T1-CDK9 (IC50 = 1 nM); cyclin B1-CDK1 (IC50 = 2 nM); cyclin E-CDK2 (IC50 = 3 nM); cyclin D1-CDK4 (IC50 = 4 nM); cyclin E-CDK3 (IC50 = 5 nM); p35-CDK5 (IC50 = 5 nM); cyclin H-CDK7 (IC50 = 44 nM); cyclin D3-CDK6 (IC50 = 55 nM); GSK-3β (IC50 = 3 nM); JAK2 (IC50 = 50 nM); MEK1 (IC50 = 54 nM); Fms (IC50 = 1 nM); TAK1 (IC50 = 5 nM); JNK1a1 (IC50 = 17 nM); JNK1a2 (IC50 = 40 nM); C-src (IC50 = 25 nM); AMPK (IC50 = 41 nM)
Transcriptional cyclin-dependent kinases (CDKs) (Ki values in nanomolar range) [1]

体外活性：RGB-286638 是一种茚并吡唑衍生的 CDK 抑制剂 (CDKI)，具有抗转录 CDK 的 Ki 纳摩尔活性。 RGB-286638 抑制多种酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸非 CDK 酶，即 GSK-3β、TAK1、AMPK、Jak2、MEK1。研究了 RGB-286638 (12.5-100nM) 治疗对人 p53-wt（MM.1S、MM.1R 和 H929）和 p53-mutant（U266、OPM1、和 RPMI) MM 细胞通过 MTT 测定，评估 24 和 48 小时的活力。 48 小时时的半最大有效浓度 (EC50) 范围为 20 至 70 nM。 50nM 处理后，观察到 p53-wt 和突变细胞的生长存在剂量依赖性差异，其中 p53-wt MM.1S、MM.1R 和 H929 在 48 小时对 RGB-286638 处理稍微更敏感。激酶测定：使用核提取试剂盒从用 50 nM RGB-286638 处理 1、4 和 8 小时的 MM.1S 细胞中分离核蛋白。将核蛋白等分并添加到涂有含有 p53 响应元件的特定双链 DNA 序列的 96 孔板中，过夜孵育。通过添加针对 p53 的特异性一抗来检测核提取物中的 p53。添加与 HRP 缀合的二抗，可在 450 nm 处提供灵敏的比色读数。所有实验均一式三份进行 细胞测定：比色测定用于评估 RGB-286638 (0-100 nM) 浓度增加时的药物活性。将来自 24 小时或 48 小时培养物的表达野生型 p53 (MM.1S、MM.1R、H929) 或突变型 p53 (U266、OPM1、RPMI) 的细胞用 10μL 5mg/mL MTT 脉冲到每个孔中，然后37℃孵育4小时，加入100μL含0.04HCl的异丙醇。在分光光度计上获取 570nm 波长处的吸光度读数（使用 630nm 处的读数进行校正）。所有实验均一式三份进行。

