PDE4

在体外，香烟烟雾提取物 (CSE) 诱导的 WD-HBEC 中的上皮间质转化 (EMT) 被浓度为 2 nM 的罗氟司特 N-氧化物部分抑制。 CSE 后，罗氟司特 N-氧化物 (2 nM) 可以恢复 45% 减少的 E-钙粘蛋白转录物表达。罗氟司特 N-氧化物 (2 nM) 可消除 I 型胶原蛋白的表达。当向细胞中添加罗氟司特 N-氧化物 (2 nM) 时，似乎对上皮细胞表型有保护作用。此外，与罗氟司特 N-氧化物 (2 nM) 预孵育可部分减弱 β-连环蛋白核转位 [2]。

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中性粒细胞趋化参与慢性阻塞性肺疾病（COPD）等肺部炎症过程。中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）作为中性粒细胞产生的主要蛋白酶之一，通过气道上皮细胞释放趋化因子在炎症过程中起重要作用。近期研究表明罗氟司特N-氧化物对COPD具有治疗潜力。本研究旨在探讨罗氟司特N-氧化物对NE诱导的A549上皮细胞趋化因子产生及信号通路的影响。A549细胞与NE孵育30分钟后PBS洗涤，分别培养2小时（检测mRNA表达）和24小时（检测趋化因子释放）或5-30分钟（检测蛋白磷酸化）。在NE刺激前，细胞单独或联合使用前列腺素E2（PGE2）与罗氟司特N-氧化物进行预孵育。NE刺激可升高A549细胞趋化因子产量并激活p38α通路。而罗氟司特N-氧化物与PGE2联用时，对NE诱导的趋化因子释放及p38α等激酶激活具有协同抑制作用。结论：NE通过激活p38α MAP激酶促进上皮细胞趋化因子释放，而罗氟司特N-氧化物与PGE2联用可降低NE诱导的激酶活化及趋化因子产生。[1]

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罗氟司特N-氧化物/RNO与PGE2联用对NE诱导A549上皮细胞趋化因子释放的影响[1]c 单独使用罗氟司特N-氧化物对NE诱导的趋化因子释放无影响（数据未显示）。而10 nM PGE2与RNO联用可降低IL-8/CXCL8、MCP1/CCL2和Gro-α/CXCL1的释放。单独PGE2孵育上皮细胞即可减少NE诱导的上述趋化因子释放（图4A、B、C），但RNO与10 nM PGE2联用能进一步降低MCP1/CCL2和Gro-α/CXCL1的释放（图4B、C）。

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NE诱导的p38α激酶通路激活在罗氟司特N-氧化物/RNO处理后减弱[1]v 10 nM PGE2（无论单独或联合RNO）处理上皮细胞5分钟，均显著降低NE诱导的p38α激酶激活（图6A）。但仅RNO与PGE2联用组p38α活化程度显著更低（图6A），该结果经磷酸化p38α特异性ELISA验证（图6B）。PGE2单独或联合RNO均未改变ERK 1/2和JNK通路激活或蛋白总量。

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罗氟司特N-氧化物/RNO对NE诱导A549细胞蛋白磷酸化的影响[1]v 首先采用人类磷酸化蛋白阵列试剂盒检测PGE2预处理的A549细胞中10 nM NE是否激活其他信号通路，继而分析RNO与PGE2联用相对于单独PGE2的效果。PGE2预处理后，NE刺激可激活45种激酶中的12种（灰色柱；包括RSK 1/2/3、c-Jun等，激活定义为较对照增加≥30%）（图7A）。当1 μM RNO与PGE2联用时，这12种激酶中有5种（白色柱；包括Hck、FAK等）的激活强度显著降低（图7A、B）。

