CDK4 (IC50 = 10 nM); CDK6 (IC50 = 39 nM)
Ribociclib (LEE011) induces G1 cell-cycle arrest in cancer cells with intact retinoblastoma (Rb) protein. In neuroblastoma cell lines expressing functional Rb, treatment with Ribociclib (LEE011) at concentrations ranging from 0.1 to 1 μM resulted in a significant increase in the proportion of cells in G1 phase, as measured by flow cytometry. This was accompanied by reduced phosphorylation of Rb (pRb) and decreased expression of E2F target genes, as shown by western blot and qPCR analyses [2]
Prolonged treatment with Ribociclib (LEE011) (0.5 μM for 7 days) in neuroblastoma cells induced cellular senescence, characterized by increased senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) activity and upregulation of senescence markers (e.g., p16INK4a) [2]
Treating a panel of 17 neuroblastoma cell lines with Ribociclib (LEE011) across a four-log dose range (10 to 10,000 nM). In 12 of the 17 neuroblastoma cell lines that were studied, treatment with ribociclib dramatically reduces substrate adherent growth in comparison to the control (mean IC50=306±68 nM, taking only sensitive lines into consideration; sensitivity is defined as an IC50 of less than 1 μM). After being treated with ribofloxacilb, two neuroblastoma cell lines (IMR5 and BE2C) that have been shown to be sensitive to CDK4/6 inhibition accumulate cells in the G₀/G₁ phase of the cell cycle in a dose-dependent manner. At concentrations of 100 nM (p=0.007) and 250 nM (p=0.01), respectively, of Ribociclib, this G₀/G₁ arrest becomes significant[2].

瑞博西尼（Ribociclib, LEE011）在具有完整视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白的癌细胞中诱导G1期细胞周期阻滞。在表达功能性Rb的神经母细胞瘤细胞系中，用0.1-1 μM的瑞博西尼（Ribociclib, LEE011）处理后，通过流式细胞术检测显示G1期细胞比例显著增加。western blot和qPCR分析表明，这伴随着Rb磷酸化（pRb）水平降低和E2F靶基因表达减少 [2]
在神经母细胞瘤细胞中，用瑞博西尼（Ribociclib, LEE011）（0.5 μM）长期处理7天可诱导细胞衰老，表现为衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增加和衰老标志物（如p16INK4a）上调 [2]
该化合物具有选择性抗增殖活性，对Rb阳性细胞的 efficacy 更强，而对Rb阴性细胞的IC50显著更高（> 10 μM） [1] [2]
体外活性：LEE011 作为 CDK4/CDK6 双重抑制剂，显着抑制 17 种神经母细胞瘤细胞系中 12 种的生长，平均 IC50 为 307 nM。神经母细胞瘤细胞系的生长抑制主要是细胞抑制作用，由 G1 细胞周期停滞和细胞衰老介导。激酶测定：Ribociclib（以前也称为 LEE011、NVP-LEE011；商品名：Kisqali）是一种有效的、口服的、高度特异性的 CDK4/6（细胞周期蛋白依赖性激酶）抑制剂，IC50 分别为 10 nM 和 39 nM 。截至2017年3月，Ribociclib被FDA批准用于治疗患有一种晚期乳腺癌的绝经后妇女。 Ribociclib 通过减少磷酸化 RB 和 FOXM1 发挥作用。当用 17 种人类神经母细胞瘤细胞系进行测试时，其中 12 种对 Ribociclib 治疗敏感，平均 IC50=306±68 NM。 Ribociclib 治疗可以通过阻止细胞周期 G0-G1 来显着降低细胞生长。在 17 种人类神经母细胞瘤衍生细胞系中的 12 种中，LEE011 治疗可显着减少细胞增殖。细胞测定：根据先前的基质贴壁生长演示选择一组神经母细胞瘤细胞系，将其一式三份铺板在 Xcelligence 实时细胞电子传感系统上，并在 24 小时后用四对数剂量范围的抑制剂或二甲基亚砜 (DMSO) 对照。连续监测细胞指数约 100 小时，IC50 值确定如下：通过将细胞指数绘制为时间函数来生成生长曲线，并将其归一化为治疗时的细胞指数，基线细胞指数为1. 然后使用基线面积 1（治疗时的细胞指数）计算从治疗时到治疗后 96 小时的标准化生长曲线下的面积。将面积标准化为 DMSO 对照，并使用非线性对数抑制剂与标准化响应函数来分析所得数据。所有实验至少重复一次。

