RO5166017 HCl

Trace amine-associated receptor 1 (TAAR1) (Ki = 1.9 nM, 2.7 nM, 31 nM and 24 nM)

当TAAR1在HEK293细胞中持续表达时，RO5166017对小鼠、肿瘤、食蟹猴和人TAAR1具有优异的功能活性和高亲和力。它还表现出对其他目标的高选择性[1]。
微量胺相关受体1 （TAAR1）被微量胺对酪胺和β-苯乙胺等氨基酸的内源性代谢物激活，已被证明是多巴胺能系统的重要调节剂，被认为是治疗神经精神疾病的有希望的靶点。为了破译TAAR1的脑功能，我们设计了一种选择性的TAAR1激动剂RO5166017。RO5166017对小鼠、大鼠、食食猴和人TAAR1具有高亲和力和强大的功能活性，在HEK293细胞中稳定表达，对其他靶标具有高选择性。在小鼠脑切片中，RO5166017抑制了Taar1表达区域（分别为腹侧被盖区和中隔背核）多巴胺能神经元和血清素能神经元的放电频率。相比之下，RO5166017没有改变蓝斑区（Taar1表达缺失的区域）去肾上腺素能神经元的放电频率。此外，TAAR1活性的调节改变了背侧5-HT1A受体的脱敏率和激动剂效力，表明TAAR1不仅调节多巴胺能神经传递，还调节5-羟色胺能神经传递。[1]

除了抑制 WT 电极中的可卡因外，RO5166017 还可以防止可卡因诱导的过度运动、多巴胺应激过度运动中的过度烧伤，以及可卡因治疗和多巴胺转运蛋白敲除 RUBS 中 NMDA 拮抗剂诱导的过度运动效应 [1]。 RO5166017（0.01-1 mg/kg，RO5166017 在 0.1-0.3 mg/kg 的剂量下表现出 TAAR1 介导的抗焦虑样特性。RO5166017 还抑制 WT 电极中的可卡因。RO5166017 增加 INS1E 细胞和人胰岛素样肽 1 (GLP) -1) 使用 RO5166017 进行饮食诱导营养 (DIO) 的亚慢性加工。

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给药后大鼠很少打哈欠。双向重复测量方差分析显示，RO5263397与喹匹罗交互作用显著（F(15,140) = 2.68, p < 0.01），其中RO5263397剂量（F(3,140) = 9.10, p < 0.001）和喹匹罗剂量（F(5,140) = 23.06, p < 0.001）的主效应显著。Bonferroni事后检验显示，0.032和0.1 mg/kg喹匹罗显著增加了车辆预处理组的哈欠。Bonferroni的事后试验还显示，与车辆预处理相比，在0.1 mg/kg喹匹罗下，3.2 mg/kg RO5263397以及在0.032和0.1 mg/kg喹匹罗下，5.6和10 mg/kg RO5263397效果显著（图1，左上）。双向重复测量方差分析也显示显著RO5166017 ×喹匹罗相互作用（F(10,105) = 2.14, p < 0.05），显著的主效应为RO5166017剂量（F(2,105) = 5.52, p < 0.05）和喹匹罗剂量（F(5,105) = 20.43, p < 0.0001）。Bonferroni事后检验显示，0.032和0.1 mg/kg喹匹罗显著增加了车辆预处理组的哈欠。Bonferroni的事后试验还显示，与载药预处理相比，0.1 mg/kg喹匹罗治疗3.2 mg/kg RO5166017，0.032和0.1 mg/kg喹匹罗治疗10 mg/kg RO5166017效果显著（图1，右上）。[2]
给药后大鼠体温为37.8±0.1℃。双向重复测量方差分析显示，喹匹罗剂量的主效应显著（F(5,140) = 336.70, p < 0.0001）， RO5263397剂量的主效应不显著（F(3,140) = 1.96， NS）， RO5263397与喹匹罗的交互作用不显著（F(15,140) = 0.77， NS）。Bonferroni的事后测试显示，0.032、0.1和0.32 mg/kg喹匹罗显著降低了车辆预处理组的体温（图1，左下）。双向重复测量方差分析也显示，喹匹罗剂量的主效应显著（F(5,105) = 313.24, p < 0.001），而RO5166017剂量的主效应不显著（F(2,105) = 0.14， NS）， RO5166017与喹匹罗相互作用的主效应不显著（F(15,105) = 1.19， NS）。Bonferroni的事后测试显示，0.032、0.1和0.32 mg/kg喹匹罗显著降低了车辆预处理组的体温（图1，右下）[2].

