4'-Chlorodiazepam (Ro 5-4864)

TSPO/mitochondrial translocator protein
4'-Chlorodiazepam specifically targets the mitochondrial translocator protein 18 kDa (TSPO). TSPO is a protein located on the outer mitochondrial membrane and is involved in various functions, including cholesterol transport, steroidogenesis, and the regulation of apoptosis. By binding to TSPO, 4'-Chlorodiazepam modulates mitochondrial function. It does not bind to the central benzodiazepine site on GABA(A) receptors, which is the target of classical benzodiazepines like Diazepam. This distinct target is the basis for its unique pharmacological profile.

在SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞中，4'-氯氮卓具有对抗β-淀粉样蛋白（Aβ）的神经保护作用。在类器官海马制备物中，Aβ会降低细胞活力，但4'-氯氮卓在100 nM和1000 nM剂量下具有神经保护作用。超氧化物歧化酶（SOD）表达的上调与4'-氯氮卓对Aβ的神经保护作用相关[1]。在葡萄糖剥夺的细胞中，4'-氯氮卓可减少核碎片化并维持细胞活力。在用4'-氯氮卓处理的细胞中，这些作用伴随着自由基生成减少和线粒体功能的维持[2]。体外实验表明，4'-氯氮卓具有神经保护作用。该化合物对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞和器官型海马培养物中的β-淀粉样蛋白（Aβ）具有神经保护作用。在100 nM和1000 nM的浓度下，该化合物均具有神经保护作用。这些作用与超氧化物歧化酶（SOD）表达的增加有关。此外，该化合物还能维持葡萄糖缺乏细胞的活力，减少细胞核碎裂，同时减少自由基的产生并维持线粒体功能。

体内研究表明，4'-氯地西泮在动物模型中具有神经保护作用，但相关综述并未详细说明具体实验方案。其活性归因于其与TSPO的相互作用，TSPO能够调节线粒体功能并降低氧化应激。通过维持线粒体功能和减少自由基的产生，4'-氯地西泮可以保护神经元免受多种损伤，包括β-淀粉样蛋白毒性和葡萄糖缺乏。这些发现提示其具有治疗神经退行性疾病的潜力。

无细胞结合试验用于表征4'-氯地西泮与TSPO的亲和力。放射性配体结合试验是一种标准方法。从富含TSPO的组织（例如肾脏或脑组织（非神经元细胞））中制备膜。将这些膜与放射性标记的TSPO配体（例如[3H]-PK11195）和不同浓度的4'-氯地西泮一起孵育。孵育后，通过过滤分离结合的和游离的放射性配体，并测量放射性。计算能置换50%放射性配体的4'-氯地西泮浓度（IC50）。其对TSPO的高亲和力已得到充分证实。

转位蛋白（TSPO）是一种线粒体外膜蛋白，参与胆固醇向线粒体的转运，这是合成类固醇激素的第一步，同时还参与线粒体通透性转换孔的开放和细胞凋亡的调控。研究表明，TSPO的激活可能在神经退行性疾病和脑损伤的实验模型中发挥神经保护作用。我们课题组之前的研究表明，TSPO配体4'-氯二氮卓（4'-CD）对SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞中的β-淀粉样蛋白（Aβ）具有神经保护作用。本研究旨在评估4'-CD是否也对器官型海马培养物中的Aβ具有神经保护作用，并阐明其作用机制。 Aβ降低了器官型海马培养物的细胞活力，而4'-CD在100 nM和1000 nM浓度下均具有神经保护作用。4'-CD对Aβ的神经保护作用与超氧化物歧化酶（SOD）表达增加相关。过氧化氢酶、胶质纤维酸性蛋白、Akt和procaspase-3的表达未见差异。总之，我们的结果表明，4'-CD通过调节SOD蛋白表达的机制发挥对Aβ的神经保护作用[1]。

---

转位蛋白（TSPO），曾被称为外周型苯二氮卓受体（PBR），被认为是类固醇生成的重要调节因子，也是神经系统疾病的潜在治疗靶点。既往证据表明，TSPO配体可在损伤期间保护细胞并防止中枢神经系统（CNS）细胞凋亡。然而，其在代谢损伤下对星形胶质细胞的作用机制尚不清楚。本研究探讨了TSPO配体4'-氯二氮卓（Ro5-4864）是否能在葡萄糖剥夺条件下保护星形胶质细胞线粒体。结果表明，4'-氯二氮卓能够维持葡萄糖剥夺细胞的活力并减少细胞核碎片化。这些作用伴随着自由基生成减少和线粒体功能维持。最终，我们的研究结果提示，TSPO可能通过维持暴露于葡萄糖剥夺的星形胶质细胞的线粒体功能来降低氧化应激[2]。

