RO8191

IFNAR2 (Interferon alpha/beta receptor 2). It functions as an agonist that binds to IFNAR2 and activates the JAK/STAT signaling pathway. [2]

JAK1; IFNAR2

CDM-3008，又名RO8191，具有依赖于IFNAR2/JAK1而非IFNAR1/Tyk2的抗病毒活性。已知IFNAR2激动剂RO8191可激活小鼠体内的IFN信号通路[1]。RO8191（0.08、0.4、2、10 μM；作用72小时）以剂量依赖的方式显著抑制HCV复制子活性。RO8191主要降低复制子细胞核周区域的HCV NS3和NS4A蛋白水平[1]。病毒蛋白，包括 NS3、NS4A/B 和 NS5A/B，在暴露于 RO8191 (0.08–10 μM) 72 小时后消失 [1]。

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CDM-3008 可抑制原代培养的人肝细胞 (PXB 细胞) 中乙型肝炎病毒 (HBV) 的复制。在感染 HBV C 基因型的 PXB 细胞中，用 CDM-3008 处理 7 天后，细胞内 HBV DNA 水平呈剂量依赖性降低，半数抑制浓度 (IC50) 为 0.1 μM。[2]
CDM-3008 处理在 10-100 μM 的浓度下显著降低了 HBV 感染的 PXB 细胞中共价闭合环状 DNA (cccDNA) 的水平。 [2]
CDM-3008 处理显著降低了 HBV 感染的 PXB 细胞培养基中 HBsAg（10-100 μM）和 HBeAg（0.1-100 μM）的水平。[2]
CDM-3008 的抗 HBV 活性依赖于 IFNAR2。在 HCV 复制子细胞中使用特异性 siRNA 敲低 IFNAR2 可抑制 CDM-3008 诱导的干扰素刺激基因 (ISG) OAS1 的表达。 [2] 在ISG表达相对缺陷的HepG2衍生Hep38.7-Tet细胞中，CDM-3008的抗HBV活性IC50值大于100 μM，比在PXB细胞中高出1000倍以上。这表明其抗HBV活性主要由ISG介导。[2] CDM-3008和恩替卡韦(ETV)对抑制HBV复制具有叠加效应。在PXB细胞中，与单独使用CDM-3008或0.1 nM ETV相比，联合使用0.1 μM CDM-3008和0.1 nM ETV可显著降低HBV DNA水平。 [2]
用CDM-3008 (30 μM) 或 IFNα (10 ng/ml) 处理 PXB 细胞 4 小时和 8 小时后进行微阵列分析，结果显示 CDM-3008 诱导了相似的基因表达模式，尤其激活了干扰素信号通路。CDM-3008 上调的基因数量（4 小时 257 个，8 小时 245 个）高于 IFNα 上调的基因数量（4 小时 170 个，8 小时 182 个）。[2]
CDM-3008 诱导了多种 ISG 的表达，包括 OAS1（参与 pgRNA 降解）、ISG20（参与 RNA-DNA 复合物降解）以及 APOBEC3F 和 APOBEC3G（参与 cccDNA 降解）。 qPCR 分析证实，与 DMSO 对照组相比，这些基因的表达显著上调。[2]
CDM-3008 对 JAK/STAT 通路的反馈抑制作用强于 IFNα。它能更有效地上调细胞因子信号传导抑制因子，包括 SOCS1、SOCS2、SOCS3 和 CISH。此外，它在 4 小时时下调了 IFNAR2 的表达。[2]
在一项时间进程实验中，用 CDM-3008 处理的 PXB 细胞中 OAS1 的表达在 8 小时达到峰值，在 24 小时下降，然后在 48 小时再次升高，呈现出反馈调节模式。[2]
CDM-3008 诱导的对进一步干扰素刺激的耐受状态强于 IFNα。当PXB细胞预先用CDM-3008处理24小时后，再用IFNβ刺激，OAS1表达的增加并不显著；而预先用IFNα处理则可使IFNβ刺激后OAS1表达显著增加。[2]
CDM-3008特异性诱导了几个IFNα诱导性不高的基因，包括SDS、SOCS3、C11orf96、SAA2和CISH。qPCR证实了SOCS2、SOCS3、CISH、WFDC2和SLPI的特异性上调。[2]
3D-PCR分析表明，CDM-3008处理导致脱氨基的cccDNA分子降解。在DMSO处理的细胞的cccDNA中发现了随机的C到T和G到A的转换，而在CDM-3008处理的细胞的剩余cccDNA中则富集了特定的突变（第45位C到A，第83位A到C），表明编辑后的cccDNA优先降解。[2]