膜制备和放射配体结合。[1]
为了产生稳定表达小鼠、大鼠、人和食食猴TAAR1的HEK-293细胞，使用扩增高保真PCR系统从基因组DNA中扩增出编码序列，该系统添加了n端流感血凝素病毒先导序列，后跟一个FLAG标签和一个Met-Gly连接体，克隆到pIRESneo2载体中并转染到HEK293细胞中(CRL-1573；ATCC)使用Lipofectamine 2000。24 h后，在培养基中添加1mg /mL G418, 10 d后，分离克隆，扩增，按照制造商的说明使用Upstate cAMP免疫测定试剂盒检测对痕量胺（TAs）的反应。单克隆细胞系在15代培养期间显示稳定的EC50，用于所有后续研究。所有细胞系在含FCS的DMEM高糖培养基(10%；56℃热灭活30min)，青霉素/链霉素（1%）和375 μg/mL Geneticin。为了制备膜，使用胰蛋白酶/EDTA将细胞从培养瓶中释放出来，收获细胞，用冰冷的PBS（不含Ca2+和Mg2+）洗涤两次，在1000 × g下在4°C下成球5分钟，冷冻，并在- 80°C保存。冷冻微球悬浮在缓冲液A [20 mL Hepes-NaOH (20 mM, pH 7.4)，含10 mM EDTA]中，用Polytron (PT 6000；（运动学）在14000转每分钟20秒。匀浆在4℃下离心（48000 × g离心30 min），去除上清并丢弃，用Polytron在缓冲液A中重悬（14000 rpm重悬20 s）。重复此过程，并将最终颗粒重悬于缓冲液A中，并使用Polytron均质。通常，2 ml膜部分的等分液保存在- 80°C。对于每批新膜，通过饱和度曲线确定解离常数（Kd）。在竞争结合实验中，TAAR1激动剂[3h] RO5166017（小鼠和大鼠TAAR1）或[3h]RO5192022（食蟹猴和人TAAR1）作为TAAR1放射性配体，其浓度等于Kd值，通常为0.7 nM（小鼠TAAR1）， 2.3 nM（大鼠），16 nM（人）和28 nM（食蟹猴）。非特异性结合定义为在10 μM RO5166017存在下，放射性配体结合的数量。RO5166017在广泛的浓度范围（10 pM至10 μM）下进行了重复测试。将RO5166017 （20 μL/孔）转移到96深孔板上，加入180 μL结合缓冲液（20 mM heps - naoh, 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, pH 7.4）， 300 μL放射性配体和500 μL膜（以60 μg蛋白/mL重悬，人TAAR1实验除外，以400 μg蛋白/mL重悬）。4℃孵育90 min（小鼠、大鼠和猴TAAR1）或60 min（人TAAR1）。对于小鼠、大鼠和猴子的TAAR1实验，通过unfilter -96板（Packard Instrument）和玻璃过滤器GF/C在聚乙烯亚胺（0.3%）中预浸1小时，用1 mL冷结合缓冲液洗涤3次，快速过滤结束孵育。加入45 μL Microscint 40后，密封unfilter -96板，1 h后用TopCount Microscint闪烁计数器计数放射性。对于人TAAR1实验，用Brandel细胞收集机过滤GF/C玻璃过滤器，在GF/B玻璃过滤器上预先浸泡聚乙烯亚胺（0.3%）1小时，用1 mL冷结合缓冲液洗涤三次，结束培养。每个过滤器GF/C放入含有10 mL UltimaGold的小瓶中。1小时后，在β计数器Tricarb 2500TR上计数。

