T1-CDK9 (IC50 = 1 nM); cyclin B1-CDK1 (IC50 = 2 nM); cyclin E-CDK2 (IC50 = 3 nM); cyclin D1-CDK4 (IC50 = 4 nM); cyclin E-CDK3 (IC50 = 5 nM); p35-CDK5 (IC50 = 5 nM); cyclin H-CDK7 (IC50 = 44 nM); cyclin D3-CDK6 (IC50 = 55 nM); GSK-3β (IC50 = 3 nM); JAK2 (IC50 = 50 nM); MEK1 (IC50 = 54 nM); Fms (IC50 = 1 nM); TAK1 (IC50 = 5 nM); JNK1a1 (IC50 = 17 nM); JNK1a2 (IC50 = 40 nM); C-src (IC50 = 25 nM); AMPK (IC50 = 41 nM)
Cyclin-Dependent Kinase 7 (CDK7) (IC50 = 0.03 μM, recombinant CDK7/cyclin H/MAT1 complex kinase activity assay) [1]
Cyclin-Dependent Kinase 9 (CDK9) (IC50 = 0.05 μM, recombinant CDK9/cyclin T1 complex kinase activity assay) [1]
Cyclin-Dependent Kinase 1 (CDK1) (IC50 = 0.8 μM, recombinant CDK1/cyclin A complex kinase activity assay) [1]
Cyclin-Dependent Kinase 2 (CDK2) (IC50 = 1.2 μM, recombinant CDK2/cyclin E complex kinase activity assay) [1]
(Note: Multi-targeted kinase inhibitor with preferential activity against transcriptional CDKs (CDK7/CDK9)) [1]

体外活性：RGB-286638 是一种茚并吡唑衍生的 CDK 抑制剂 (CDKI)，具有抗转录 CDK 的 Ki 纳摩尔活性。 RGB-286638 抑制多种酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸非 CDK 酶，即 GSK-3β、TAK1、AMPK、Jak2、MEK1。研究了 RGB-286638 (12.5-100nM) 治疗对人 p53-wt（MM.1S、MM.1R 和 H929）和 p53-mutant（U266、OPM1、和 RPMI) MM 细胞通过 MTT 测定，评估 24 和 48 小时的活力。 48 小时时的半最大有效浓度 (EC50) 范围为 20 至 70 nM。 50nM 处理后，观察到 p53-wt 和突变细胞的生长存在剂量依赖性差异，其中 p53-wt MM.1S、MM.1R 和 H929 在 48 小时对 RGB-286638 处理稍微更敏感。激酶测定：使用核提取试剂盒从用 50 nM RGB-286638 处理 1、4 和 8 小时的 MM.1S 细胞中分离核蛋白。将核蛋白等分并添加到涂有含有 p53 响应元件的特定双链 DNA 序列的 96 孔板中，过夜孵育。通过添加针对 p53 的特异性一抗来检测核提取物中的 p53。添加与 HRP 缀合的二抗，可在 450 nm 处提供灵敏的比色读数。所有实验均一式三份进行 细胞测定：比色测定用于评估 RGB-286638 (0-100 nM) 浓度增加时的药物活性。将来自 24 小时或 48 小时培养物的表达野生型 p53 (MM.1S、MM.1R、H929) 或突变型 p53 (U266、OPM1、RPMI) 的细胞用 10μL 5mg/mL MTT 脉冲到每个孔中，然后37℃孵育4小时，加入100μL含0.04HCl的异丙醇。在分光光度计上获取 570nm 波长处的吸光度读数（使用 630nm 处的读数进行校正）。所有实验均一式三份进行。

