RWJ-67657

p38α (IC50 = 1 μM); p38β (IC50 = 11 μM)

RWJ-67657抑制经脂多糖 (LPS) 处理的人外周血单核细胞的 TNF-α 释放，IC50 为 3 nM，以及经超级抗原葡萄球菌肠毒素 B 处理的外周血单核细胞的 TNF-α 释放，IC50 为 3 nM。 13 nM[2] 是该值。在 MCF-7 细胞中，RWJ67657（10 μM；24 小时）可减少集落形成 [3]。

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1999年Johnson Pharmaceutical Research Institute报道合成了RWJ-67657（化合物39，表4），这是一种选择性的p38α和p38β抑制剂（IC50分别为1和11 μM）。RWJ 67657在p38γ和p38δ上没有活性，据报道，除了具有口服活性外，RWJ 67657还具有心脏保护和抗炎活性。RWJ-67657在所有p38依赖性体外测试系统中，比文献标准的p38激酶抑制剂SB 203580（化合物37，表4）的效力大约高10倍。

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单核细胞/巨噬细胞产生tnf - α依赖于丝裂原活化蛋白激酶p38。RWJ-67657（4-[4-（4-氟苯基）-1-（3-苯丙基）-5-（4-吡啶基）- 1h -咪唑-2-基]-3-丁基-1-醇）抑制脂多糖（单核细胞刺激）处理的人外周血单核细胞tnf - α的释放，IC（50）为3 nM；抑制超抗原葡萄球菌肠毒素B （T细胞刺激）处理的外周血单核细胞tnf - α的释放，IC（50）为13 nM。该化合物在所有p38依赖性体外系统测试中比文献标准p38激酶抑制剂SB 203580的效力高约10倍。RWJ-67657在体外抑制重组p38α和β的酶活性，但对γ和δ没有抑制作用，并且对其他多种酶没有显著活性。相比之下，SB 203580显著抑制酪氨酸激酶p56 lck和c-src （IC(50) = 5微米）。rwj67657不抑制T细胞产生白细胞介素-2或干扰素- γ，也不抑制T细胞对有丝分裂原的增殖。［２］

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在MCF-7细胞中，这种作用可以通过添加有效的p38抑制剂RWJ-67657来阻断（图2）。有趣的是，RWJ67657 （10 μM）也能抑制载体转染的（VEC + Veh）细胞，表明MCF-7细胞具有基础p38活性。
为了测试p38信号传导对雌激素介导的信号传导的生物学影响，将MCF-7细胞用载体或E2联合载体或RWJ-67657处理24小时。在接下来的2周内，E2处理的细胞每组生长近200个菌落，而E2和RWJ-67657处理的细胞每组生长不到115个菌落（图5）。仅用RWJ67657处理的细胞确实减少了集落形成，这与我们的发现一致，即MCF-7细胞具有基础水平的p38信号传导。这些数据表明，p38活性是MCF-7细胞正常生长所必需的，抑制p38活性会导致MCF-7细胞增殖减少。[3]

口服给药后，对小鼠（50 mg/kg 抑制 87%）和大鼠（25 mg/kg 抑制 91%）注射脂多糖会导致 TNF-α 产生减少 [2]。 RWJ-67657（50 mg/kg；口服；每天一次，持续 7 天）显示出强大的抗炎特性。糖尿病中风后，内皮祖细胞（EPC）移植和 RWJ-67657 给药共同促进血管生成和神经发生，既减轻炎症又增强 EPC 功能 [4]。

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RWJ-67657可抑制脂多糖注射小鼠（50 mg/kg时抑制87%）和大鼠（25 mg/kg时抑制91%）的tnf - α产生。基于这些良好的生物学特性，rwj67657可能用于治疗炎症性疾病。