cAMP分析。[1]
表达TAAR1的重组HEK293细胞如上所述培养，当融合80-90%时收获。取出培养基，PBS冲洗细胞一次；然后，用5 mL胰蛋白酶/EDTA在37℃下孵育5 min，分离细胞。加入45 mL培养基，900 × g室温离心5 min。将细胞颗粒重悬于新鲜培养基中，使其浓度达到5.105个细胞/ mL。细胞镀于96孔板(BIOCOAT 6640；Becton Dickinson) （100 μL/孔，50,000个细胞/孔），37℃孵育20 h。为了刺激细胞，去除培养基，加入100 μL PBS（不含AMIMED内毒素）；在RT下振荡5 min后，除去PBS，加入90 μL含有1 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）的PBS。振荡细胞2分钟后，在37°C和5% CO2/95%空气中孵育10分钟。所有化合物在广泛的浓度范围（100 pM至10 μM）下进行重复测试。通常，加入10 μL PBS + 1 mM IBMX的复合溶液，10 μL 0.3 mM β-苯乙胺（PEA）溶液（最大响应），或10 μL 2% DMSO溶液（基础水平），振荡10 min后，于37℃孵育30 min。取出溶液，用150 μL裂解缓冲液（cAMP kit）裂解细胞；振荡30min， - 20℃保存。对于cAMP测定，根据制造商的说明使用Upstate cAMP试剂盒。在96孔兔抗cAMP抗体包被板中，加入50 μL cAMP标准品（1 ~ 0.0039 pmol/μL 8个标准品和1个不加cAMP的标准品）或细胞板样品50 μL。在每个板上做标准曲线；加入25 μL稀释的cAMP碱性磷酸酶偶联示踪剂，再加入50 μL稀释的兔抗cAMP抗体。封板后，在室温下振荡孵育30分钟，然后用自动洗板机去除上清，用1倍洗涤缓冲液洗涤5次。然后加入100 μL稀释的碱性磷酸酶底物，封板，摇瓶室温孵育30 min。最后用光度计读取1 s。

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电生理记录。[1] < br > 爪蟾卵母细胞的电生理。在表达小鼠TAAR1和人Kir3.1/3.2的爪蟾卵母细胞中进行电生理实验。 <人力资源> 脑切片的电生理学。[1]
电生理实验采用成年（3-6月龄）WT和Taar1 - / -小鼠250 μm厚水平切片进行。视觉全细胞电压钳或电流钳技术分别用于测量- 50 mV的保持电流或记录自发尖峰活动。所有用于统计分析的细胞都显示出至少30分钟的稳定放电活动。数据使用Axopatch 700B 获得，在2 kHz滤波，在10 kHz数字化，并使用pClamp10获取和分析。使用60倍物镜的红外差示干涉对比显微镜观察神经元。在腹侧被盖区（VTA），多巴胺能细胞通过超极化脉冲（- 50 ~ - 120 mV）和向外电流（10 μM）引起的大超极化激活电流（Ih）来识别。在中缝背核（DRN）中，5 -羟色胺能细胞在ipsapirone （100 nM）作用下产生大电流。在蓝斑（LC）中，通过对uk14304的反应和育亨宾的阻断来鉴定去肾上腺素能神经元。在外部溶液中存在四乙基铵（TEA）和4-氨基吡啶（4-AP）的情况下，通过从- 20到- 140 mV （250 ms持续时间）的斜坡命令确定电流电压（I-V）关系。