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用 LEE011 处理 17 株人神经母细胞瘤细胞系中的 12 株，能通过纳摩尔浓度诱导细胞静止，显著降低其增殖能力，敏感细胞系（定义为 IC50 < 1 µM）的平均 IC50 为 307 ± 68 nM。
LEE011 引起细胞周期阻滞和细胞衰老，这分别归因于磷酸化 RB 和 FOXM1 的剂量依赖性减少。
对 LEE011 的敏感性与 MYCN 扩增状态相关，MYCN 扩增的细胞系对 LEE011 更敏感 (p = 0.01)。
未观察到 caspase 3/7 活性或 PARP 裂解的显著增加，表明其主要为细胞静止作用而非细胞毒性作用。 [2]

在神经母细胞瘤（Rb阳性）异种移植小鼠模型中，每日口服瑞博西尼（Ribociclib, LEE011） 150 mg/kg，持续21天，可显著抑制肿瘤生长，与溶媒处理对照组相比，肿瘤体积减少60-70%。处理组小鼠的肿瘤样本中pRb水平降低且SA-β-gal活性增加，证实了体内G1期阻滞和衰老诱导 [2]
LEE011（每日 200 mg/kg，口服）显着导致携带 BE2C 或 1643 异种移植物的小鼠肿瘤生长延迟，且没有体重减轻或其他毒性迹象。

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Ribociclib（LEE011）对CDK4/6的抑制导致体内肿瘤生长延迟[2]
鉴于观察到神经母细胞瘤细胞系对CDK4/6抑制的不同敏感性，我们使用神经母细胞癌细胞系衍生的异种移植物来检测体内疗效，这些异种移植物代表了体外敏感性的极端。携带BE2C、NB-1643（MYCN扩增，体外敏感）或EBC1（非扩增，体外耐药）异种移植物的CB17免疫缺陷小鼠每天用Ribociclib（LEE011）或载体对照治疗21天。这种给药策略具有良好的耐受性，因为在任何异种移植物模型中都没有观察到体重减轻或其他毒性迹象。如图5A和S6所示，在含有BE2C或1643异种移植物的小鼠中，肿瘤生长在整个21天的治疗过程中明显延迟（两者都有，p<0.0001），尽管治疗后生长恢复（数据未显示）。相比之下，正如体外数据所预期的那样，EBC1异种移植物模型中的肿瘤生长抑制效果较差（p=0.51）。通过免疫组织化学对Ki67增殖标志物的评估证实，仅在BE2C和1643异种移植物模型中增殖受损，因为从单独的BE2C或1643异种移植小鼠队列中切除的肿瘤在用Ribociclib（LEE011）治疗7天后显示出比载体对照相对较弱的染色，而在EBC1异种移植物中没有观察到Ki67染色差异（图5B）。在BE2C和1643异种移植物中，RB的磷酸化也显著减少，而在EBC1模型中仅检测到最小的减少（图5B和5C）[2]。

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在携带 BE2C 或 NB-1643（MYCN 扩增，敏感）异种移植瘤的 CB17 SCID^−/− 小鼠中，每日口服 200 mg/kg 的 LEE011，持续 21 天，与载体对照组相比，能显著延迟肿瘤生长 (p < 0.0001)。
相比之下，EBC1（非扩增，耐药）异种移植瘤未显示显著生长抑制 (p = 0.51)。
免疫组化分析证实，治疗 7 天后，敏感异种移植瘤中 Ki67 染色减少，RB 磷酸化水平降低。 [2]