---

体外细胞实验用于研究4'-氯二氮卓的神经保护作用。实验中使用的神经元细胞系包括SH-SY5Y（神经母细胞瘤）或原代神经元培养物。细胞暴露于应激源，例如β-淀粉样蛋白（Aβ）肽或葡萄糖缺乏，这些应激源会诱导细胞死亡。随后，用不同浓度的4'-氯二氮卓（例如100 nM和1000 nM）处理细胞。使用MTT或LDH释放等方法检测细胞活力。还可以评估氧化应激和线粒体功能的标志物，例如活性氧（ROS）的产生和线粒体膜电位。

4'-氯地西泮的体内动物实验将采用神经退行性疾病或脑损伤模型。例如，在阿尔茨海默病模型中，可对该化合物进行治疗，并评估其对认知功能、淀粉样斑块负荷和神经元丢失的影响。在中风或创伤性脑损伤模型中，可通过测量梗死面积或神经功能缺损评分来评估该化合物的神经保护作用。现有综述中并未详细介绍4'-氯地西泮的具体实验方案，但其神经保护特性已被研究。

4'-氯二氮卓（一种苯二氮卓类衍生物）的药代动力学（PK）数据对其研发至关重要。然而，现有文献中并未提供具体的PK参数（例如口服生物利用度、半衰期、代谢）。作为一种亲脂性化合物，它很可能穿过血脑屏障。通常情况下，4'-氯二氮卓以粉末形式储存于-20°C，可保存长达三年；或以溶液形式储存于-80°C，可保存六个月。

公开文献中未详细列出4'-氯二氮卓的毒理学数据。作为一种TSPO配体，其毒性特征与其潜在的治疗用途相关。然而，目前尚无具体的LD50、器官毒性或遗传毒性数据。该药物仅供研究用途，不适用于人类治疗。

[1]. B D Arbo, et al. 4'-Chlorodiazepam is neuroprotective against amyloid-beta in organotypic hippocampal cultures. J Steroid Biochem Mol Biol. 2017 Jul;171:281-287.
[2]. Eliana Baez, et al. 4'-Chlorodiazepam Protects Mitochondria in T98G Astrocyte Cell Line from Glucose Deprivation. Neurotox Res. 2017 Aug;32(2):163-171.