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RGB-286638 2HCl（化学名称：1-(3-{4-[4-(2-甲氧基乙基)-哌嗪-1-基甲基]-苯基}-4-氧代-1,4-二氢茚并[1,2-c]吡唑-5-基)-3-吗啉-4-基-脲二盐酸盐；分子式：C₂₉H₃₇N₇O₄·2HCl；分子量：618.52）对多发性骨髓瘤（MM）细胞系具有强效的剂量和时间依赖性细胞毒性。MTT实验显示，野生型p53 MM细胞系（MM.1S、MM.1R、H929）和突变型p53 MM细胞系（U266、OPM1、RPMI）在48小时的EC₅₀为20-70 nM [1]
- 该化合物对从MM患者体内分离的原代肿瘤细胞（经CD138+阳性筛选）具有相当的细胞毒性，0-100 nM浓度下48小时MTT实验可评估其细胞活力 [1]
- 用RGB-286638 2HCl处理MM细胞系1、4和8小时后，western blot检测显示，RNA聚合酶II（RNAPII）S²/S⁵位点磷酸化水平及Rb蛋白S⁸⁰⁷/⁸¹¹/S⁷⁸⁰位点磷酸化水平下调，表明其可抑制转录CDKs [1]
- 50 nM浓度处理4、8和24小时后，western blot检测显示，该化合物可诱导野生型和突变型p53 MM细胞发生caspase依赖性凋亡，伴随抗凋亡蛋白（Mcl-1、XIAP）表达降低，以及caspase 3、8、9激活和PARP裂解 [1]
- 流式细胞术（碘化丙啶染色）分析显示，50 nM浓度处理MM.1S细胞12和24小时后，化合物可干扰细胞周期进程，影响G1/S和G2/M期转换 [1]
- Annexin V/PI染色结合FACS分析显示，50 nM浓度处理MM.1S细胞12和24小时后，化合物可诱导早期凋亡，凋亡细胞比例随处理时间延长而增加 [1]
- 2小时孵育实验中，[5′-³H]尿苷掺入法检测显示，0-100 nM RGB-286638 2HCl可抑制MM.1S细胞中RNAPII介导的转录，减少RNA合成。8和24小时共培养实验中，该化合物还可通过[5′-³H]尿苷和[³H-TdR]摄取实验证实，其能阻断骨髓基质细胞（BMSC）诱导的MM.1S细胞RNA和DNA合成 [1]
- 在野生型p53 MM细胞中，该化合物通过核仁应激和Mdm2表达降低诱导p53积累，增加p53 S¹⁵位点磷酸化，促进p53核转位，并增强p53序列特异性DNA结合活性，相关结果通过western blot（核/细胞质组分）、免疫荧光显微镜和DNA结合实验证实 [1]
- 该化合物具有p53非依赖性细胞毒性：p53敲低的MM.1S细胞（转染p53 shRNA）和突变型p53 MM细胞系（U266、OPM1、RPMI）在0-100 nM浓度下均出现显著细胞毒性。在突变型p53细胞中，其可减少RNA合成，下调Mcl-1表达并诱导PARP裂解，进而触发凋亡 [1]
- 化合物可调控miRNA表达：TaqMan® miRNA特异性RT-PCR检测显示，50 nM浓度处理8小时后，其可在MM.1S细胞（单独培养或与BMSC共培养）和突变型p53 MM细胞系中抑制致癌性miR-19a-5p、miR-21-3p和miR-92a-1-5p的表达 [1]

RGB-286638 40 mg/kg/天 IV 治疗被确定为 SCID 小鼠的最大耐受剂量。 RGB-286638 静脉注射五天可显着抑制 MM 肿瘤生长，在治疗结束后第 14 天观察到最大 TGI (%)，在 30 mg/kg 和 40 mg/kg 治疗组中分别为 85.06% 和 86.34%。两个处理组的 log10 细胞杀伤（LCK Td：4.5 天）均为 1.6。 RGB-286638 治疗还与生存率改善相关，对照组在第 24 天首次死亡，而两个治疗组在第 43 天首次死亡就证明了这一点。本研究期间没有发生中毒性死亡：在 30 mg/kg 剂量方案的第 5 天（8.4%）观察到最大体重（BW）损失百分比，在 40 mg/kg 剂量方案后的第 15 天（9.9%）观察到体重（BW）损失最大百分比，体重在接下来的两周内恢复。

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在接种3×10⁶个MM.1S细胞的SCID小鼠皮下异种移植模型中，RGB-286638 2HCl表现出显著的抗MM活性。每日静脉尾静脉注射30 mg/kg或40 mg/kg，连续5天，与载体对照组相比，可抑制肿瘤生长并延长小鼠存活时间 [1]
- 治疗组小鼠出现短暂体重下降：30 mg/kg组在第5天体重最大下降8.4%，40 mg/kg组在第15天体重最大下降9.9%，随后两周内恢复 [1]