运动活动和刻板行为的测量。[1]
\n对于精神兴奋剂研究，记录方法如文献(10)所述。运动活动度(LMA)的测量方法为30分钟内累积的水平光束阻断次数（水平活动）。刻板行为时间的评估方法为30分钟内监测刻板行为（间隔小于1秒的重复光束阻断）的总时间。在可卡因研究中，C57BL/6小鼠（每组n=8）经口（po）给予赋形剂（H₂O + 0.3% Tween 80）或RO5166017（0.03–3 mg/kg，溶于赋形剂），放入活动监测箱中30分钟（适应期），腹腔注射生理盐水（0.9% NaCl + 0.3% Tween 80）或可卡因（15 mg/kg，溶于生理盐水），然后放回记录箱立即进行行为监测（记录期）。在Taar1−/−小鼠（每组n=10）中采用相同的实验范式，分别经口给予RO5166017（0.3–1 mg/kg）和腹腔注射可卡因（20 mg/kg），采用重复测量设计，两次实验间隔至少10天。对于 L-687,414 研究，NMRI 小鼠（每组 n = 8）在接受生理盐水或 L-687,414（50 mg/kg 生理盐水）皮下注射前 15 分钟，经口给予载体或 RO5166017（0.01–1 mg/kg 溶于载体）。适应期为 15 分钟。对于 Taar1−/− 小鼠，每组 n = 8 只小鼠经 RO5166017（0.3 mg/kg，口服）给药后，放入记录室 45 分钟，然后皮下注射生理盐水或 L-687,414（75 mg/kg），再放回记录室 15 分钟（即 60 分钟的适应期），之后记录 LMA。\n
\n对于 DAT−/−、WT 和双突变体 (DAT−/−/Taar1−/−) 小鼠，LMA 的测量方法如文献 (26) 所述。将 DAT−/− 小鼠放入活动监测室 30 分钟，使其充分表现出新奇刺激引起的过度活跃；然后，腹腔注射生理盐水或 RO5166017（0.2–1 mg/kg），并监测其水平活动 90 分钟。未经驯化的野生型小鼠在放入监测室前接受处理，并记录90分钟的LMA。\n\n

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\n\n48只成年雄性Sprague-Dawley大鼠，至少10周龄，体重至少300克，饲养条件如前所述（Siemian等人，2016）。除测试期间外，大鼠始终可自由饮水和进食标准啮齿动物饲料。测试前两天，大鼠接受操作并适应直肠温度测量。\n\n
\n打哈欠行为定义为嘴巴长时间（约1秒）张开后迅速闭合（Collins等人，2005）。测试当天，将大鼠（每组8只）放入空的啮齿动物笼中，并使其适应30分钟。在给予喹吡罗（0.0032–0.32 mg/kg）前 30 分钟，先给予 TAAR1 激动剂或赋形剂，喹吡罗采用累积给药方案给药。每次注射后 20 分钟开始观察打哈欠情况，并记录此后 10 分钟内的打哈欠总数。在 10 分钟观察结束后，在下次注射前，将涂抹润滑剂的热探针插入直肠约 5 cm 处测量体温。\n
\n\n盐酸喹吡罗溶于生理盐水。RO5263397 和 RO5166017 溶于由 1 份 190 度乙醇、1 份 Alkamuls EL-620 和 18 份生理盐水组成的赋形剂中。所有药物均以1–2 ml/kg的剂量腹腔注射给药。[2]\n\n

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\n\n药代动力学实验。[1]
\n雄性C57BL/6小鼠分别经颈静脉静脉注射（iv）或口服（po）给药RO5166017。每组随机选取两只小鼠，分别于给药后0.08、0.25、0.5、1、2、4和8小时（iv）或0.25、0.5、1和2小时（po）处死后采集血浆和脑组织样本。采用液相色谱-串联质谱法（LC/MS/MS）测定RO5166017的浓度。采用 WinNonlin 4.1 软件，通过非房室模型分析血浆浓度-时间曲线计算药代动力学参数。\n\n应激诱导高热 (SIH) [1]
\nSIH 试验按所述方法在 NMRI 小鼠中进行。每只小鼠测量两次体温：一次在 t = 0 (T1)，一次在 t = +15 分钟 (T2)。T1 作为操作应激源。温度差 (T2 − T1) 被认为反映了 SIH。小鼠在测量 T1 前 45 分钟接受 RO5166017 (0.01–1 mg/kg，口服) 或赋形剂 (0.9% NaCl + 0.3% Tween 80)。

[1]. TAAR1 activation modulates monoaminergic neurotransmission, preventing hyperdopaminergic and hypoglutamatergic activity. Proc Natl Acad Sci U S A.

