RO-5963

MDM2 and MDMX (dual inhibitor). IC50 values: p53-MDM2 binding inhibition ~17 nM (comparable to nutlin-3a at ~19 nM); p53-MDMX binding inhibition ~24 nM (approximately 400-fold more potent than nutlin-3a, which has IC50 ~9 μM) [1].
MDM2 (IC50 = 17 nM), MDMX (IC50 = 24 nM) [1]

体外实验：RO-5963（10 或 20 μM）可渗透过表达 MDMX 的 MCF7 乳腺癌细胞，稳定 p53，并以剂量依赖的方式提高 p53 转录靶标 p21 和 MDM2 的蛋白水平。p21 和 MDM2 蛋白水平的升高归因于其转录的诱导，这可由其 mRNA 以及另外两个 p53 转录靶标 MIC-1 和 BAX 的 mRNA 水平的剂量依赖性升高来证实，但 MDMX（不受 p53 调控）的 mRNA 水平未受影响 [1]。
MCF7 细胞的免疫沉淀实验表明，RO-5963（10 或 20 μM，处理 4 小时）可破坏 p53-MDM2 和 p53-MDMX 的相互作用。在 20 μM 浓度下，RO-5963 对 p53-MDM2 结合的抑制作用与 10 μM 的 nutlin-3a 相当，并且在 10 μM 和 20 μM 浓度下均能有效阻断 p53-MDMX 的结合。Nutlin-3a 对 p53-MDMX 的相互作用没有影响。免疫沉淀的 MDMX 下拉出的 MDMX 和 MDM2 蛋白显著增加，这与 RO-5963 诱导的 MDMX/MDMX 和 MDMX/MDM2 二聚体的形成相一致 [1]。在三种野生型 p53 癌细胞系（MCF7、HCT116 和 RKO）的细胞活力检测中，RO-5963 的 EC50 值比在突变型 p53 细胞系（SW480 和 MDA-MB-435）中低约 10 倍。 RO-5963 并未增加 p53 Ser15 的磷酸化水平，表明 p53 的激活并非由基因毒性应激引起 [1]。在 G401 和 H460 细胞中，RO-5963 呈剂量依赖性地增加 p53、MDM2 和 p21 的水平，而仅略微降低 MDMX 的水平。重要的是，RO-5963 能够保护 MDMX 免受 nutlin 诱导的 MDM2 降解。在 11 种野生型 p53 实体瘤细胞系（乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌、骨肉瘤、黑色素瘤）中，RO-5963 有效激活了 p53，并提高了 p21 和 MDM2 的水平 [1]。细胞周期分析显示，RO-5963 能有效阻滞指数增长的癌细胞于 G1 期和 G2 期，从而有效耗竭 S 期细胞。在利用SJSA-V（亲代细胞）和SJSA-X（MDMX过表达细胞）进行的细胞凋亡检测中，RO-5963在两种细胞系中均显示出强烈的Annexin V信号，而nutlin-3a在SJSA-X细胞中几乎没有活性。RO-5963的凋亡活性呈剂量依赖性，且与nutlin-3a联合使用时活性增强。 SJSA-X细胞裂解液的Western blotting结果显示，20 μM RO-5963诱导的p53积累与10 μM nutlin-3a相当，但RO-5963处理组的p21和MDM2水平更高，表明双重抑制增强了转录活性[1]。在MDMX/MDM2比例不同的乳腺癌细胞系（MCF7高MDMX，ZR75-30中等MDMX，ZR75-1低MDMX）中，RO-5963（20 μM）在MCF7和ZR75-30细胞中显示出比nutlin-3a更高的凋亡活性。在九种野生型p53癌细胞系中，RO-5963在9种细胞系中的4种（H460、RKO、LS174T、AGS）中表现出比nutlin-3a更强的凋亡活性，这与相对较高的MDMX水平相关[1]。在MCF7和ZR75-30细胞系中，RO-5963（10–20 μM；48小时）表现出比Nutlin更强的凋亡活性[1]。RO-5963（10 μM，24小时）能有效激活p53并提高p21和MDM2的水平[1]。在时间分辨FRET结合实验中，RO-5963抑制p53与MDM2和MDMX的结合，IC50值分别为17 nM和24 nM。 [1]
- 在MCF7乳腺癌细胞中，RO-5963以剂量依赖的方式稳定p53，并增加其转录靶标p21和MDM2的蛋白水平。[1]
- RO-5963诱导p53转录活性，表现为MCF7细胞中p21、MDM2、MIC-1和BAX的mRNA水平升高。[1]
- RO-5963破坏MCF7细胞中p53-MDM2和p53-MDMX的相互作用，免疫沉淀和Western印迹实验证实了这一点。[1]
- RO-5963激活多种表达野生型p53的癌细胞系中的p53信号通路，包括MCF7、HCT116、RKO、LNCaP、U2OS、A498、22Rv1、H460、LOX、A549和G401。 [1] RO-5963 可诱导癌细胞发生 G1 期和 G2 期细胞周期阻滞。[1] RO-5963 可诱导癌细胞凋亡，包括 MDMX 过表达的 SJSA-X 和 MCF7 细胞。[1] RO-5963 可保护 G401 和 H460 细胞中的 MDMX 免受 MDM2 介导的降解。[1]