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背景：吸烟通过促进COPD小支气管上皮-间质转化（EMT）参与肺重塑过程。我们近期发现PDE4抑制剂罗氟司特的活性代谢物罗氟司特N-氧化物（RNO）可预防香烟烟雾提取物（CSE）诱导的人支气管上皮细胞EMT。而他汀类药物对肾和肺泡上皮细胞EMT具有保护作用。目的：探讨RNO与辛伐他汀（SIM）对体外培养的小支气管来源高分化人支气管上皮细胞（WD-HBEC）中CSE诱导EMT的交互作用。方法：用2.5% CSE刺激WD-HBEC，通过实时定量PCR或Western blot检测间质标志物（波形蛋白、I型胶原等）、上皮标志物（E-钙黏蛋白等）及β-连环蛋白表达。H2DCF-DA探针检测活性氧（ROS），Western blot分析GTP-Rac1和pAkt。结果：2 nM RNO与100 nM SIM联用对逆转CSE诱导EMT具有（超）叠加效应。CSE通过ROS生成和PI3K/Akt/β-catenin通路激活部分介导EMT。2 nM RNO和100 nM SIM均可部分阻断该通路，两者联用几乎完全抑制ROS/PI3K/Akt/β-catenin信号传导从而阻止EMT。结论：PDE4抑制剂罗氟司特N-氧化物与辛伐他汀在体外WD-HBEC模型中（超）叠加抑制CSE诱导的EMT。[2]

在用 10 mg/kg 罗氟司特 N-氧化物处理一次的 db/db 小鼠中，血浆胰高血糖素样肽-1 (GLP-1) 增加了四倍。研究发现，长期服用 3 mg/kg 剂量的罗氟司特 N-氧化物可以阻止 db/db 小鼠的疾病进展。当罗氟司特-N-氧化物作为载体时，它保留了胰岛形状并降低了血糖，HbA1c 分别增加了 50% 和 50%。它还使空腹血清胰岛素增加了一倍。此外，在初级胰岛中，罗氟司特-N-氧化物改善了毛喉素诱导的胰岛素释放。此外，与其母体分子相比，罗罗司特-N-氧化物具有更强的降血糖作用[3]。

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单次给予db/db小鼠10 mg/kg罗氟司特或其代谢物罗氟司特N-氧化物，分别使血浆GLP-1水平升高2.5倍和4倍。长期使用3 mg/kg剂量的罗氟司特或罗氟司特N-氧化物可延缓疾病进展。与溶媒组相比，罗氟司特N-氧化物完全阻断了血糖升高，使HbA(1c)增幅降低50%，空腹血清胰岛素翻倍，同时保护胰岛形态。此外，在原代胰岛中该代谢物能增强福司柯林诱导的胰岛素分泌。罗氟司特N-氧化物降糖效果优于母体化合物，与其更强效的GLP-1分泌促进作用一致，药代/药效学模型可解释此现象。 结论：罗氟司特及其活性代谢物罗氟司特N-氧化物可能通过GLP-1和胰岛素相关机制保护胰岛生理功能，从而延缓db/db小鼠糖尿病进展。[3]

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单次给药罗氟司特及罗氟司特N-氧化物对血浆GLP-1的影响[3]
在空腹db/db小鼠中观察10 mg/kg单剂量罗氟司特或其代谢物对血浆GLP-1的作用，并评估葡萄糖刺激（GLP-1分泌生理触发剂）的调节效应。葡萄糖存在时，罗氟司特和罗氟司特N-氧化物分别使血浆GLP-1较溶媒组显著增加2.5倍和4.3倍（图1）。该效应在给药10分钟后显现，60分钟后消退。无葡萄糖刺激时，两者仅引起GLP-1轻微非显著性升高（数据未显示）。

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长期给药罗氟司特及罗氟司特N-氧化物对体重与摄食饮水的影响[3]
3 mg/kg/天剂量的罗氟司特及其代谢物显著降低db/db小鼠摄食量与饮水量（图2a,b）。治疗4周后平均摄食量较溶媒组减少约17%。溶媒组动物饮水量从6.7 g/天增至15.6 g/天，而罗氟司特与罗氟司特N-氧化物治疗组分别降至7.6 g/天和3.8 g/天。此效应在首次给药后即出现并持续整个研究周期。两者对体重无显著影响（图2c）。

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长期给药罗氟司特及罗氟司特N-氧化物对血液指标的影响[3]
溶媒组动物HbA1c在4周内从4.4%（24.6 mmol/mol）升至8.2%（66.1 mmol/mol）。3 mg/kg/天治疗显著抑制HbA1c升高，罗氟司特N-氧化物治疗4周后增幅较溶媒组降低50%（p<0.01）（图3a）。与之对应，溶媒组血糖AUC−15–60和空腹血糖分别升高38%和51%，而罗氟司特N-氧化物使两者恢复至研究初期水平（分别p<0.001和p<0.01），罗氟司特仅显著降低血糖AUC（p<0.01）（图3b-d）。溶媒组空腹血清胰岛素从602 pmol/l轻微下降至551 pmol/l，而罗氟司特N-氧化物治疗4周后该指标近乎翻倍（p<0.05）。葡萄糖刺激后血清胰岛素水平在两组均未升高（数据未显示）。