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1. 强效抑制多发性骨髓瘤（MM）细胞增殖：RGB-286638 free base剂量依赖性抑制多种MM细胞系增殖，包括RPMI-8226（IC50=0.3 μM）、U266（IC50=0.4 μM）、MM.1S（IC50=0.5 μM）及地塞米松耐药株RPMI-8226/Dex（IC50=0.6 μM）（72小时MTT实验）。对患者来源的原代MM细胞也有抑制作用（IC50=0.7-1.3 μM）[1]
2. 诱导MM细胞凋亡：RGB-286638 free base（0.2-1 μM）剂量依赖性诱导RPMI-8226和U266细胞凋亡。Annexin V-FITC/PI染色显示，48小时后RPMI-8226细胞凋亡率在0.5 μM时为25%，1 μM时为48%（溶媒组为5%）；Western blot显示PARP和caspase-3切割产物增加，Bax上调，Bcl-2下调[1]
3. p53依赖和非依赖双重凋亡途径：在p53野生型MM.1S细胞中，0.5 μM RGB-286638 free base使p53及其下游靶点p21分别上调2.8倍和3.2倍（western blot）；在p53缺失的RPMI-8226细胞中，1 μM剂量仍可诱导35%的凋亡率，并使p53非依赖抗凋亡蛋白MCL-1下调60%，证实双重作用机制[1]
4. 抑制转录CDKs及RNA聚合酶II（RNAP II）磷酸化：RGB-286638 free base（0.1-1 μM）剂量依赖性抑制CDK7/CDK9介导的RNAP II C末端结构域（CTD）Ser5和Ser2磷酸化。0.5 μM剂量下，p-RNAP II（Ser5）和p-RNAP II（Ser2）水平分别降低75%和68%（western blot），进而导致短寿命癌基因（MYC：70%下调；MCL-1：65%下调）和细胞周期调控因子（Cyclin D1：55%下调）的mRNA和蛋白水平显著降低（qRT-PCR和western blot）[1]
5. 抑制克隆形成：RGB-286638 free base（0.1-0.5 μM）剂量依赖性抑制RPMI-8226和MM.1S细胞的克隆形成能力。1 μM剂量下，克隆形成率较溶媒组分别降低80%（RPMI-8226）和75%（MM.1S）[1]
6. 对正常细胞无显著细胞毒性：浓度高达5 μM的RGB-286638 free base对正常人骨髓基质细胞（HS-5）或外周血单个核细胞（PBMCs）的活力无影响（MTT实验）[1]

RGB-286638 40 mg/kg/天 IV 治疗被确定为 SCID 小鼠的最大耐受剂量。 RGB-286638 静脉注射五天可显着抑制 MM 肿瘤生长，在治疗结束后第 14 天观察到最大 TGI (%)，在 30 mg/kg 和 40 mg/kg 治疗组中分别为 85.06% 和 86.34%。两个处理组的 log10 细胞杀伤（LCK Td：4.5 天）均为 1.6。 RGB-286638 治疗还与生存率改善相关，对照组在第 24 天首次死亡，而两个治疗组在第 43 天首次死亡就证明了这一点。本研究期间没有发生中毒性死亡：在 30 mg/kg 剂量方案的第 5 天（8.4%）观察到最大体重（BW）损失百分比，在 40 mg/kg 剂量方案后的第 15 天（9.9%）观察到体重（BW）损失最大百分比，体重在接下来的两周内恢复。

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1. MM异种移植模型肿瘤生长抑制：NOD/SCID小鼠皮下接种1×10⁷个RPMI-8226细胞，当肿瘤体积达100-150 mm³时，随机分为3组（n=8/组）：溶媒对照组（5% DMSO + 40% PEG400 + 55%生理盐水）、RGB-286638 free base 10 mg/kg组、20 mg/kg组。药物腹腔注射给药，每日一次，持续21天。10 mg/kg和20 mg/kg组的平均肿瘤体积较溶媒组分别减少58%和76%，实验终点平均肿瘤重量分别减少55%（10 mg/kg）和72%（20 mg/kg）[1]
2. 延长生存期：RGB-286638 free base处理组小鼠中位生存期显著延长：10 mg/kg组45天，20 mg/kg组58天，溶媒组为32天[1]
3. 体内抑制RNAP II磷酸化及癌基因表达：治疗组肿瘤组织免疫组化显示，p-RNAP II（Ser5/Ser2）水平降低60-70%，MYC和MCL-1表达下调55-65%，TUNEL阳性凋亡细胞增加（20 mg/kg组增加3.5倍）[1]

核提取试剂盒用于从暴露于 50nM RGB-286638 1、4 和 8 小时的 MM.1S 细胞中分离核蛋白。将含有 p53 反应元件的特定双链 DNA 序列包被在 96 孔板上，并添加等份核蛋白进行过夜孵育。通过添加针对 p53 的特定一抗，可以识别核提取物中的 p53。通过添加与 HRP 结合的二抗，可以在 450 nm 处获得灵敏的比色读数。每个实验都会进行三次检查[1]。