酶活性测定：采用时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）结合实验和荧光猝灭实验评估了MDM2-p53和MDMX-p53的结合情况。对于RO-2443（RO-5963的母体化合物），进行了等温滴定量热法（ITC）分析，结果显示其结合常数（Kd = 78 nM）主要由熵成分决定，这与疏水相互作用为主的结合模式相符。利用¹⁵N标记的人源化斑马鱼MDMX进行核磁共振（NMR）波谱分析表明，RO-2443与p53口袋结合，Y63的化学位移显著向高场移动，这与芳香基团的屏蔽作用一致。尺寸排阻色谱-静态光散射 (SEC-SLS) 分析表明，RO-2443 可诱导 MDMX 二聚体形成，复合物的质量计算为 24.1 kDa（理论单体质量为 12.3 kDa）[1]。
MDMX 与 RO-2443 结合的晶体结构（分辨率为 1.8 Å）显示，其以二聚体形式存在，核心包含两个抑制剂分子，每个分子均与两个蛋白质单体相互作用。吲哚基-乙内酰脲部分占据其中一个单体的 Phe 口袋，而二氟苯基则延伸至另一个单体的 Trp 口袋，两个吲哚基-乙内酰脲基团之间存在广泛的芳香堆积相互作用（3.3-3.7 Å）[1]。

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采用时间分辨 FRET 结合实验评估了 p53-MDM2 和 p53-MDMX 的结合抑制情况。 [1]
- 通过等温量热法测定了 RO-2443（RO-5963 的前体）与 MDMX 的结合亲和力，结果显示 Kd 为 78 nM。[1]
- 采用核磁共振波谱法研究了 RO-2443 与 MDMX 的结合，结果表明 RO-2443 结合于 p53 口袋并形成二聚体。[1]
- 采用尺寸排阻色谱-静态光散射法证实了 MDMX 与 RO-2443 结合后形成二聚体。[1]
- 采用色氨酸荧光猝灭动力学分析研究了结合化学计量比和二聚体形成。[1]

细胞检测：采用MTT法和CellTiter-Glo法评估细胞增殖/活力。对于剂量反应曲线，将细胞与RO-5963系列稀释液孵育5天，细胞活力以对照组的百分比±标准差表示[1]。对于Western blotting，将对数生长期细胞与RO-5963孵育24小时（或按指定时间），制备细胞裂解液，并使用特异性抗体检测p53、p21、MDM2、MDMX和磷酸化p53（Ser15）的蛋白水平。在联合用药研究中，将细胞与 RO-5963 孵育，并分别加入或不加入 10 μM nutlin-3a [1]。
在免疫沉淀实验中，将 MCF7 细胞与 10 μM nutlin-3a 或 10/20 μM RO-5963 孵育 4 小时。使用抗 MDMX 或抗 p53 抗体对蛋白复合物进行免疫沉淀，并通过蛋白质印迹法检测 p53、MDM2 和 MDMX 的表达水平 [1]。
在细胞凋亡检测中，将细胞与化合物孵育 48 小时，并通过 Annexin V 法检测凋亡细胞的百分比。对于细胞周期分析，用化合物处理指数生长期细胞，并通过流式细胞术分析细胞周期分布[1]。
对于基因表达分析（qPCR），用RO-5963处理MCF7细胞24小时，提取RNA，并通过实时PCR定量p53靶基因（p21、MDM2、MIC-1、BAX）和MDMX的mRNA水平[1]。

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细胞凋亡分析[1]
细胞类型：ZR75-30、MCF7细胞
测试浓度：10、20 μM
孵育时间：48小时
实验结果：显示出强烈的细胞凋亡活性。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： LNCap、U2OS、RKO、A489、22Rv1、HCT116、H460、LOX、MCF7、A549、G401 细胞
测试浓度： 10 μM
孵育时间： 24 小时
实验结果： 有效激活 p53 并提高 p21 和 MDM2 水平。