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EPC移植和RWJ-67657单独给药均不能显著改善糖尿病卒中的预后，尽管RWJ显示出有效的抗炎作用。通过改善EPCs功能和减轻炎症，EPCs移植加RWJ在体内协同促进糖尿病卒中后血管生成和神经发生。此外，EPCs和RWJ-67657治疗后，糖尿病小鼠的白质重塑、行为评分、血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子的表达均显著增加。 结论：EPC移植联合RWJ-67657可加速糖尿病脑卒中患者的康复，其可能是由于血管生成因子和神经营养因子水平升高所致。[4]

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改善糖尿病小鼠EPC和RWJ-67657联合治疗的功能恢复[4]
根据修改后的神经严重程度评分（图3A）和第21天的足部缺陷测试（图3B），与对照小鼠或仅接受EPCs治疗的小鼠相比，接受EPCs和RWJ-67657/RWJ联合治疗的糖尿病脑卒中小鼠的神经功能缺陷明显减少。梗死区域在t2加权图像上显示为高强度（图3C）。在第7天，EPC移植加RWJ显著减少了缺血引起的同伤区域损失，实现了叠加效应（图3D）。

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糖尿病小鼠EPC和RWJ-67657/RWJ联合治疗后血管新生和神经新生的增加[4]
中风后，糖尿病小鼠与EPCs和RWJ共同治疗，在第7天显著增加梗死周围区域的微血管密度（图4A和B）。此外，RWJ和EPCs联合使用可显著增加第7天糖尿病小鼠心室下区双皮质素（一种未成熟神经元的标记物）阳性的细胞数量（图4C和4D）。EPC和RWJ联合治疗对血管生成和神经发生有显著的相互作用，这意味着联合治疗的效果是协同的。

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糖尿病小鼠EPC和RWJ-67657/RWJ共处理后轴突重塑增加[4]
体内DTI分析显示，与其他3组相比，EPC + RWJ治疗在第14天显著增加了同伤内囊（IC）的分数各向异性（FA）（图5A）。EPCs和RWJ处理的小鼠的ic中纤维计数显著增加（图5B）。在第14天，EPCs和RWJ同时处理的小鼠，髓鞘碱性蛋白+纤维一致性在同伤IC内显著增加（图5C和5D）。在EPCs和RWJ联合治疗的糖尿病小鼠白质重塑中，观察到类似的梗死体积减少的叠加效应。

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糖尿病小鼠EPC和RWJ-67657/RWJ共处理后细胞因子表达的改变[4]
Western blotting显示，在第7天，RWJ单独或RWJ加EPCs治疗的小鼠，p38 MAPK的磷酸化和促炎细胞因子（白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α）的表达显著降低（图6A-6C）。此外，在EPC移植和RWJ处理的小鼠中，VEGF表达水平均升高，具有叠加效应（图6D）。两种单药治疗对脑源性神经营养因子表达无影响。然而，在联合治疗组中观察到显著的相互作用，导致脑源性神经营养因子的表达高于预期的两种单一治疗的叠加效应。

体外激酶测定[3]
然后根据制造商的方案，在含有[γ-32P]的镁/ATP混合物存在下，用大约3-5 μg洗脱纯化的GST融合蛋白或200 ng纯化的MAPK活化蛋白激酶-2 （MAPKAPK-2）与0.06 U活化的p38α在30℃下振荡孵育30分钟。加入20 μl 2×十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液（含0.1 M苯基甲基磺酰氟、蛋白酶抑制剂鸡尾酒、磷酸酶抑制剂鸡尾酒和β-巯基乙醇）停止反应，煮沸5 min。样品用4-12% SDS- page分析，考马塞蓝染色监测表达，并进行放射自显影。

细胞增殖测定[3]
细胞类型： MCF-7 乳腺癌细胞
测试浓度： 10 μM
孵育时间： 24 小时
实验结果：集落形成减少。

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菌落试验[3]
MCF-7细胞在含5% DCC-FBS的DMEM中以每孔1000个细胞的速率被镀于六孔板中。第二天，用DMSO或RWJ-67657预处理10 μM，然后用DMSO或E2 （1 nM）预处理细胞。然后在显微镜下观察细胞的集落生长情况。将戊二醛（2.5%终浓度）直接加入孔中固定细胞。15-30分钟后，用0.4%的结晶紫溶液（含20%甲醇）洗涤并染色15-30分钟。取出结晶紫溶液，洗涤并干燥。计数细胞合流为50或更大的菌落。