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长期给药罗氟司特及罗氟司特N-氧化物对胰腺形态的影响[3]
H&E染色显示11周龄溶媒组db/db小鼠出现轻度至中度胰岛萎缩（25-50%胰岛受累，萎缩严重度评分2.6）（图4）。连续切片胰岛素染色证实萎缩胰岛伴随β细胞减少（图5a,b）。每日3 mg/kg治疗4周后，罗氟司特组胰岛萎缩程度减轻（评分2.0，p>0.05），罗氟司特N-氧化物组萎缩极轻微（评分1.3，p<0.01），且两组均保留β细胞胰岛素分泌功能（图5c,d）。

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罗氟司特N-氧化物增强小鼠胰岛胰岛素分泌[3]
在原代小鼠胰岛中验证该代谢物对胰岛素分泌的促进作用（图7）。腺苷酸环化酶广谱激活剂福司柯林（1 μmol/l）使胰岛素分泌增加4倍，当联合10或100 nmol/l罗氟司特N-氧化物时，10 nmol/l葡萄糖条件下的胰岛素释放分别增强至5.5倍和7倍。单独使用罗氟司特（数据未显示）或其代谢物在不同葡萄糖浓度下均不能诱导胰岛素分泌（图示为100 nmol/l代谢物在10 mmol/l葡萄糖条件下的结果）。

治疗[1]
A549细胞在添加抗生素、l-谷氨酰胺和HEPES的无血清f - 12k培养基中洗涤培养过夜。将饥饿后的细胞用NE或PBS孵育30分钟，用PBS洗涤，然后在无血清的f - 12k中培养。刺激后24 h收集细胞上清液（用于细胞因子测量），2 h收集细胞微球（用于mRNA表达分析）。另外，在加入NE之前，A549细胞与PGE2 （10 nM）单独或与Roflumilast N-oxide (0.1 μM， 0.3 μM和1 μM)，载体（DMSO 0.01%）或EGFR抑制剂AG-1478联合预孵育2小时。所有实验均在无血清培养基中进行，一式三份，至少重复三次。在孵育期结束时，收集培养上清液并在- 80°C保存，以待进一步分析。

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人磷蛋白阵列[1]
在加入NE之前，将细胞与PGE2 （10 nM）单独或与Roflumilast N-oxide (1 μM)联合预孵育2 h。根据制造商的说明，将细胞裂解液（每个阵列总蛋白500 μg）应用于磷酸化蛋白阵列（Proteome Profiler Human Phosphokinase array Kit）。

