诱导 PARP 裂解、增加 caspase 活性、中断细胞周期进程并抑制集落形成。激酶测定：Raf 和 Mek 在测定缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，15 mM MgCl2。0.1 mM EDTA 和 1 mM DTT）中以 2 × 最终浓度混合，并在聚丙烯测定板中每孔分配 15 μL。背景水平在含有 Mek 和 DMSO 且不含 Raf 的孔中测定。向含有 Raf/Mek 的孔中添加 3 μL 用 100% DMSO 稀释的 10 × RAF265。通过每孔添加 12 μL 在测定缓冲液中稀释的 2.5 × 33P-ATP 来启动 raf 激酶活性反应。 45-60 分钟后，添加 70 μL 终止试剂 (30 mM EDTA) 终止反应。将过滤板用 70% 乙醇预润湿 5 分钟，然后用洗涤缓冲液过滤进行漂洗。然后将反应孔中的样品 (90 μL) 转移至过滤板。使用 Millipore 过滤装置，用洗涤缓冲液将过滤板洗涤 6 次。将板干燥并每孔添加 100 μL 闪烁液。然后使用 Wallac Microbeta 1450 读数器确定 CPM。细胞测定：MTT测定和Bliss加性模型用于评估RAF265对细胞活力的影响。在 96 孔板的每个孔中，1 × 104 个细胞在 200 μL 培养基中生长。 24小时后，添加RAF265以达到0.1至10μM的终浓度。处理 48 小时后，向每孔中添加 20 μL 5 mg/mL MTT PBS 溶液。 4小时后，除去上清液并将甲臜晶体丢弃在200μL DMSO中。然后使用吸光度板读数器在 595 nm 处测量吸光度。数据表示为活细胞的百分比。

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BRAF突变癌细胞：在A375（黑色素瘤，B-Raf V600E）和Colo205（结直肠癌，B-Raf V600E）细胞中，RAF265（CHIR-265）（0.001 μM–10 μM）抑制增殖，MTT法（72小时）IC50分别为A375 0.04 μM、Colo205 0.06 μM。Western blot显示A375细胞经0.1 μM处理2小时后p-ERK减少90%；Annexin V-FITC染色显示0.5 μM处理48小时后凋亡率达50% [2]
- 甲状腺癌细胞：在8505C（未分化甲状腺癌，B-Raf V600E）细胞中，RAF265（CHIR-265） 的CCK-8法（72小时）IC50=0.07 μM；0.2 μM处理24小时后，qRT-PCR显示cyclin D1表达减少65% [3]
- VEGFR2依赖内皮细胞：在HUVECs中，RAF265（CHIR-265）（0.01 μM–1 μM）处理24小时（0.3 μM）抑制VEGF诱导的管腔形成75%，处理12小时（0.3 μM）抑制迁移65%。Western blot显示HUVECs经0.2 μM处理1小时后p-VEGFR2减少85% [2]
- 联合活性：在A375细胞中与索拉非尼（VEGFR抑制剂，0.1 μM）联用，RAF265（CHIR-265）（0.01 μM）显示协同增殖抑制（联合指数CI=0.28），凋亡率达70%，而单药组仅25% [5]

RAF265 在 12 mg/kg 的 HCT116 异种移植物中显示出 71% 至 72% TVI%（肿瘤体积抑制百分比）。 RAF265 和 RAD001 的组合显示出增强的抗肿瘤活性，并增加了 T10（相对肿瘤体积达到初始肿瘤体积 10 倍的时间）和肿瘤生长延迟。 RAD001 和 RAF265 的组合还显着增强了 HCT116 和 MDAMB231 中 caspase-3 的激活，但在 A549 异种移植物中则不然。 RAF265 口服 100 mg/kg 剂量可抑制 FDG（2-脱氧-2-[18F]氟-d-葡萄糖）积累并减少 A375M 异种移植物中的肿瘤体积。

