4'-Chlorodiazepam (Ro 5-4864)

TSPO/mitochondrial translocator protein

在 SHSY-5Y 神经母细胞瘤细胞中，4'-氯地西泮具有针对淀粉样蛋白-β (Aβ) 的神经保护特性。在器官型海马制剂中，Aβ 会降低细胞活力，但剂量为 100nM 和 1000nM 的 4'-氯地西泮具有神经保护作用。超氧化物歧化酶 (SOD) 表达的上调与 4'-氯地西泮对 Aβ 的神经保护作用有关 [1]。在葡萄糖剥夺的细胞中，4'-氯扎西泮可减少核碎裂并维持细胞活力。在用 4'-氯地西泮处理的细胞中，这些效应伴随着自由基形成的减少和线粒体功能的保存 [2]。

转运蛋白（TSPO）是一种线粒体外膜蛋白，参与胆固醇向线粒体的转运，这是合成类固醇激素的第一步，也是调节线粒体通透性转换孔打开和凋亡的第一步。研究表明，TSPO的激活可能会促进神经退行性变和脑损伤实验模型中的神经保护作用。在之前的一项研究中，我们小组表明，TSPO配体4'-氯二氮卓（4'-CD）对SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞中的淀粉样蛋白β（aβ）具有神经保护作用。本研究旨在评估4'-CD是否也对器官型海马培养物中的Aβ具有神经保护作用，并确定其作用机制。Aβ降低了器官型海马培养物的细胞活力，而4'-CD在100nM和1000nM的剂量下具有神经保护作用。4'-CD对Aβ的神经保护作用与超氧化物歧化酶（SOD）表达的增加有关。过氧化氢酶、胶质纤维酸性蛋白、Akt和前天冬氨酸蛋白酶-3的表达没有差异。总之，我们的研究结果表明，4'-CD通过调节SOD蛋白表达的机制对Aβ具有神经保护作用[1]。

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转运蛋白（TSPO），以前称为外周型苯二氮卓受体（PBR），被认为是类固醇生成的重要调节因子，也是神经系统疾病的潜在治疗靶点。先前的证据表明，TSPO配体可以在损伤过程中保护细胞，防止中枢神经系统（CNS）细胞凋亡。然而，其在代谢损伤下对星形胶质细胞的作用尚不清楚。在这项研究中，我们探讨了TSPO配体4'-氯二氮卓（Ro5-4864）是否可以在葡萄糖剥夺下保护星形胶质细胞线粒体。我们的结果表明，4'-氯地西泮保留了细胞活力，并减少了葡萄糖缺乏细胞的核碎裂。这些影响伴随着用4'-氯地西泮处理的细胞中自由基的产生减少和线粒体功能的维持。最后，我们的研究结果表明，TSPO可能通过保护暴露于葡萄糖戒断的星形胶质细胞中的线粒体功能来参与减少氧化应激[2]。

[1]. B D Arbo, et al. 4'-Chlorodiazepam is neuroprotective against amyloid-beta in organotypic hippocampal cultures. J Steroid Biochem Mol Biol. 2017 Jul;171:281-287.
[2]. Eliana Baez, et al. 4'-Chlorodiazepam Protects Mitochondria in T98G Astrocyte Cell Line from Glucose Deprivation. Neurotox Res. 2017 Aug;32(2):163-171.