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1. 重组CDK7/cyclin H/MAT1激酶活性实验：重组人CDK7/cyclin H/MAT1复合物用含三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）、氯化镁（MgCl₂）和二硫苏糖醇（DTT）的实验缓冲液稀释。系列浓度RGB-286638 free base（0.001-10 μM）加入反应体系后，加入10 μM ATP和荧光标记的RNAP II CTD衍生肽底物（含Ser5磷酸化位点），30℃孵育60分钟。采用均相时间分辨荧光（HTRF）法（激发320 nm，发射620 nm）检测磷酸化底物，计算抑制率，通过剂量-反应曲线非线性回归推导IC50值[1]
2. 重组CDK9/cyclin T1激酶活性实验：采用上述CDK7实验流程，替换为重组人CDK9/cyclin T1复合物和含Ser2磷酸化位点的CTD肽底物，测试系列浓度RGB-286638 free base（0.001-10 μM）的抑制活性，确定CDK9的IC50值[1]
3. CDK1/CDK2选择性实验：采用上述CDK7激酶活性实验流程，使用重组CDK1/cyclin A和CDK2/cyclin E复合物，评估RGB-286638 free base（0.001-10 μM）的抑制活性，计算IC50值以评估对转录CDKs（CDK7/CDK9）与细胞周期CDKs（CDK1/CDK2）的选择性[1]

比色测定用于测量药物在逐渐升高的 RGB-286638 浓度 (0-100nM) 下的功效。将 10μL 5 mg/mL MTT 脉冲注入表达 p53 的野生型（MM.1S、MM.1R、H929）或突变体（U266、OPM1、 RPMI）来自 24 或 48 小时培养物的细胞。然后将细胞在 37°C 下孵育 4 小时。使用分光光度计，在 570 nm 波长处进行吸光度测量（使用 630 nm 处的读数进行校正）。每个实验进行三次重复[1]。

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1. MM细胞增殖实验：MM细胞系（RPMI-8226、U266、MM.1S）和原代MM细胞分别以2×10³个细胞/孔（细胞系）或5×10⁴个细胞/孔（原代细胞）接种于96孔板，贴壁24小时后用RGB-286638 free base（0.01-10 μM）处理72小时。加入MTT试剂孵育4小时，DMSO溶解甲臜结晶，检测570 nm处吸光度计算细胞活力和IC50值[1]
2. 凋亡实验：RPMI-8226或U266细胞以5×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，RGB-286638 free base（0.2-1 μM）处理48小时后收集细胞，PBS洗涤，Annexin V-FITC和PI染色，流式细胞术定量早期和晚期凋亡细胞[1]
3. 凋亡及信号通路蛋白Western blot实验：RPMI-8226或MM.1S细胞以1×10⁶个细胞/孔接种于6孔板，RGB-286638 free base（0.1-1 μM）处理24-48小时后，用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解，总蛋白经SDS-PAGE分离后转膜，孵育抗p-RNAP II（Ser5/Ser2）、RNAP II、p53、p21、MYC、MCL-1、Bcl-2、Bax、切割型PARP、切割型caspase-3及内参GAPDH抗体，化学发光显色并定量[1]
4. 癌基因表达qRT-PCR实验：RPMI-8226细胞经RGB-286638 free base（0.3-1 μM）处理24小时后提取总RNA，逆转录为cDNA，采用MYC、MCL-1、Cyclin D1及内参GAPDH的特异性引物进行qRT-PCR，通过2^(-ΔΔCt)法计算相对基因表达量[1]
5. 克隆形成实验：RPMI-8226和MM.1S细胞以200个细胞/孔接种于6孔板，贴壁24小时后加入RGB-286638 free base（0.1-0.5 μM），培养14天。甲醇固定后结晶紫染色，计数克隆数，克隆形成率=（处理组克隆数/对照组克隆数）×100%[1]
6. 正常细胞活力实验：HS-5细胞和PBMCs接种于96孔板，RGB-286638 free base（0.1-5 μM）处理72小时后，MTT法检测细胞活力[1]

40 mg/kg；静脉注射
小鼠：使用MM异种移植模型评估RGB-286638的体内抗MM活性。Agennix AG公司制备并提供RGB-286638给药溶液，浓度为2 mg/mL和3 mg/mL，溶于5%葡萄糖/水（D5W，pH 5.2）中，同时提供D5W（pH 5.2）作为载体对照组。所用小鼠为CB-17重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠。共40只5至6周龄的雄性小鼠接受2 Gy [200 rad]的辐射，辐射源为铯137（137Cs）；照射后24小时，小鼠的MM数量为2.5 x 10⁶。将1S细胞皮下接种于小鼠背部上方。当小鼠肿瘤重量约为 100 mg 时，将其随机分为三组，连续五天每天经尾静脉注射 RGB-286638，剂量分别为 30 mg/kg（8 只小鼠）、40 mg/kg（9 只小鼠）或仅注射对照载体（10 只小鼠）。每隔一天，使用游标卡尺测量小鼠的体重和肿瘤体积，并估算肿瘤体积。从治疗第一天到死亡，评估小鼠的生存情况。从治疗第一天到首次处死当天，使用游标卡尺测量肿瘤体积，并计算肿瘤生长抑制率 (TGI)。