[2]. Trace amine-associated receptor 1 agonists RO5263397 and RO5166017 attenuate quinpirole-induced yawning but not hypothermia in rats. Behav Pharmacol. 2017 Oct;28(7):590-593.

越来越多的证据表明，痕量胺相关受体1 (TAAR1) 是多巴胺能系统的重要调节因子。现有的分子证据表明，TAAR1 通过与多巴胺转运蛋白和D2受体相互作用来调节多巴胺水平。然而，迄今为止的研究尚不全面，其他通路也可能参与其中。在本研究中，我们利用一组特征明确的行为——喹吡罗诱导的打哈欠和体温过低——来探讨TAAR1与D3受体（属于“D2样”多巴胺受体亚家族）的潜在相互作用。既往研究表明，对于D2/D3受体激动剂而言，诱导打哈欠是D3受体介导的效应，而抑制打哈欠和诱导体温过低则是D2受体介导的效应。喹吡罗对打哈欠的剂量-效应曲线呈倒U形，TAAR1激动剂RO5263397和RO5166017均能剂量依赖性地使该曲线向下移动。喹吡罗还会引起剂量依赖性的体温过低，而TAAR1激动剂对此没有影响。这些结果提示TAAR1激动剂可能与D3受体和/或其下游通路相互作用，而非D2受体。这些发现可能揭示TAAR1介导效应机制中一个此前未被探索的可能性。[2]

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总之，这些结果表明TAAR1激动剂RO5263397和RO5166017能减少喹吡罗在大鼠体内诱导的D3受体介导的行为，但不影响D2受体介导的行为。基于这些体内数据，未来关于TAAR1机制的分子研究应考虑D3受体的潜在参与。 [2]

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TAAR1 是治疗神经精神疾病的一个很有前景的靶点，但现有激动剂的多样性和多药理学特性使得对其生理功能的解析充满挑战。本文报道了一种合成的选择性体内活性 TAAR1 激动剂 RO5166017。体外实验表明，RO5166017 可抑制腹侧被盖区 (VTA) 多巴胺 (DA) 神经元和背侧缝核 (DRN) 5-羟色胺 (5-HT) 神经元的放电频率。此外，调节 TAAR1 活性可改变 DRN 5-HT1A 受体的药理学特性，表明 TAAR1 不仅调节 DA 神经传递，也调节 5-HT 神经传递。体内实验表明，RO5166017 本身不具有活性，但可抑制精神兴奋剂诱导的活动过度，抑制 DAT−/− 小鼠的新奇刺激诱发的活动过度，并可预防野生型 (WT) 小鼠（而非 Taar1−/− 小鼠）的自发性抑制性高活动症 (SIH)。这些结果将 TAAR1 与单胺能驱动行为的控制联系起来，并强调了 TAAR1 激动剂的抗精神病和抗焦虑潜力。[1]

219.137

C, 65.73; H, 7.81; N, 19.16; O, 7.30

1048346-74-2

25016538

White to light yellow solid powder

1.2±0.1 g/cm3

314.7±34.0 °C at 760 mmHg

144.2±25.7 °C

0.0±0.7 mmHg at 25°C

1.589

1.32

50.8

1

3

4

16

249

1

O1C(N)=N[C@H](C1)CN(C1C=CC=CC=1)CC

PPONHQQJLWPUPH-JTQLQIEISA-N

InChI=1S/C12H17N3O/c1-2-15(11-6-4-3-5-7-11)8-10-9-16-12(13)14-10/h3-7,10H,2,8-9H2,1H3,(H2,13,14)/t10-/m0/s1

(4S)-4-[(N-ethylanilino)methyl]-4,5-dihydro-1,3-oxazol-2-amine

RO5166017; RO 5166017; 1048346-74-2; RO5166017; (4S)-4-[(N-ethylanilino)methyl]-4,5-dihydro-1,3-oxazol-2-amine; RO 5166017; RO-5166017; YK98JFQ52U; (S)-4-((Ethyl(phenyl)amino)methyl)-4,5-dihydrooxazol-2-amine; CHEMBL3779993; RO-5166017

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~25 mg/mL (~114.01 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (11.40 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (11.40 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (11.40 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。