动物/疾病模型： db/db小鼠（雄性，8周龄）[4]
剂量： 50 mg/kg
给药途径： 灌胃（po），每日一次，连续7天
实验结果： 糖尿病小鼠经EPC移植联合治疗后，血管生成和神经发生增加。

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缺血性卒中模型[4]
在db/db小鼠（雄性，8周龄）中诱导光血栓性缺血性卒中。术后24小时，经同侧颈内动脉注射1×10⁶个EPC。RWJ（50 mg/kg/天）每日灌胃一次，连续7天，首次给药于缺血性卒中诱导前30分钟。

[1]. Research advances in kinase enzymes and inhibitors for cardiovascular disease treatment. Future Sci OA. 2017 Aug 8;3(4):FSO204.

[2]. RWJ 67657, a potent, orally active inhibitor of p38 mitogen-activated protein kinase. J Pharmacol Exp Ther. 1999 Nov;291(2):680-7.

[3]. p38 mitogen-activated protein kinase stimulates estrogen-mediated transcription and proliferation through the phosphorylation and potentiation of the p160 coactivator glucocorticoid receptor-interacting protein 1. Mol Endocrinol. 2006 Ma.

[4]. Synergistic Effects of Transplanted Endothelial Progenitor Cells and RWJ 67657 in Diabetic Ischemic Stroke Models. Stroke. 2015 Jul;46(7):1938-46.

靶向蛋白激酶在设计治疗心血管疾病（CVD）的新药方面具有巨大的潜力。人们已为此付出了巨大的努力。然而，用于治疗CVD的激酶抑制剂存在诸多局限性，例如选择性差、渗透性差和毒性大。那么，在发现用于治疗CVD的有效激酶靶向药物方面，我们目前进展如何呢？自1986年发现星形孢菌素对蛋白激酶C的抑制活性以来，人们已尝试了多种药物设计技术。本综述旨在介绍几种新兴的直接激酶调节剂在治疗心血管疾病方面的应用现状，并探讨阻碍科学家发现治疗心脏病的新型激酶药物的挑战。[1]肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 是一种由活化的单核细胞/巨噬细胞和T淋巴细胞分泌的细胞因子，与多种疾病状态相关，包括类风湿性关节炎、炎症性肠病、感染性休克和骨质疏松症。单核细胞/巨噬细胞产生TNF-α依赖于丝裂原活化蛋白激酶p38。 RWJ-67657 (4-[4-(4-氟苯基)-1-(3-苯基丙基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-3-丁炔-1-醇) 能以 3 nM 的 IC₅₀ 值抑制脂多糖（一种单核细胞刺激物）处理的人外周血单核细胞释放 TNF-α，也能以 13 nM 的 IC₅₀ 值抑制葡萄球菌肠毒素 B 超抗原（一种 T 细胞刺激物）处理的外周血单核细胞释放 TNF-α。在所有测试的 p38 依赖性体外系统中，该化合物的效力约为文献标准 p38 激酶抑制剂 SB 203580 的 10 倍。 RWJ 67657 在体外抑制重组 p38α 和 β 的酶活性，但不抑制 γ 或 δ 的酶活性，且对其他多种酶无显著活性。相比之下，SB 203580 显著抑制酪氨酸激酶 p56 lck 和 c-src（IC50 = 5 μM）。RWJ 67657 不抑制 T 细胞产生白细胞介素-2 或干扰素-γ，也不抑制 T 细胞对有丝分裂原的增殖反应。RWJ 67657 可抑制脂多糖注射小鼠（50 mg/kg 剂量下抑制率为 87%）和大鼠（25 mg/kg 剂量下抑制率为 91%）口服给药后产生的 TNF-α。基于这些良好的生物学特性，RWJ 67657 可能具有治疗炎症性疾病的潜力。 [2]核激素受体，例如雌激素受体（ER），受特定激酶信号通路调控。本文证明，p38 MAPK 可刺激 MCF-7 乳腺癌细胞、Ishikawa 子宫内膜腺癌细胞和人胚肾 293 细胞中 ERα 和 ERβ 介导的转录。使用 p38 抑制剂 RWJ-67657 抑制这种增强作用，可阻断雌激素介导的转录和增殖。活化的 ER 部分通过募集 p160 类共激活因子来促进基因表达。由于尚未在 ERα 或 ERβ 上发现 p38 的直接磷酸化位点，我们推测 p38 可能靶向 p160 类共激活因子。我们首次利用药理学和分子生物学技术证明，p160 共激活因子糖皮质激素受体相互作用蛋白 1 (GRIP1) 在体外和体内均能被 p38 MAPK 信号级联磷酸化并增强其活性。S736 被鉴定为 p38 诱导 GRIP1 转录激活的必要位点。GRIP1 的 C 端也被证实包含一个 p38 反应区域。综上所述，这些结果表明 p38 通过靶向 GRIP1 共激活因子来刺激内质网介导的转录。[3]