在6周龄C57BL/6J小鼠的肝脏中，RO8191（CDM-3008；30 mg/kg；口服）显著增加了抗病毒基因Oas1b、Mx1和Pkr的表达[1]。

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口服RO8191可诱导小鼠肝脏中干扰素刺激基因（ISG）的表达。小鼠口服30 mg/kg RO8191 24小时后，对肝组织进行实时RT-PCR分析显示，多种ISG显著诱导表达，包括Oas1b、Mx1、Pkr、Ifit3、Isg15、Mda5、Rig-I、Socs1、Stat1和Usp18。[1]
RO8191不会显著诱导小鼠肝脏中炎症细胞因子和趋化因子的表达。 [1]
在人源化肝脏小鼠模型中，口服RO8191可降低HCV滴度。在感染HCV 1b基因型的人肝细胞嵌合小鼠中，每日口服RO8191（30 mg/kg），持续14天，可降低血清HCV RNA水平。[1]

表面等离子共振 (SPR) 结合分析：采用 SPR 光谱法评估了 RO8191 与 IFNAR2 胞外结构域 (ECD) 的直接相互作用。重组 IFNAR2 ECD 蛋白通过胺偶联固定在传感器芯片表面。为稳定结合位点，在固定过程中将蛋白与 2 μM RO8191 混合。将浓度分别为 0.31 μM 和 0.63 μM 的 RO8191 以及阳性对照 PEG-IFN-α2a 作为分析物注入传感器芯片。扣除对照流动池的背景信号。使用专用软件将所得传感器图谱全局拟合到 1:1 结合模型，从而获得动力学参数。分析结果显示，两种浓度的RO8191的KD值分别为480.5 nM和484.5 nM，表明存在直接的剂量依赖性相互作用。非活性对照化合物未显示结合。[1]

PXB细胞抗HBV活性检测：将原代人肝细胞（PXB细胞）感染HBV C基因型28天。然后用系列稀释的CDM-3008（0.0003–100 μM）处理细胞7天。纯化细胞DNA，并使用特异性引物和探针通过qPCR定量HBV DNA和cccDNA（经T5核酸外切酶处理后）。采用ELISA法检测培养基中HBsAg和HBeAg的水平。使用RealTime-Glo MT细胞活力检测试剂盒评估细胞活力。[2]
IFNAR2敲低和ISG表达：将HCV复制子细胞转染IFNAR2 siRNA或对照siRNA 2天。然后用30 μM CDM-3008处理细胞8小时。纯化总RNA，并通过qPCR检测OAS1 mRNA表达，以验证CDM-3008对IFNAR2的影响。[2]
微阵列基因表达分析：将PXB细胞（HBV感染或未感染）用30 μM CDM-3008或10 ng/ml IFNα处理4或8小时。纯化总RNA，并使用Illumina Human HT-12 v4 Expression BeadChips进行分析。使用Bioconductor处理数据，并使用Ingenuity Pathways Analysis (IPA)进行分析。[2]
qPCR基因表达验证：将PXB细胞用DMSO、30 μM CDM-3008或10 ng/ml IFNα处理4或8小时。将总RNA进行逆转录，并使用特异性引物和SYBR Green或TaqMan探针，通过qPCR定量分析特定基因（例如SOCS1、STAT2、IFNAR1、IFNAR2、ISG15、USP18、OAS1、ISG20、APOBEC3F、APOBEC3G、SOCS2、SOCS3、CISH、WFDC2、SLPI）的表达水平。[2]
APOBEC3活性的3D-PCR：将感染HBV 28天的PXB细胞用100 μM CDM-3008或10,000 IU/ml IFNα处理7天。纯化细胞DNA。通过PCR扩增cccDNA，然后进行HBx区域的巢式PCR，变性温度梯度为80–92 °C。产物经凝胶电泳分离、克隆和测序，以检测指示APOBEC3介导的脱氨作用的G-to-A或C-to-T转换。[2]
恩替卡韦的叠加效应实验：将HBV感染的PXB细胞用0.1 μM CDM-3008、0.1 nM恩替卡韦(ETV)或二者联合处理7天。通过qPCR检测细胞内HBV DNA水平以评估叠加效应。[2]
OAS1表达的时间进程：将PXB细胞用30 μM CDM-3008或10 ng/ml IFNα处理0、8、24和48小时。通过qPCR检测OAS1 mRNA表达以分析ISG诱导和反馈调节的动力学。 [2]
干扰素耐受性检测：PXB 细胞预先用 30 μM CDM-3008 或 10 ng/ml IFNα 处理 24 小时。然后用 10 ng/ml IFNβ 处理细胞 4 小时。通过 qPCR 检测 OAS1 mRNA 的表达，以评估预处理诱导的反馈抑制水平。[2]