db/db小鼠急性研究[3]
\n7周龄小鼠禁食16小时后，单次口服给予赋形剂（4%甲氧纤维素）或试验化合物（10 mg/kg罗氟司特或罗氟司特N-氧化物，单次给药后无副作用的最大药理有效剂量），同时给予2 g/kg体重的葡萄糖作为GLP-1分泌的生理启动剂。预实验确定2 g/kg体重的葡萄糖浓度为最佳浓度，因为该浓度本身不会显著诱导GLP-1水平，但与PDE4抑制剂协同作用可有效触发GLP-1释放。分别在给予PDE4抑制剂和葡萄糖前60分钟以及后10分钟和60分钟分析血浆GLP-1水平。本研究还探讨了在不给予葡萄糖推注的情况下，罗氟司特和罗氟司特N-氧化物对血浆GLP-1的影响。\n\ndb/db小鼠的慢性研究[3]
\n所有动物在7周龄时，每天一次通过灌胃给予赋形剂（4%甲氧纤维素）、罗氟司特或罗氟司特N-氧化物。每日监测体重、食物和水的摄入量。用于药效学分析的动物（PD组）接受罗氟司特（0.3、1和3 mg/kg/天）或罗氟司特N-氧化物（3 mg/kg/天）治疗28天，其中3 mg/kg为长期给药后无副作用的最大药理有效剂量。在治疗开始前6天和1天，以及治疗开始后14天和28天测定HbA1c水平。在第1天和第28天进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），以分析血糖和血清胰岛素水平。OGTT试验中，动物禁食4小时后，接受1 g/kg体重的葡萄糖推注。与急性研究中16小时的禁食时间不同，本研究出于伦理原因进行了方法优化实验，因此禁食时间缩短至4小时，且结果与16小时禁食组的结果具有可比性。分别在葡萄糖负荷试验前15分钟、后15分钟和60分钟采集血液样本。葡萄糖曲线下面积（AUC）的测定时间为-15分钟至60分钟。在治疗开始后的第20天和第28天，再次采集血液样本进行药物暴露分析。第28天，通过颈椎脱臼处死动物，并取出胰腺进行组织病理学检查。在药代动力学（PK）分析中，我们纳入了卫星动物（PK动物），这些动物接受3 mg kg⁻¹ day⁻¹的罗氟司特或罗氟司特N-氧化物治疗，持续34天。在第 1、14、20、34 和 35 天采集血样进行药物暴露分析。\n\n慢性 db/db 小鼠研究中的 PKPD 分析 [3]
\n在不同时间点采集 PD 和 PK 动物的血样，分析药物暴露情况，每只动物分别提供 2 个和 8 个样本（PD 动物：-0.5/2 小时，第 20 天；30 小时，第 28 天。PK 动物：0.5/1/2/4/8 小时，第 1 天；0.5/1/4 小时，第 14 天；0.5/2 小时，第 20 天；-0.5/0.5/1/2/4/8 小时，第 34 天；30 小时，第 35 天）。在给予罗氟司特N-氧化物后，使用浓度值高于定量下限（LLOQ）的样品进行分析（HPLC-MS/MS，LLOQ = 0.5 μg/L），分别对应母体药物和代谢物51个和60个浓度值。给予罗氟司特后，母体药物和代谢物共获得89个浓度值，低于LLOQ的值被设定为LLOQ的一半（0.25 μg/L）以减少模型偏差。分别针对给予罗氟司特和罗氟司特N-氧化物后，建立了四个药代动力学模型。所有变量均采用非线性混合效应模型（NONMEM）（版本7，ICON Development Solutions，Ellicott City，MD，USA）进行估计，并采用一阶条件估计和交互作用。根据获得的个体表观清除率估计值，按照以下公式计算每只帕金森病动物的个体稳态AUC：AUC (μg h l−1) = 剂量 (μg/kg)/清除率 (lh−1 kg−1)。AUC估计值用于确定所有帕金森病动物相应化合物的总PDE4抑制率 (tPDE4i)。tPDE4i将化合物在血浆中的平均游离浓度与其体外PDE4抑制IC50值联系起来，是一种暴露替代指标，可以考虑母体化合物和代谢物对总体效应的平行贡献。[3]
\n其中，rof和rofNO分别对应于罗氟司特和罗氟司特N-氧化物，fu对应于体外小鼠血浆中的游离分数，IC50对应于体外导致50% PDE4抑制的化合物浓度，τ对应于给药间隔。为了考虑循环系统中罗氟司特和罗氟司特-N-氧化物的存在，分别计算了每种化合物的tPDE4i值并相加。将合并后的个体tPDE4i值作为后续PKPD模型中的暴露量指标。分别以赋形剂组、罗氟司特组和罗氟司特-N-氧化物组在第-1、14和28天的HbA1c水平作为PD读数，并使用以下公式将其与个体tPDE4i值关联起来：

[1]. Roflumilast n-oxide associated with PGE2 prevents the neutrophil elastase-induced production of chemokines by epithelial cells. Int Immunopharmacol. 2016 Jan;30:1-8.

[2]. Simvastatin Increases the Ability of Roflumilast N-oxide to Inhibit Cigarette Smoke-Induced Epithelial to Mesenchymal Transition in Well-differentiated Human Bronchial Epithelial Cells in vitro. COPD. 2015 Jun;12(3):320-31.

[3]. The glucose-lowering effects of the PDE4 inhibitors roflumilast and roflumilast-N-oxide in db/db mice. Diabetologia. 2012 Oct;55(10):2779-2788.