核提取试剂盒用于从暴露于 50nM RGB-286638 1、4 和 8 小时的 MM.1S 细胞中分离核蛋白。将含有 p53 反应元件的特定双链 DNA 序列包被在 96 孔板上，并添加等份核蛋白进行过夜孵育。通过添加针对 p53 的特定一抗，可以识别核提取物中的 p53。通过添加与 HRP 结合的二抗，可以在 450 nm 处获得灵敏的比色读数。每个实验都会进行三次检查[1]。

比色测定用于测量药物在逐渐升高的 RGB-286638 浓度 (0-100nM) 下的功效。将 10μL 5 mg/mL MTT 脉冲注入表达 p53 的野生型（MM.1S、MM.1R、H929）或突变体（U266、OPM1、 RPMI）来自 24 或 48 小时培养物的细胞。然后将细胞在 37°C 下孵育 4 小时。使用分光光度计，在 570 nm 波长处进行吸光度测量（使用 630 nm 处的读数进行校正）。每个实验进行三次重复[1]。

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MTT细胞活力实验：将MM细胞系（野生型或突变型p53）或原代MM患者细胞（CD138+筛选）接种到96孔板中。用0-100 nM浓度的RGB-286638 2HCl处理24或48小时。加入MTT试剂孵育，溶解甲臜结晶后，通过吸光度检测确定细胞活力并计算EC₅₀值 [1]
- Western blot分析：用0-100 nM RGB-286638 2HCl处理MM细胞系指定时间点（1-24小时）。裂解细胞，提取总蛋白、核蛋白或细胞质蛋白，经SDS-PAGE分离后转移至膜上。用针对靶蛋白（如p-RNAPII、Rb、p53、Mdm2、caspases、PARP、Mcl-1、XIAP、GAPDH、p84、α-微管蛋白）的特异性抗体孵育，检测蛋白表达、磷酸化或裂解情况 [1]
- 细胞周期和凋亡流式细胞术分析：细胞周期分析中，用50 nM RGB-286638 2HCl处理MM.1S细胞12或24小时，固定后用碘化丙啶染色，分析DNA含量。凋亡分析中，用50 nM化合物处理细胞12或24小时，用Annexin V/PI染色，通过FACS量化凋亡细胞比例 [1]
- RNA合成实验：MM.1S细胞（单独培养或与BMSC共培养）用0-100 nM RGB-286638 2HCl预孵育1小时（共培养为8/24小时）。加入[5′-³H]尿苷孵育1小时，通过放射性检测评估RNA合成 [1]
- DNA合成实验：MM.1S细胞（有或无BMSC）用0-100 nM RGB-286638 2HCl处理8或24小时。加入[³H-TdR]孵育，通过放射性检测评估细胞增殖 [1]
- 免疫荧光显微镜观察：MM.1S细胞用50 nM RGB-286638 2HCl或仅培养基处理3小时。用双重检测试剂重悬细胞30分钟，在荧光显微镜下（60×放大倍数）观察核仁碎片化和p53定位 [1]
- p53 DNA结合实验：提取50 nM RGB-286638 2HCl处理1、4或8小时的MM.1S细胞核提取物。进行p53序列特异性DNA结合实验，检测结合活性，结果以三次重复培养的平均值±标准差表示 [1]
- miRNA表达分析：MM细胞（单独培养或与BMSC共培养）用50 nM RGB-286638 2HCl处理8小时。提取总RNA，用miRNA特异性引物进行逆转录，通过TaqMan® RT-PCR量化miR-19a-5p、miR-21-3p和miR-92a-1-5p的表达。计算相对于未处理细胞的相对定量（RQ）值 [1]
- p53敲低细胞实验：将p53 shRNA或空载体转染至MM.1S细胞。用嘌呤霉素筛选转染细胞。用0-100 nM RGB-286638 2HCl处理细胞48小时，通过MTT实验评估活力，western blot验证p53敲低效果和p-RNAPII表达 [1]