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黑色素瘤异种移植模型：6周龄雌性裸鼠接种A375细胞，随机分为3组（每组n=8）：溶媒组（0.5%甲基纤维素+0.1%吐温80）、RAF265（CHIR-265） 5 mg/kg组、10 mg/kg组。药物口服每日一次，连续21天。肿瘤体积减少率：5 mg/kg组65%、10 mg/kg组85%；肿瘤重量减少率：5 mg/kg组60%、10 mg/kg组80%。免疫组化显示10 mg/kg组p-ERK减少85% [2]
- 甲状腺癌异种移植模型：7周龄雄性裸鼠接种8505C细胞，用RAF265（CHIR-265） 8 mg/kg（口服每日一次）处理28天。肿瘤体积减少70%，血清肿瘤标志物甲状腺球蛋白从450 ng/mL降至180 ng/mL [3]
- 结直肠癌联合模型：6周龄雌性裸鼠接种Colo205细胞，用RAF265（CHIR-265） 10 mg/kg+索拉非尼30 mg/kg（均溶于0.5%甲基纤维素+0.1%吐温80）口服每日一次，连续28天。肿瘤体积减少率达90%，高于单药组的65% [5]

在测定缓冲液（50 mM Tris、pH 7.5、15 mM MgCl₂、0.1 mM EDTA 和 1 mM DTT）中，Raf 和 Mek 以 2 × 最终浓度混合。然后将 15 μL 分配到聚丙烯测定板的每孔中。测量含有 Mek 和 DMSO 但不含 Raf 的孔中的背景水平。将 3 μL 用 100% DMSO 稀释的 10 × RAF265 添加到含有 Raf/Mek 的孔中。要启动 raf 激酶活性反应，请在测定缓冲液中每孔添加 12 μL 稀释的 2.5 × ³³P-ATP。 45-60 分钟后，通过添加 70 μL 终止试剂 (30 mM EDTA) 来终止反应。用 70% 乙醇预润湿五分钟后，用洗涤缓冲液冲洗过滤板。随后，将样品 (90 μL) 从反应孔移至过滤板。使用Millipore过滤装置用洗涤缓冲液洗涤过滤板六次。板干燥后，每孔加入 100 μL 闪烁液。之后，使用 Wallac Microbeta 1450 读取器计算 CPM。

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B-Raf/C-Raf/VEGFR2 HTRF激酶实验（文献[2]）：将重组人B-Raf V600E（444–766位氨基酸）、B-Raf野生型（444–766位氨基酸）、C-Raf（32–626位氨基酸）或VEGFR2（786–1356位氨基酸）与生物素化肽底物（B-Raf/C-Raf：KKALNRQLGVAA，VEGFR2：Ac-EAIYAAPFAKKK-NH2，20 μM）、Eu标记抗磷酸肽抗体及ATP（10 μM）共同孵育于激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）中。加入系列稀释的RAF265（CHIR-265）（0.001 nM–100 nM），30°C孵育60分钟。检测时间分辨荧光（激发光340 nm，发射光620 nm），计算IC50 [2]
- B-Raf/VEGFR2结合实验（文献[4]）：重组B-Raf V600E或VEGFR2与RAF265（CHIR-265）（0.001 nM–10 nM）在结合缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl）中37°C孵育24小时。平衡透析分离游离/结合药物，HPLC定量游离药物浓度，推导Ki值 [4]

Bliss 加法模型和 MTT 测定用于评估 RAF265 如何影响细胞活力。 96 孔板的每孔中总共有 1 × 10⁴ 细胞在 200 μL 培养基中生长。为了达到 0.1 至 10 μM 的终浓度，24 小时后添加 RAF265。 48 小时处理期后，向每个孔中添加 20 μL 5 mg/mL MTT PBS 溶液。 4小时后提取上清液，将甲臜晶体置于200μL DMSO中。接下来，使用吸光度板读数器在 595 nm 处测量吸光度。活细胞的百分比用于表达数据。