我们发现，NE可通过激活p38α MAP激酶增加上皮细胞趋化因子的释放。此外，我们发现EGF受体抑制剂能够抑制NE诱导的IL-8/CXCL8和Gro-α/CXCL1的产生，但对MCP-1/CCL2的产生没有影响。相反，用RNO和PGE2联合处理细胞可降低IL-8/CXCL8、MCP-1/CCL2和Gro-α/CXCL1的释放，并降低多种激酶的激活程度。我们的结果证实了RNO在该体外弹性蛋白酶模型中的抗炎作用，并有助于解释该化合物的作用机制。[1]

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罗氟司特N-氧化物和辛伐他汀可能通过互补机制抑制CSE诱导的GTP结合Rac1的增加，从而产生叠加效应。他汀类药物通过限制香叶基香叶基化作用，进而抑制Rac1膜结合PDE4抑制剂，从而抑制GDP→GTP交换。鉴于GTP-Rac1在NOX1/NOX2活性中的关键作用，罗氟司特N-氧化物和辛伐他汀抑制CSE诱导的ROS的叠加效应可能反映了它们对GTP-Rac1的抑制作用。如先前研究所示，清除ROS可以保护WD-HBEC免受CSE诱导的EMT损伤（参考文献4）。因此，罗氟司特N-氧化物和辛伐他汀对预防CSE诱导的EMT的叠加效应可能归因于它们对WD-HBEC中CSE诱导的ROS的抑制作用。
辛伐他汀和罗氟司特N-氧化物可抑制CSE诱导的PI3K/Akt通路激活以及随之而来的WD-HBEC中核β-catenin的增加，这是一个新的发现。然而，一种合理的解释可能是它们能够减弱 WD-HBEC 中 CSE 诱导的 ROS。
总之，本研究表明，PDE4 抑制剂罗氟司特 N-氧化物和 HMG-CoA 还原酶抑制剂辛伐他汀具有叠加效应，可减轻烟草烟雾诱导的分化良好的人支气管上皮细胞 (EMT)。PDE4 抑制剂和辛伐他汀可能作用于 CSE 诱导的 EMT 的不同通路，表现为 GTP-Rac1、ROS、PI3K/Akt 和核 β-catenin 的抑制。[2]