作用机制
从大鼠脑中分离出的线粒体被发现能够裂解胆固醇，产生孕烯醇酮（激素类固醇的前体），平均速率为 21.0 pmol 孕烯醇酮·mg 蛋白·min-1。类固醇生成的这一限速步骤可被 PK 11195（1-(2-氯苯基)-N-甲基-(1-甲基丙基)-3-异喹啉甲酰胺）和 Ro5 4864（4'-氯二氮卓）显著刺激，这两种配体均能以高亲和力与外周苯二氮卓受体结合。低亲和力外周苯二氮卓受体配体，例如 Ro15 1788（乙基-8-氟-5,6-二氢-5-甲基-6-氧代-4H-咪唑并[1,5α][1,4]苯并-3-羧酸酯）和氯硝西泮，对孕烯醇酮的合成速率没有显著影响。此外，这些化合物作为 [3H]Ro5 4864 结合抑制剂的效力排序与类固醇生成的效力排序一致。由于 86 个氨基酸的肽类地西泮结合抑制剂也被认为能与外周苯二氮卓受体结合，因此还评估了该肽的四个片段、一个随机序列和一个类固醇生成激活肽与外周苯二氮卓受体相互作用以及刺激大鼠脑线粒体类固醇生成的能力。类固醇生成激活肽和地西泮结合抑制剂的两个片段显著刺激了孕烯醇酮的生物合成。与外周苯二氮卓受体配体不同，未观察到肽取代[3H]Ro5 4864结合的效力与类固醇生成之间存在相关性。
外周苯二氮卓受体介导类固醇生成组织中线粒体外膜和内膜之间的胆固醇转运。它们也存在于包括肝脏在内的许多其他组织中。我们研究了外周苯二氮卓受体配体PK11195 [1-(2-氯苯基)-N-甲基-N-(1-甲基丙基)异喹啉-3-羧酰胺]、Ro 5-4864（4-氯二氮卓）、血红素、原卟啉IX和N-甲基原卟啉IX对大鼠肝脏线粒体膜间胆固醇转运的影响。PK11195和N-甲基原卟啉IX显著增加了内源性胆固醇从线粒体外膜向内膜的转运（浓度为1 μM时分别增加140%和150%，P<0.01）。5 μM原卟啉IX、1 μM Ro 5-4864和5 μM血红素均无此作用。当用外源性[4-14C]胆固醇标记线粒体时，PK11195和N-甲基原卟啉IX在增加总胆固醇掺入和胆固醇转运至内膜方面最为有效，且其作用呈剂量依赖性。这些数据表明，在肝脏中，与外周苯二氮卓受体的结合与胆固醇转运相关，配体与这些受体的相互作用可能在肝脏线粒体膜间胆固醇转运的复杂调控机制中发挥作用。
在卵巢切除的大鼠离体子宫中，研究了各种苯二氮卓类药物的作用。这些子宫已预先长期接受不同的雌性激素（雌激素、孕激素和雌激素+孕激素）处理。所有组别的子宫均表现出自发的节律性活动。在对照组子宫中观察到的自发活动可被地西泮、4'-氯地西泮、氯硝西泮或1-(2-氯苯基)-N-甲基-N-(1-甲基丙基)-3-异喹啉甲酰胺 (PK 11195) 以浓度依赖的方式抑制，或在无[Ca2+]o溶液中完全消失。地西泮、4'-氯地西泮、氯硝西泮和PK 11195均能以浓度依赖的方式舒张预先用[K+]o收缩的子宫，其效力顺序为：PK 11195 > 4'-氯地西泮 > 地西泮 > 氯硝西泮。给予[Ca2+]o（1 μM至10 mM）可引起浸浴于不同预处理组所制备的无[Ca2+]o生理盐溶液中的子宫浓度依赖性收缩。用不同浓度（μM）的地西泮、4'-氯地西泮、氯硝西泮和PK 11195孵育后，所有组别的大鼠子宫对胞外钙离子浓度（[Ca2+]o）诱导的收缩反应均降低。这些结果表明，大鼠子宫内存在微摩尔级的苯二氮卓类药物结合位点。地西泮、4'-氯地西泮、氯硝西泮和PK 11195均可使预收缩的大鼠子宫舒张，这种作用可能与抑制胞外钙离子浓度（[Ca2+]o）内流有关。本研究中观察到的不同苯二氮卓类药物的舒张作用可被不同雌激素的预处理所调节。
本研究还测定了非典型苯二氮卓类药物4'-氯地西泮（Ro 5-4864）与功能性表达的人GABAA受体cDNA的相互作用。人α2、β1和γ2亚基的共转染能够重建4'-氯二氮卓的识别位点，这表现为t-[35S]丁基双环磷酸硫酯（[35S]-TBPS）与GABA激活的氯离子通道结合的剂量依赖性增强。该位点存在于GABA_A受体复合物上，该复合物包含GABA激动剂样苯二氮卓类药物和神经活性类固醇的结合位点。α亚基的重要性进一步得到证实，因为在相同的实验条件下，用α1或α3亚基替代α2亚基并不能重建能够调节[35S]TBPS结合的4'-氯二氮卓识别位点。 4'-氯二氮卓的调节位点与苯二氮卓类药物的调节位点不同，但苯基喹啉类化合物PK 8165和PK 9084产生的作用与4'-氯二氮卓相似，这与之前对脑匀浆中4'-氯二氮卓位点的分析结果一致。对亚基需求的进一步分析表明，仅α2和β1亚基的共表达即可重建4'-氯二氮卓的识别位点。然而，有趣的是，研究发现4'-氯二氮卓位点能够抑制[35S]TBPS与GABA激活的氯离子通道的结合。因此，4'-氯二氮卓位点可能仅由α和β亚基即可重建。
有关4-氯二氮卓（共6种）作用机制的更多完整数据，请访问HSDB记录页面。

C16H12CL2N2O

319.185

318.033

C, 60.21; H, 3.79; Cl, 22.21; N, 8.78; O, 5.01

14439-61-3

1688

Typically exists as white to light yellow solids at room temperature

1.35g/cm3

517.1ºC at 760mmHg

160-163ºC

266.6ºC

8.43E-11mmHg at 25°C

1.647

3.307

32.67

0

2

1

21

432

0

ClC1C([H])=C([H])C2=C(C=1[H])C(C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])Cl)=NC([H])([H])C(N2C([H])([H])[H])=O

PUMYFTJOWAJIKF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H12Cl2N2O/c1-20-14-7-6-12(18)8-13(14)16(19-9-15(20)21)10-2-4-11(17)5-3-10/h2-8H,9H2,1H3

7-chloro-5-(4-chlorophenyl)-1-methyl-3H-1,4-benzodiazepin-2-one

RO-5-4864; RO 5-4864; Chlordiazepam; RO5-4864; 4-Chlorodiazepam; Ro 5-4864; 2H-1,4-Benzodiazepin-2-one, 7-chloro-5-(4-chlorophenyl)-1,3-dihydro-1-methyl-; Ro-05-4864; RO5-4864

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~313.29 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。