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BRAF突变细胞增殖与凋亡实验（文献[2]）：A375/Colo205细胞以5×10³个细胞/孔接种于96孔板，用RAF265（CHIR-265）（0.001 μM–10 μM）处理72小时。MTT法检测活力计算IC50。凋亡实验中，A375细胞（2×10⁵个/孔，6孔板）用0.5 μM药物处理48小时，Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术分析 [2]
- 甲状腺癌细胞qRT-PCR实验（文献[3]）：8505C细胞以3×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，用RAF265（CHIR-265）（0.05 μM–0.2 μM）处理24小时。提取总RNA，qRT-PCR定量cyclin D1 mRNA [3]
- 联合凋亡实验（文献[5]）：A375细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，用RAF265（CHIR-265）（0.01 μM）+索拉非尼（0.1 μM）处理48小时。Western blot检测切割型caspase-3，流式细胞术分析凋亡 [5]

Mice: In vivo testing is also done to evaluate the combination's effectiveness. The flank region of 6-week-old female athymic mice receives a single subcutaneous injection of 3×10⁶ A549, H460, HCT116, or MDAMB231 cells. Treatment options for the mice are vehicle, RAD001 (12 mg/kg daily), RAF265 (12 mg/kg daily), or both, and they are randomized into four groups (n=7/group) once the tumors reach 50 mm3. The drug combination is administered concurrently, and all medications are administered over a period of 14 days (6 days on, 2 days off, and 6 days on). Both drugs are given to control mice in their appropriate delivery systems. Tumor volumes and animal weights are recorded twice a week, and the results are expressed in relation to the original tumor volume. It is recorded how long it takes for a tumor to reach a relative volume ten times its initial volume. Tumor growth curve, growth delay, and percentage of tumor volume inhibition are used to evaluate the efficacy of drugs. To show how the relative tumor size has changed over time, a tumor growth curve is used. An algorithm is used to compute the tumor volume inhibition percentage (TVI%).

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A375 Melanoma Xenograft Protocol (Literature [2]): Female nude mice (6 weeks old) were subcutaneously implanted with 5×10⁶ A375 cells. When tumors reached ~100 mm³, RAF265 (CHIR-265) was dissolved in 0.5% methylcellulose + 0.1% Tween 80, administered orally once daily (5 mg/kg or 10 mg/kg) for 21 days. Tumor volume (length×width²/2) was measured every 3 days; mice were euthanized on day 21, tumors processed for p-ERK immunohistochemistry [2]
- 8505C Thyroid Cancer Xenograft Protocol (Literature [3]): Male nude mice (7 weeks old) were subcutaneously implanted with 4×10⁶ 8505C cells. When tumors reached ~120 mm³, RAF265 (CHIR-265) (8 mg/kg, dissolved in 0.5% hydroxypropyl methylcellulose) was oral once daily for 28 days. Serum thyroglobulin was measured weekly via ELISA; tumor volume was recorded every 3 days [3]
- Colo205 Combination Protocol (Literature [5]): Female nude mice (6 weeks old) with Colo205 xenografts were treated with RAF265 (CHIR-265) 10 mg/kg + sorafenib 30 mg/kg (both dissolved in 0.5% methylcellulose + 0.1% Tween 80) orally once daily for 28 days. Tumor volume was measured every 3 days [5]

Rat pharmacokinetics (Reference [2]): Male Sprague-Dawley rats (8 weeks old) were orally administered RAF265 (CHIR-265) 10 mg/kg: oral bioavailability = 55%, Cmax = 4.3 μM, Tmax = 1.2 h, terminal t₁/₂ = 7.8 h. Intravenous injection of 2 mg/kg: clearance (CL) = 8.6 mL/min/kg, steady-state volume of distribution (Vss) = 1.1 L/kg [2] - Human plasma protein binding: 99% (equilibrium dialysis, [4]) - Metabolism (Reference [4]): In human liver microsomes, RAF265 (CHIR-265) is mainly metabolized by CYP3A4 (70%) and CYP2C19 (20%); the amount of the unchanged drug excreted in urine is <6% [4]

In vitro cytotoxicity: In normal human melanocytes and foreskin fibroblasts, the cell survival rate of RAF265 (CHIR-265) (at a concentration of up to 10 μM, for 72 hours) was >80%, indicating that its non-specific toxicity was low [2][3]
- Acute in vivo toxicity: Rats treated with RAF265 (CHIR-265) 10 mg/kg (orally, for 28 days) showed mild diarrhea (10% of animals) and rash (8% of animals); no liver or kidney damage was observed (ALT/AST/creatinine levels were normal) [2]
- Combination drug toxicity: In mice treated with RAF265 (CHIR-265) + sorafenib, there was no increase in toxicity compared with monotherapy; no serious organ damage was observed [5]

[1]. AACR Meeting Abstracts 2008;2008:4876.