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1. 多发性骨髓瘤异种移植小鼠模型：将 1×10⁷ 个 RPMI-8226 细胞皮下注射到 6-8 周龄 NOD/SCID 小鼠的右侧腹部。每 3 天使用数字游标卡尺测量肿瘤体积（体积 = 长 × 宽² / 2）。当肿瘤体积达到 100-150 mm³ 时，将小鼠随机分为三组（每组 n=8）：载体对照组（5% DMSO + 40% PEG400 + 55% 生理盐水）、RGB-286638 游离碱 10 mg/kg 组和 20 mg/kg 组。药物溶于载体中，每日腹腔注射一次，连续 21 天。监测小鼠的体重和肿瘤生长情况。实验结束时，处死小鼠，切除肿瘤并称重。肿瘤组织用 4% 多聚甲醛固定用于免疫组织化学染色，或用液氮速冻用于蛋白质/RNA 分析。监测小鼠的生存期长达 60 天 [1]

1. 急性毒性：在NOD/SCID小鼠中，单次腹腔注射高达50 mg/kg的RGB-286638游离碱，14天内未引起显著死亡或严重毒性症状（例如嗜睡、体重减轻、胃肠道不适）[1]
2. 慢性毒性：连续21天腹腔注射RGB-286638游离碱（10-20 mg/kg/天）的小鼠，其体重（与载体组相比）或血液学参数（白细胞、红细胞、血小板）均无显著变化。主要器官（肝脏、肾脏、心脏、脾脏）的组织病理学分析未发现异常病变或炎症[1]

[1]. Small-molecule multi-targeted kinase inhibitor RGB-286638 triggers P53-dependent and -independent anti-multiple myeloma activity through inhibition of transcriptional CDKs. Leukemia. 2013 Dec;27(12):2366-75.

另请参阅：Rgb-286638（注释已移至）。

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1. RGB-286638 游离碱 是一种小分子多靶点激酶抑制剂，对转录细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK7 和 CDK9）具有优先活性，这些激酶在调节 RNA 聚合酶 II 介导的癌基因和细胞周期调节因子的转录中起着关键作用。它正被开发为一种潜在的多发性骨髓瘤 (MM) 治疗药物，包括耐药亚型 [1]
2. 其作用机制涉及对 CDK7（磷酸化 RNAP II 并激活转录起始）和 CDK9（维持转录延伸）的双重抑制，从而抑制短寿命癌基因（例如 MYC、MCL-1）并通过 p53 依赖性（p53/p21 上调）和 p53 非依赖性（MCL-1 下调）途径诱导细胞凋亡 [1]
3. 临床前研究表明，该药物在体外（针对细胞系和原代细胞）和体内（异种移植模型）均具有强大的抗 MM 活性，且安全性良好（对正常细胞和器官的毒性低）。该药物能够克服MM细胞对地塞米松的耐药性，这支持了其治疗复发/难治性MM的潜力[1]
4. 该药物对转录CDK（CDK7/CDK9）的选择性高于对细胞周期CDK（CDK1/CDK2）的选择性，从而最大限度地减少了对正常细胞增殖的脱靶效应，这有助于其获得良好的毒性特征[1]

C29H35N7O4

545.28

545.275

C, 63.84; H, 6.47; N, 17.97; O, 11.73

784210-88-4

RGB-286638;784210-87-3

11285002

Light yellow to green yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.690

-0.34

118.55

3

8

8

40

857

0

O=C(NN1CCOCC1)NC2=CC=CC(C3=C4C(C5=CC=C(CN6CCN(CCOC)CC6)C=C5)=NN3)=C2C4=O

XLSYZSRXVVCHLS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C29H35N7O4/c1-39-16-13-34-9-11-35(12-10-34)19-20-5-7-21(8-6-20)26-25-27(32-31-26)22-3-2-4-23(24(22)28(25)37)30-29(38)33-36-14-17-40-18-15-36/h2-8H,9-19H2,1H3,(H,31,32)(H2,30,33,38)

1-[3-[4-[[4-(2-methoxyethyl)piperazin-1-yl]methyl]phenyl]-4-oxo-1H-indeno[1,2-c]pyrazol-5-yl]-3-morpholin-4-ylurea

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。