作用机制
从大鼠脑中分离出的线粒体被发现能够裂解胆固醇，产生孕烯醇酮（一种类固醇激素的前体），平均速率为 21.0 pmol 孕烯醇酮·mg 蛋白·min⁻¹。类固醇合成的这一限速步骤可被 PK 11195（1-(2-氯苯基)-N-甲基-(1-甲基丙基)-3-异喹啉甲酰胺）和 Ro5 4864（4'-氯二氮卓）显著刺激，这两种药物均能以高亲和力与外周苯二氮卓受体结合。低亲和力外周苯二氮卓受体配体，例如 Ro15 1788（乙基-8-氟-5,6-二氢-5-甲基-6-氧代-4H-咪唑并[1,5α][1,4]苯并-3-羧酸酯）和氯硝西泮，对孕烯醇酮的合成速率没有显著影响。此外，这些化合物作为 [3H]Ro5 4864 结合抑制剂的效力排序与其在类固醇生成中的效力排序一致。由于 86 个氨基酸的肽类地西泮结合抑制剂也被认为能与外周苯二氮卓受体结合，因此还评估了该肽的四个片段、一个随机序列和一个类固醇生成激活肽与外周苯二氮卓受体相互作用并刺激大鼠脑线粒体类固醇生成的能力。类固醇生成激活肽和地西泮结合抑制剂的两个片段显著刺激了孕烯醇酮的生物合成。与外周苯二氮卓受体配体不同，肽取代的[3H]Ro5 4864结合效力与类固醇生成之间未观察到相关性。外周苯二氮卓受体介导类固醇生成组织中线粒体外膜和内膜之间的胆固醇转运。它们也存在于包括肝脏在内的许多其他组织中。我们研究了外周苯二氮卓受体配体PK11195 [1-(2-氯苯基)-N-甲基-N-(1-甲基丙基)异喹啉-3-甲酰胺]、Ro 5-4864（4-氯二氮卓）、血红素、原卟啉IX和N-甲基原卟啉IX对大鼠肝线粒体内膜胆固醇转运的影响。 PK11195 和 N-甲基原卟啉 IX 显著增加了内源性胆固醇从线粒体外膜向内膜的转运（浓度为 1 μM 时分别增加 140% 和 150%，P < 0.01）。5 μM 原卟啉 IX、1 μM Ro 5-4864 和 5 μM 血红素则没有这种作用。当线粒体用外源性 [4-14C] 胆固醇标记时，PK11195 和 N-甲基原卟啉 IX 在增加总胆固醇掺入和胆固醇向内膜的转运方面最为有效，且其作用呈剂量依赖性。这些数据表明，在肝脏中，与外周苯二氮卓受体的结合与胆固醇转运相关，配体与这些受体之间的相互作用可能在肝脏线粒体膜间胆固醇转运的复杂调控机制中发挥作用。本研究探讨了多种苯二氮卓类药物对卵巢切除大鼠离体子宫的影响。这些子宫预先用不同雌激素组（雌激素、孕激素和雌激素+孕激素）处理较长时间。所有组别的子宫均表现出自发节律性活动。地西泮、4'-氯二氮卓、氯硝西泮或1-(2-氯苯基)-N-甲基-N-(1-甲基丙基)-3-异喹啉甲酰胺（PK 11195）均能浓度依赖性地抑制对照组子宫的自发节律性活动，而无[Ca2+]O溶液则可使该活动完全消失。地西泮、4'-氯地西泮、氯硝西泮和PK 11195在用[K+]o预收缩后均能以浓度依赖的方式扩张子宫，其效力顺序为：PK 11195 > 4'-氯地西泮 > 地西泮 > 氯硝西泮。在不同预处理组中制备的不含[Ca2+]o的生理盐水中，给予[Ca2+]o（1 μM至10 mM）可诱导子宫浓度依赖性收缩。在所有组中，用不同浓度（μM）的地西泮、4'-氯地西泮、氯硝西泮和PK 11195孵育均可降低大鼠子宫对细胞外钙离子浓度([Ca2+]o)的收缩反应。这些结果表明大鼠子宫中存在微摩尔级的苯二氮卓类药物结合位点。地西泮、4'-氯地西泮、氯硝西泮和PK 11195均能诱导预收缩大鼠的子宫松弛，这种作用可能与抑制细胞外钙离子内流([Ca2+]o)有关。本研究中观察到的不同苯二氮卓类药物的血管舒张作用可被不同雌激素的预处理所调节。本研究还确定了非典型苯二氮卓类药物4'-氯地西泮(Ro 5-4864)与功能性表达的人GABAA受体cDNA之间的相互作用。人α2、β1和γ2亚基的共转染重建了4'-氯地西泮的识别位点，表现为t-[35S]丁基双环硫代磷酸酯([35S]-TBPS)与GABA激活的氯离子通道结合的剂量依赖性增强。该位点位于GABA_A受体复合物上，该复合物包含GABA激动剂样苯二氮卓类药物和神经活性类固醇的结合位点。α亚基的重要性得到了进一步证实，因为在相同的实验条件下，用α1或α3亚基替换α2亚基并不能重建调节[³⁵S]TBPS结合的4'-氯二氮卓识别位点。4'-氯二氮卓的调节位点与苯二氮卓类药物的调节位点不同，但苯基喹啉类化合物PK 8165和PK 9084的作用与4'-氯二氮卓相似，这与先前对脑匀浆中4'-氯二氮卓位点的分析结果一致。对亚基需求的进一步分析表明，仅α2和β1亚基的共表达就足以重建4'-氯二氮卓识别位点。然而，有趣的是，该研究发现4'-氯二氮卓位点可以抑制[35S]TBPS与GABA激活的氯离子通道的结合。因此，4'-氯二氮卓位点可能仅由α和β亚基重建。有关六种4'-氯二氮卓类化合物作用机制的更完整数据，请访问HSDB记录页面。

---

4'-氯二氮卓（Ro 5-4864）是一种研究化合物，广泛用作研究线粒体转运蛋白（TSPO）功能的工具。它独特的性质是作为TSPO配体，但对GABA(A)受体没有亲和力，这使得它在区分TSPO介导的作用和经典苯二氮卓类药物的作用方面具有不可估量的价值。它已被研究用于阿尔茨海默病和其他神经系统疾病模型中的神经保护作用。它尚未获准用于临床。所有信息仅供研究参考，不可用于诊断或临床用途。

C16H12CL2N2O

319.185

318.033

C, 60.21; H, 3.79; Cl, 22.21; N, 8.78; O, 5.01

14439-61-3

1688

Typically exists as white to light yellow solids at room temperature

1.35g/cm3

517.1ºC at 760mmHg

160-163ºC

266.6ºC

8.43E-11mmHg at 25°C

1.647

3.307

32.67

0

2

1

21

432

0

ClC1C([H])=C([H])C2=C(C=1[H])C(C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])Cl)=NC([H])([H])C(N2C([H])([H])[H])=O

PUMYFTJOWAJIKF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H12Cl2N2O/c1-20-14-7-6-12(18)8-13(14)16(19-9-15(20)21)10-2-4-11(17)5-3-10/h2-8H,9H2,1H3

7-chloro-5-(4-chlorophenyl)-1-methyl-3H-1,4-benzodiazepin-2-one

RO-5-4864; RO 5-4864; Chlordiazepam; RO5-4864; 4-Chlorodiazepam; Ro 5-4864; 2H-1,4-Benzodiazepin-2-one, 7-chloro-5-(4-chlorophenyl)-1,3-dihydro-1-methyl-; Ro-05-4864; RO5-4864

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~313.29 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。