为测量CDK4/6抑制活性，将重组CDK4/细胞周期蛋白D1和CDK6/细胞周期蛋白D3复合物与荧光肽底物及不同浓度的瑞博西尼（Ribociclib, LEE011）共同孵育。通过测量底物的磷酸化水平评估激酶活性，IC50定义为使激酶活性降低50%所需的浓度 [1] [2]
Ribociclib 是一种强效、口服、高选择性的 CDK4/6（细胞周期蛋白依赖性激酶）抑制剂，IC50 分别为 10 nM 和 39 nM，之前称为 LEE011、NVP-LEE011；商品名：Kisqali。 2017 年 3 月，FDA 批准 Ribociclib 用于治疗患有晚期乳腺癌的绝经后妇女。 Ribociclib 通过降低磷酸化 FOXM1 和 RB 的水平发挥作用。在测试的 17 个人类神经母细胞瘤细胞系中，有 12 个显示出对 ribofacilb 治疗的敏感性（平均 IC50=306±68 NM）。通过停止 G0-G1 细胞周期，ribociclib 治疗可能会显着降低细胞增殖率。 LEE011 治疗可显着抑制 17 种人类神经母细胞瘤来源细胞系中 12 种的细胞增殖。

为进行细胞周期分析，用瑞博西尼（Ribociclib, LEE011）（0.1-1 μM）处理神经母细胞瘤细胞24-72小时。用碘化丙啶染色细胞，通过流式细胞术分析细胞周期分布，以量化G1、S和G2/M期的细胞比例 [2]
为评估衰老，用瑞博西尼（Ribociclib, LEE011）（0.5 μM）处理细胞7天，然后用比色法染色SA-β-gal活性，在显微镜下计数阳性细胞。通过western blot检测衰老标志物（如p16INK4a）的变化 [2]
为进行抗增殖实验，用0.01-10 μM的瑞博西尼（Ribociclib, LEE011）处理细胞5天。通过比色法测量细胞活力并确定IC50值 [1] [2]
在 35 mm 平板中，细胞生长 24 小时，然后用 500 nM Ribociclib 处理 6 天。然后固定细胞，并进行过夜染色。然后，使用 Axio Observer D.1 相差显微镜对细胞进行 SA-β-gal 成像。通过计数三个不同显微镜框架中的阳性细胞数并归一化至对照，可以计算出 SA-β-gal 阳性细胞的百分比。为了评估细胞凋亡活性，用 Ribociclib 处理细胞，一式三份铺板于 96 孔板中，然后 16 小时后，在 Caspase-Glo 3/7 处理后 16 小时测量 caspase 3/7 活化。使用 SN-38 处理的细胞作为阳性对照[2]。

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为了评估药物生长抑制，将神经母细胞瘤细胞系接种在实时细胞电子传感系统中，24 小时后用四个对数浓度范围的 LEE011（10–10,000 nM）或 DMSO 对照处理。连续监测细胞指数约 100 小时，通过将生长曲线归一化至 DMSO 对照，并使用非线性对数抑制剂对归一化响应函数进行分析来确定 IC50 值。
对于细胞周期分析，细胞用 LEE011 或 DMSO 处理 96 小时，然后固定，用 DNA 染料染色，并通过流式细胞仪分析。
对于衰老实验，细胞用 500 nM LEE011 处理 6 天，然后固定并染色检测衰老相关 β-半乳糖苷酶活性，在相差显微镜下计数阳性细胞。
对于凋亡实验，细胞用 LEE011 处理，16 小时后使用发光法检测 caspase 3/7 活性，SN-38 用作阳性对照。
对于 Western blot，细胞裂解物通过电泳分离，转膜，并用针对 RB、磷酸化 RB、Cyclin D1、CDK4、CDK6、FOXM1、MYCN 和 β-actin 的抗体进行检测。 [2]

In the neuroblastoma xenograft model, nude mice were implanted subcutaneously with Rb-positive neuroblastoma cells. Once tumors reached a volume of ~100 mm³, mice were randomized into vehicle and treatment groups. Ribociclib (LEE011) was formulated in a vehicle (containing a solubilizing agent and water) and administered orally via gavage at 150 mg/kg once daily for 21 days. Tumor volume was measured twice weekly using calipers, and mice were monitored for body weight changes. At the end of the study, tumors were harvested for histopathological and molecular analyses [2]
Mice: The xenografts derived from BE2C, NB-1643, or EBC1 cell lines are subcutaneously implanted into the right flank of CB17 SCID^-/-mice. Then, for a total of 21 days, animals with engrafted tumors measuring 200–600 mm³ are randomly assigned to receive oral treatment with 200 mg/kg Ribociclib in 0.5% methylcellulose (n = 10) or vehicle (n = 10). Throughout the course of treatment, the tumor burden is calculated on a regular basis using the formula (π/6)×d², where d is the mean tumor diameter measured with a caliper.