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背景和目的：糖尿病患者的血管表型不成熟可能导致更严重的血管损伤和卒中后更差的功能预后，而利用内皮祖细胞 (EPC) 移植修复受损的功能性血管是可行的。然而，高血糖会诱导p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）活化，从而加速内皮祖细胞（EPC）的衰老和凋亡。本研究旨在探讨EPC移植联合p38 MAPK抑制剂治疗对糖尿病卒中预后的综合影响。
方法：缺血性卒中诱导后，将骨髓来源的EPC经动脉内注射至db/db小鼠体内。p38 MAPK抑制剂RWJ-67657（RWJ）连续7天口服给药，首次给药于卒中诱导前30分钟。分别于第0、1、7、14和21天评估功能结局。于第7天进行血管生成、神经发生、梗死体积和蛋白质印迹分析，并于第14天评估白质重塑情况。
结果：尽管RWJ显示出强大的抗炎作用，但单独进行EPC移植或RWJ-67657/RWJ联合给药均未显著改善糖尿病卒中预后。体内EPC移植联合RWJ给药通过改善EPC功能和减轻炎症，协同促进糖尿病卒中后的血管生成和神经发生。此外，在接受EPC和RWJ联合治疗的糖尿病小鼠中，白质重塑、行为评分以及血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子的表达均显著增加。
结论：EPC移植联合RWJ给药可加速糖尿病卒中的恢复，这可能是由于促血管生成因子和神经营养因子水平升高所致。[4]

C27H24FN3O

425.49736

425.19

C, 76.21; H, 5.69; F, 4.46; N, 9.88; O, 3.76

215303-72-3

3008319

white solid powder

1.1±0.1 g/cm3

611.8±65.0 °C at 760 mmHg

124℃

323.8±34.3 °C

0.0±1.8 mmHg at 25°C

1.599

5.18

50.94

1

4

8

32

611

0

C1=CC=C(C=C1)CCCN2C(=NC(=C2C3=CC=NC=C3)C4=CC=C(C=C4)F)C#CCCO

QSUSKMBNZQHHPA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H24FN3O/c28-24-13-11-22(12-14-24)26-27(23-15-17-29-18-16-23)31(25(30-26)10-4-5-20-32)19-6-9-21-7-2-1-3-8-21/h1-3,7-8,11-18,32H,5-6,9,19-20H2

4-(4-(4-fluorophenyl)-1-(3-phenylpropyl)-5-(pyridin-4-yl)-1H-imidazol-2-yl)but-3-yn-1-ol

RWJ67657 RWJ-67657 RWJ 67657

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~125 mg/mL (~293.77 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.89 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.08 mg/mL (4.89 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.89 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。