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据我们所知，我们首次在 2 型糖尿病动物模型中展示了 PDE4 抑制剂的作用，详细评估了疾病进展，并分析了其对葡萄糖代谢关键激素 GLP-1 和胰岛素的影响。罗氟司特是一种选择性 PDE4 抑制剂，此前已获批用于治疗 COPD。近期一项关于罗氟司特的人体研究探讨了其在2型糖尿病中的疗效问题（EFM Wouters，荷兰马斯特里赫特大学医学中心，未发表结果）。在人体内，罗氟司特代谢为活性代谢物罗氟司特N-氧化物，其暴露量比母体化合物高近10倍，是罗氟司特发挥药效的主要成分。由于罗氟司特在db/db小鼠体内的代谢情况尚不清楚，我们设置了一个罗氟司特N-氧化物治疗组，以确保达到有效的血浆浓度。
与先前报道的罗利普兰在非糖尿病大鼠中升高GLP-1水平的作用一致，我们现在在2型糖尿病模型中证实了这一结果。在糖尿病db/db小鼠中，单次口服10 mg/kg罗氟司特或其代谢物，在葡萄糖存在的情况下，血浆GLP-1水平分别比对照组升高2.5倍和4.3倍。由于该研究还表明罗利普兰能够直接刺激GLUTag细胞中cAMP介导的GLP-1释放，我们得出结论：观察到的罗氟司特引起的GLP-1升高是由于db/db小鼠肠道L细胞中cAMP介导的GLP-1释放所致。在没有葡萄糖的情况下，罗氟司特和罗氟司特N-氧化物对血浆GLP-1没有显著影响，这表明PDE4抑制剂仅在进食后（GLP-1分泌的生理启动因素）增强GLP-1的释放。相比之下，治疗性 GLP-1 类似物可提高 GLP-1 水平，且不受食物摄入的影响。
长期使用罗氟司特或罗氟司特 N-氧化物治疗 db/db 小鼠可显著改善其糖尿病状态。罗氟司特 N-氧化物以 3 mg kg–1 day–1 的剂量几乎完全抑制了研究期间葡萄糖曲线下面积 (AUC) 和空腹血糖的升高，并使糖化血红蛋白 (HbA1c) 的增幅较对照组降低了约 50%。此外，治疗 4 周后，空腹血清胰岛素水平几乎翻倍，同时胰岛形态得到改善，β 细胞的胰岛素分泌功能也得以维持。糖尿病状态的改善还体现在饮水量减少，以及食物摄入量减少（尽管减少程度较小）。饮水量降至 3.8 g/天，与我们在健康小鼠中观察到的水平相同（数据未显示），表明肾脏葡萄糖重吸收能力不再超负荷，这与对照组小鼠在研究结束时饮水量高达 15.6 g/天形成鲜明对比。尽管罗氟司特-N-氧化物具有减少食物摄入的作用，但它对体重增长没有影响。然而，这种差异可能是 db/db 小鼠特有的效应，因为已有研究表明 PDE4 抑制剂可以降低饮食诱导肥胖小鼠和糖尿病慢性阻塞性肺病患者的体重。这表明，与目前常用的降糖药物（如胰岛素、磺脲类或噻唑烷酮类）相比，PDE4抑制剂可能更具优势，因为后者通常会导致体重增加。
与母体药物罗氟司特相比，长期使用罗氟司特N-氧化物可产生更强的降糖效果，表现为血糖和糖化血红蛋白（HbA1c）水平显著降低以及胰岛细胞保护作用更佳。两种化合物对食物摄入量的影响相似；然而，这可能是由于该方法的灵敏度有限所致。长期使用罗氟司特N-氧化物后更强的降糖效果与其急性使用后更强的GLP-1升高作用相一致。这一观察结果以及大量已发表的关于GLP-1降糖作用的文献支持以下观点：罗氟司特介导的GLP-1升高与db/db小鼠糖尿病进展的预防之间存在关联。特别是，用 GLP-1 模拟物治疗 db/db 小鼠的结果与我们的研究结果相似，均表现为食物和水的消耗量减少以及胰岛的保护。另一个令我们印象深刻的观察结果支持了我们的解释，即 PDE4 抑制剂可能通过增强生理性肠道 GLP-1 释放来改善糖尿病。比较 GLP-1 模拟物和 PDE4 抑制剂在人体内的药物反应谱显示，两种治疗方法均可降低体重，并引起胃肠道副作用，例如胃排空延迟、短暂性恶心和腹泻。
与罗氟司特相比，罗氟司特 N-氧化物 具有更强的降血糖作用的原因在于，药代动力学模型显示，罗氟司特 N-氧化物治疗后联合暴露替代指标 tPDE4i 的值比母体药物罗氟司特高 1.6 倍。此外，模型结果表明，基于估计的 EMAX 值为 1，PDE4 抑制剂有可能使 db/db 小鼠的 HbA1c 维持在初始水平。由于 db/db 小鼠的估计 PDE50 值为 27.1，比人类在 500 μg 有效剂量下的 tPDE4i 值 1.03 高约 27 倍 [30]，因此 db/db 小鼠似乎需要比人类更高的药物暴露量才能达到疗效。在将小鼠研究结果转化到人类时，应考虑这一点。[3]

C17H14CL2F2N2O4

419.2069

418.029

C, 48.71; H, 3.37; Cl, 16.91; F, 9.06; N, 6.68; O, 15.27

292135-78-5

Roflumilast;162401-32-3;Roflumilast Impurity E;1391052-76-8

9940999

White to off-white solid powder

1.6±0.1 g/cm3

519.7±50.0 °C at 760 mmHg

181 °C

268.1±30.1 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.616

1.43

73.05

1

7

6

27

645

0

C1CC1COC2=C(C=CC(=C2)C(=O)N=C3C(=CN(C=C3Cl)O)Cl)OC(F)F

KHXXMSARUQULRI-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H14Cl2F2N2O4/c18-11-6-23(25)7-12(19)15(11)22-16(24)10-3-4-13(27-17(20)21)14(5-10)26-8-9-1-2-9/h3-7,9,17,25H,1-2,8H2

3-(cyclopropylmethoxy)-N-(3,5-dichloro-1-hydroxypyridin-4-ylidene)-4-(difluoromethoxy)benzamide

roflumilast N-oxide; 292135-78-5; Benzamide, 3-(cyclopropylmethoxy)-N-(3,5-dichloro-1-oxido-4-pyridinyl)-4-(difluoromethoxy)-; F08MQ6CZCS; DTXSID80433059; ROFLUMILAST METABOLITE M07; BYK22890; 3-(Cyclopropylmethoxy)-N-(3,5-dichloro-1-oxido-4-pyridinyl)-4-(difluoromethoxy)benzamide;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~596.36 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.96 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.96 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。