小鼠ISG诱导研究：** 6周龄C57BL/6J小鼠单次口服30 mg/kg RO8191或载体（10%二甲基亚砜和10% Cremophor）。给药24小时后，处死小鼠并取出肝脏。提取肝组织总RNA，并使用实时RT-PCR检测小鼠ISG的mRNA表达水平。数据采用Student's t检验进行分析，每组4只小鼠。[1]
* **人源化肝脏小鼠模型疗效研究：** 将人原代肝细胞移植到携带uPA转基因的SCID小鼠体内构建嵌合人肝细胞小鼠，并感染HCV 1b基因型。感染5周后，在HCV病毒血症稳定（~10^6拷贝/mL）的情况下，对小鼠进行为期14天的治疗。一组小鼠每日口服 30 mg/kg RO8191。另一组小鼠每周两次皮下注射 30 mg/kg PEG-IFN-α2a。在不同时间点采集血清样本，并使用实时 RT-PCR 定量 HCV RNA。[1]

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小鼠 ISG 诱导研究：6 周龄 C57BL/6J 小鼠单次口服 30 mg/kg RO8191 或载体（10% 二甲基亚砜和 10% Cremophor）。给药 24 小时后，处死小鼠并取出肝脏。提取肝组织总 RNA，并使用实时 RT-PCR 检测小鼠 ISG 的 mRNA 表达水平。数据采用 Student's t 检验进行分析，每组 4 只小鼠。 [1]
人源化肝脏小鼠模型疗效研究：将人原代肝细胞移植到携带uPA转基因的SCID小鼠体内构建嵌合人肝细胞小鼠，并用HCV 1b基因型感染。感染后5周，小鼠HCV病毒血症稳定（~10^6拷贝/mL），随后进行为期14天的治疗。一组小鼠每日口服30 mg/kg RO8191。另一组小鼠每周两次皮下注射30 mg/kg PEG-IFN-α2a。在不同时间点采集血清样本，并使用实时RT-PCR定量HCV RNA。[1]

在PXB细胞中，经RealTime-Glo MT细胞活力检测法测定，浓度高达100 μM的CDM-3008在处理7天后未显示出剂量依赖性细胞毒性。[2]
在Hep38.7-Tet细胞中，经XTT法测定，浓度高达100 μM的CDM-3008在处理6天后也未显示出显著的细胞毒性。[2]
该研究指出，CDM-3008存在溶解度和代谢稳定性问题，这可能会影响其作为药物的应用。其衍生物CDM-3032在小鼠和人肝微粒体中具有更高的溶解度和代谢稳定性。[2]

[1]. An Orally Available, Small-Molecule Interferon Inhibits Viral Replication. Sci Rep. 2012;2:259.

[2]. An interferon-like small chemical compound CDM-3008 suppresses hepatitis B virus through induction of interferon-stimulated genes. PLoS One. 2019 Jun 12;14(6):e0216139.

CDM-3008（又名 RO8191）是一种小分子化合物，具有干扰素样功能。它作为 IFNAR2 的激动剂，激活 JAK/STAT 通路，诱导干扰素刺激基因 (ISG) 的表达。[2] 与需要注射的 IFNα 不同，CDM-3008 可口服，且生产成本低廉，具有显著优势。[2] 口服的 CDM-3008 被认为可经肠道吸收，并通过门静脉输送至肝脏，与全身注射的 IFNα 相比，可能减少副作用。[2] CDM-3008 特异性地通过 IFNAR2 诱导 ISG 表达，而 IFNα 则需要 IFNAR1 和 IFNAR2 的异二聚体。这种特异性可能减少与 IFNAR1 下游信号通路相关的副作用。[2]
CDM-3008 对 JAK/STAT 通路的反馈抑制作用强于 IFNα，这可能有助于控制潜在的副作用。[2]
该化合物也被称为“cccDNA 调节剂”，因为它能够降低 HBV 感染细胞中的 cccDNA 水平，这可能是通过诱导 APOBEC3 家族蛋白实现的。[2]

C14H5F6N5O

373.212822675705

373.039

691868-88-9

2768133

Off-white to yellow solid powder

3.7

69.1

0

11

1

26

531

0

FC(C1C=C(C(F)(F)F)N=C2C=1C=CC1=NC(C3=NN=CO3)=CN21)(F)F

GRHYZVJEXKTJOS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C14H5F6N5O/c15-13(16,17)7-3-9(14(18,19)20)23-11-6(7)1-2-10-22-8(4-25(10)11)12-24-21-5-26-12/h1-5H

2-[2,4-bis(trifluoromethyl)imidazo[1,2-a][1,8]naphthyridin-8-yl]-1,3,4-oxadiazole

RO8191 CDM-3008 RO 8191 CDM3008 RO-8191

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~5 mg/mL (~13.40 mM)

配方 1 中的溶解度: 0.5 mg/mL (1.34 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 5.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 0.5 mg/mL (1.34 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 5.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 5.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。