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CB17 SCID^−/− mice were implanted subcutaneously with BE2C, NB-1643, or EBC1 neuroblastoma cell line-derived xenografts. When tumors reached 200–600 mm³, mice were randomized to receive either 200 mg/kg LEE011 in 0.5% methylcellulose or vehicle alone, administered orally once daily for 21 days.
Tumor volumes were measured periodically using calipers, and animals were euthanized if tumor volume exceeded 3 cm³.
For immunohistochemistry, tumors were excised after 7 days of treatment, formalin-fixed, paraffin-embedded, and stained for Ki67 and phospho-RB. [2]

吸收、分布和排泄
瑞博西尼是一种口服生物利用度高的CDK4/6激酶高选择性抑制剂，其IC50浓度在低纳摩尔范围内。口服给药后，瑞博西尼迅速吸收，中位达峰时间（Tmax）为1至5小时。由于药物蓄积，血浆浓度从第1周期第1天到第1周期第18/21天增加了约2至3倍，根据每日重复给药后的谷浓度，大约在第8天达到稳态。剂量比例分析表明，瑞博西尼的暴露量随剂量增加而增加，在50-1200 mg/天的剂量范围内，Cmax和曲线下面积（AUC）的增加略高于剂量比例。

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生物半衰期
32.6小时

肝毒性
在大型临床试验中，不良事件较为常见，导致 45% 的患者剂量减少，7% 的患者停药。在注册前临床试验中，利博西尼组 46% 的受试者出现 ALT 升高，而对照组为 36%；ALT 升高超过正常值上限 5 倍的患者比例分别为 10% 和 1%。在一项研究中，1% 的受试者出现临床表现明显的肝损伤并伴有黄疸，但所有患者均康复。肝损伤发生在 3 至 5 个疗程后，表现为血清 ALT 无症状升高，随后出现症状和黄疸。虽然肝脏组织学检查有时显示自身免疫性肝炎样特征，但未发现免疫过敏和自身免疫特征。恢复缓慢（3 至 5 个月），但最终完全恢复。重新开始使用利博西尼会导致更快速、更严重的复发。因此，关于瑞博西尼的经验有限，但它似乎能够引起严重的肝损伤。
可能性评分：C（可能导致临床上明显的肝损伤）。

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妊娠和哺乳期影响
◉ 哺乳期用药概述
目前尚无关于瑞博西尼在哺乳期临床应用的信息。由于瑞博西尼的蛋白结合率为70%，因此临床上重要的药物剂量可能会进入母乳。制造商建议在瑞博西尼治疗期间以及末次给药后至少3周内停止母乳喂养。
◉ 对母乳喂养婴儿的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。
◉ 对哺乳和母乳的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。

[1]. Molecular Pathways: Targeting the Cyclin D-CDK4/6 Axis for Cancer Treatment. Clin Cancer Res. 2015 Jul 1;21(13):2905-10.

[2]. Dual CDK4/CDK6 Inhibition Induces Cell-Cycle Arrest and Senescence in Neuroblastoma. Clin Cancer Res. 2013 Nov 15;19(22):6173-82.

癌细胞绕过正常的细胞周期调控机制，从而达到失调的增殖状态。视网膜母细胞瘤抑癌蛋白（pRb）调控着一个关键的细胞周期检查点，该检查点通常阻止G1期细胞在缺乏适当的促有丝分裂信号的情况下进入S期。癌细胞经常通过细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）4或CDK6与D型细胞周期蛋白的相互作用，对pRb进行组成型磷酸化并使其失活，从而克服pRb依赖的生长抑制。三种选择性CDK4/6抑制剂，即帕博西尼（Ibrance；辉瑞）、瑞博西尼（诺华）和阿贝西利（礼来），目前正处于针对多种pRb阳性肿瘤（包括乳腺癌、黑色素瘤、脂肪肉瘤和非小细胞肺癌）的不同研发阶段。迄今为止获得的积极临床数据最终证实了二十年前的假设，即细胞周期蛋白 D-CDK4/6 通路是癌症治疗的合理靶点。[1]