40 mg/kg；静脉注射
小鼠：使用MM异种移植模型评估RGB-286638的体内抗MM活性。Agennix AG公司制备并提供RGB-286638给药溶液，浓度为2 mg/mL和3 mg/mL，溶于5%葡萄糖/水（D5W，pH 5.2）中，同时提供D5W（pH 5.2）作为载体对照组。所用小鼠为CB-17重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠。共40只5至6周龄的雄性小鼠接受2 Gy [200 rad]的辐射，辐射源为铯137（137Cs）；照射后24小时，小鼠的MM数量为2.5 x 10⁶。将1S细胞皮下接种于小鼠背部上方。当肿瘤重量约为 100 mg 时，将小鼠随机分为三组，连续五天每天经尾静脉注射 RGB-286638，剂量分别为 30 mg/kg（8 只小鼠）、40 mg/kg（9 只小鼠）或仅注射对照载体（10 只小鼠）。每隔一天，使用游标卡尺测量动物的体重和肿瘤体积，并估算肿瘤体积。从治疗第一天到死亡，评估生存情况。从治疗第一天到首次处死当天，使用游标卡尺测量肿瘤生长情况，并计算肿瘤生长抑制率 (TGI)。

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SCID 小鼠 MM 异种移植模型：将 3 × 10⁶ 个 MM.1S 细胞（悬浮于 100 μL RPMI 培养基中）皮下注射到 SCID 小鼠体内。肿瘤形成后，将荷瘤小鼠随机分为三组（载体对照组、30 mg/kg RGB-286638 2HCl 组、40 mg/kg RGB-286638 2HCl 组），每组 n ≥ 5 只小鼠。连续 5 天，每日经尾静脉注射给药。定期监测小鼠体重和肿瘤生长情况（体积）。记录生存时间，绘制 Kaplan-Meier 生存曲线。研究结束时处死小鼠，收集肿瘤组织进行分析 [1]

[1]. Small-molecule multi-targeted kinase inhibitor RGB-286638 triggers P53-dependent and -independent anti-multiple myeloma activity through inhibition of transcriptional CDKs. Leukemia. 2013 Dec;27(12):2366-75.

RGB-286638 2HCl 是一种源自茚并吡唑的小分子多靶点激酶抑制剂[1]。它通过抑制转录 CDK 发挥抗多发性骨髓瘤 (MM) 活性，从而触发 p53 依赖性和 p53 非依赖性细胞凋亡。这种独特的机制使其对具有野生型 p53（通过 p53 激活）和具有突变/缺失 p53（通过其他细胞死亡途径）的 MM 细胞均有效，从而解决了 MM 中 p53 缺失相关的预后不良问题[1]。该化合物能够抑制 MM 细胞中骨髓间充质干细胞 (BMSC) 诱导的 RNA 和 DNA 合成，表明其可以克服肿瘤微环境的保护作用，这是 MM 治疗中的一个关键挑战[1]。

C29H37CL2N7O4

618.6

617.228

784210-87-3

RGB-286638 free base;784210-88-4

11285001

Light yellow to yellow solid

4.243

118.55

5

8

8

42

857

0

Cl.Cl.O(C)CCN1CCN(CC2C=CC(=CC=2)C2C3C(C4C(=CC=CC=4C=3NN=2)NC(NN2CCOCC2)=O)=O)CC1

WJVMGQMXUBAAPL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C29H35N7O4.2ClH/c1-39-16-13-34-9-11-35(12-10-34)19-20-5-7-21(8-6-20)26-25-27(32-31-26)22-3-2-4-23(24(22)28(25)37)30-29(38)33-36-14-17-40-18-15-36;;/h2-8H,9-19H2,1H3,(H,31,32)(H2,30,33,38);2*1H

1-[3-[4-[[4-(2-methoxyethyl)piperazin-1-yl]methyl]phenyl]-4-oxo-1H-indeno[1,2-c]pyrazol-5-yl]-3-morpholin-4-ylurea;dihydrochloride

RGB-286638 2HCl; RGB 286638 2HCl; RGB2866382HCl

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 7.5 mg/mL (12.13 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 75.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 7.5 mg/mL (12.13 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 75.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。