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使用 MTT 和 CellTiter-Glo 法评估细胞增殖/活力。[1]
- 处理 48 小时后，使用 Annexin V 法检测细胞凋亡。[1]
- 使用流式细胞术进行细胞周期分析。 [1]
- 采用蛋白质印迹法分析p53、p-p53 (Ser15)、p21、MDM2、MDMX和肌动蛋白的蛋白水平。[1]
- 采用免疫沉淀法评估细胞内p53-MDM2和p53-MDMX的相互作用。[1]
- 采用定量PCR法检测p53靶基因的mRNA水平。[1]

RO-5963 是 RO-2443 的类似物，其效力略有提高，但溶解度显著改善。RO-2443 在体外显示出强效的 MDM2/MDMX 抑制活性，但其水溶性差，无法对其细胞活性进行有效评估。目前尚未报道 RO-5963 的具体药代动力学数据（吸收、分布、代谢、排泄、半衰期、口服生物利用度）[1]。

该化合物不增加p53 Ser15磷酸化，表明p53激活不是由基因毒性应激引起的，提示其具有非基因毒性作用机制 [1]。

[1]. Activation of the p53 pathway by small-molecule-induced MDM2 and MDMX dimerization. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jul 17;109(29):11788-93.

RO-5963 是一种双重 MDM2/MDMX 抑制剂，属于吲哚乙内酰脲类化合物，通过高通量筛选获得。与溶解度较差的母体化合物 RO-2443 不同，RO-5963 的溶解度显著提高，便于进行细胞活性评估。该化合物通过与 MDM2 和 MDMX 的 N 端 p53 结合域结合，诱导二者二聚化，这种机制在小分子抑制剂中尚属首次报道。MDMX 与母体化合物 RO-2443 的晶体结构显示，两个抑制剂分子介导二聚体的形成，每个抑制剂以“握手”构象与两个蛋白单体结合。 RO-5963 能够克服 MDMX 过表达癌细胞对选择性 MDM2 拮抗剂（例如 nutlin-3a）的耐药性，使其成为治疗 MDMX 扩增型癌症（约占乳腺癌、结肠癌和肺癌的 19%）的潜在先导化合物。这种双重抑制剂能够恢复 p53 转录活性，并在 nutlin-3a 无效的 MDMX 过表达细胞系中诱导细胞凋亡 [1]。

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RO-5963 是一种 MDM2/MDMX 双重拮抗剂，可诱导 MDM2 和 MDMX 二聚化，从而阻断其 p53 结合口袋。[1]
- 它能够克服 MDMX 过表达癌细胞对 MDM2 特异性抑制剂（例如 nutlin-3a）的耐药性。[1]
- RO-5963 不会诱导基因毒性应激，这由 p53 Ser15 磷酸化缺失所证实。 [1]
- 它代表了一种有前景的治疗策略，可用于治疗MDMX扩增的癌症，例如乳腺癌、结肠癌和肺癌。[1]

C24H21CLF2N4O5

518.897151708603

518.116

C, 55.55; H, 4.08; Cl, 6.83; F, 7.32; N, 10.80; O, 15.42

1416663-77-8

136209736

Light yellow to yellow solid powder

1.4

135

5

8

7

36

959

0

CC1=C(C=CC\2=C1N=C/C2=C\C3=C(N(C(=O)N3)C(C4=CC(=C(C=C4)F)F)C(=O)NC(CO)CO)O)Cl

IFYMUYSGUSHEPI-NTUHNPAUSA-N

InChI=1S/C24H21ClF2N4O5/c1-11-16(25)4-3-15-13(8-28-20(11)15)7-19-23(35)31(24(36)30-19)21(22(34)29-14(9-32)10-33)12-2-5-17(26)18(27)6-12/h2-8,14,21,32-33,35H,9-10H2,1H3,(H,29,34)(H,30,36)/b13-7+

2-[5-[(Z)-(6-chloro-7-methylindol-3-ylidene)methyl]-4-hydroxy-2-oxo-1H-imidazol-3-yl]-2-(3,4-difluorophenyl)-N-(1,3-dihydroxypropan-2-yl)acetamide

RO-5963; RO5963; RO 5963

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~150 mg/mL (~289.07 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 3.75 mg/mL (7.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 37.5 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL 生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 3.75 mg/mL (7.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 37.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。