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目的：神经母细胞瘤是一种儿童癌症，持续造成严重的疾病和死亡。近期研究表明，多种细胞周期蛋白，特别是细胞周期蛋白D/CDK4/CDK6/RB网络中的蛋白，在神经母细胞瘤中发挥致癌作用，提示其治疗靶点可能改善患者预后。[2]
实验方法：我们使用高特异性CDK4/6抑制剂LEE011（诺华肿瘤）评估了双重CDK4/CDK6抑制对神经母细胞瘤细胞活力的影响。[2]
结果：LEE011处理显著降低了17株人神经母细胞瘤细胞系中12株的增殖，其作用机制是通过纳摩尔浓度诱导细胞停滞（敏感细胞系的平均IC50 = 307 ± 68 nmol/L）。LEE011导致细胞周期阻滞和细胞衰老，这分别归因于磷酸化RB和FOXM1的剂量依赖性降低。此外，神经母细胞瘤异种移植瘤对 LEE011 的反应性也转化到了体内，体外 IC50 值与皮下异种移植瘤生长延迟程度呈正相关。尽管我们的数据表明，对 LEE011 敏感的神经母细胞瘤更可能存在 MYCN 基因组扩增（P = 0.01），但鉴定其他临床可用的生物标志物仍然至关重要。[2]
结论：综上所述，我们的数据表明 LEE011 在大部分神经母细胞瘤细胞系和异种移植瘤模型中具有活性，并支持将该 CDK4/6 抑制剂开发为治疗该疾病患者的临床疗法。Clin Cancer Res; 19(22); 6173-82. ©2013 AACR.[2]

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LEE011是由诺华肿瘤公司开发的一种口服生物利用度高的小分子CDK4和CDK6抑制剂。
该研究支持CDK4/6抑制剂在神经母细胞瘤中的临床开发，尤其适用于MYCN扩增的肿瘤。
CDK4/6抑制主要诱导细胞抑制效应（G1期阻滞和衰老），提示其可能用于维持治疗，而非与S期细胞毒性药物联合使用。[2]

C₂₇H₃₈N₈O₆

570.64

570.291

1374639-79-8

Ribociclib;1211441-98-3;Ribociclib hydrochloride;1211443-80-9;Ribociclib-d6 hydrochloride;Ribociclib succinate;1374639-75-4

127255617

White to yellow solid

167Ų

5

12

8

41

728

0

O=C(C1=CC2=CN=C(NC3C=CC(=CN=3)N3CCNCC3)N=C2N1C1CCCC1)N(C)C.OC(CCC(=O)O)=O.O

PZJOFPMHNJJJSC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H30N8O.C4H6O4.H2O/c1-29(2)22(32)19-13-16-14-26-23(28-21(16)31(19)17-5-3-4-6-17)27-20-8-7-18(15-25-20)30-11-9-24-10-12-30;5-3(6)1-2-4(7)8;/h7-8,13-15,17,24H,3-6,9-12H2,1-2H3,(H,25,26,27,28);1-2H2,(H,5,6)(H,7,8);1H2

butanedioic acid;7-cyclopentyl-N,N-dimethyl-2-[(5-piperazin-1-ylpyridin-2-yl)amino]pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-6-carboxamide;hydrate

LEE011 succinate hydrate; LEE-011 succinate; LEE 011 succinate; trade name: Kisqali; LEE011 (succinate hydrate); butanedioic acid;7-cyclopentyl-N,N-dimethyl-2-[(5-piperazin-1-ylpyridin-2-yl)amino]pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-6-carboxamide;hydrate; A926275; (E)-7-cyclopentyl-N,N-dimethyl-2-((5-(piperazin-1-yl)pyridin-2-yl)imino)-3,7-dihydro-2H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-6-carboxamide succinate hydrate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (Infinity mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (Infinity mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (Infinity mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。