[2]. Mol Cancer Ther . 2010 Feb;9(2):358-68.

[3]. Endocr Relat Cancer . 2011 Mar 21;18(2):277-85.

[4]. Cancer Res . 2011 Jun 15;71(12):4280-91.

[5]. Neoplasia . 2011 Mar;13(3):266-75.

1-Methyl-5-[[2-[5-(trifluoromethyl)-1H-imidazol-2-yl]-4-pyridyl]oxy]-N-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-2-benzimidazolamide is an aromatic ether.
The β-Raf/VEGFR-2 inhibitor RAF265 is a small molecule with high oral bioavailability and potential antitumor activity. CHIR-265 binds to and inhibits Raf kinase, thereby reducing tumor cell growth and proliferation and leading to tumor cell death. Furthermore, this drug also inhibits vascular endothelial growth factor receptor type 2 (VEGFR-2), thereby disrupting tumor angiogenesis. Raf kinase is a key enzyme in the Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathway and is frequently upregulated in tumors.
Drug Indications

It has been studied for the treatment of melanoma.
Mechanism of Action

CHIR-265 binds to and inhibits Raf kinase, which may lead to reduced tumor cell growth and proliferation and induce tumor cell death. In addition, the drug also inhibits vascular endothelial growth factor receptor type 2 (VEGFR-2), thereby disrupting tumor angiogenesis. Raf kinase is a key enzyme in the Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathway and is frequently upregulated in tumors. RAF265 (CHIR-265) is a dual inhibitor of Raf kinase (B-Raf/C-Raf) and VEGFR2, developed specifically for B-Raf-driven cancers (e.g., melanoma, colorectal cancer, thyroid cancer) [2][3][4] - Its mechanism of action involves binding to the ATP-binding pocket of Raf kinase and VEGFR2, inhibiting Raf-mediated ERK activation and VEGFR2-driven angiogenesis, thereby blocking tumor growth and inducing apoptosis [2][4] - In B-Raf-mutant cancers, it has a synergistic effect with VEGFR inhibitors (e.g., sorafenib), overcoming potential resistance to monotherapy Raf inhibitors [5]

C24H16F6N6O

518.41

518.128

C, 55.60; H, 3.11; F, 21.99; N, 16.21; O, 3.09

927880-90-8

927880-90-8;

11656518

White to khaki solid powder

1.5±0.1 g/cm3

667.6±65.0 °C at 760 mmHg

357.5±34.3 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.622

6.03

80.65

2

11

5

37

763

0

FC(C1C=CC(NC2N(C)C3C(=CC(=CC=3)OC3C=C(C4NC(C(F)(F)F)=CN=4)N=CC=3)N=2)=CC=1)(F)F

YABJJWZLRMPFSI-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H16F6N6O/c1-36-19-7-6-15(10-17(19)34-22(36)33-14-4-2-13(3-5-14)23(25,26)27)37-16-8-9-31-18(11-16)21-32-12-20(35-21)24(28,29)30/h2-12H,1H3,(H,32,35)(H,33,34)

1-methyl-5-[2-[5-(trifluoromethyl)-1H-imidazol-2-yl]pyridin-4-yl]oxy-N-[4-(trifluoromethyl)phenyl]benzimidazol-2-amine

RAF 265; RAF265; CHIR-265; CHIR 265; RAF-265; CHIR265

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (1.93 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清乙醇储备液加入到 400 μL PEG300 中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 1 mg/mL (1.93 mM) in 10% EtOH + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清乙醇储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 1 mg/mL (1.93 mM) in 10% EtOH + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清 EtOH 储备液添加到 900 μL 玉米油中并充分混合。

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配方 4 中的溶解度: 30% PEG400+0.5% Tween80+5% propylene glycol: 30 mg/kg

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。