Salvianolic acid A   中文名称: 丹酚酸 A

Natural product; matrix metallopeptidase 9 (MMP-9)

Sal A/丹酚酸A对A2058和A375细胞的生长具有剂量反应性，并诱导细胞周期阻滞在G2/M期。值得注意的是，Sal A选择性地诱导Chk-2磷酸化而不影响Chk-1，从而降解Chk-2调控基因Cdc25A和Cdc2。然而，Sal A不影响Chk1-Cdc25C通路。 结论：丹酚酸，尤其是Salvianolic acid A/丹酚酸A，通过诱导Chk-2磷酸化，破坏G2/M检查点调节，有效抑制黑色素瘤细胞生长

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Salvianolic acid A/丹酚酸A降低黑色素瘤肿瘤细胞活力，抑制细胞增殖[1]
本研究以A2058细胞为模型，评估了丹酚酸，特别是Sal A和Sal B对黑色素瘤细胞活力的影响。图1A显示，暴露于浓度为10至100 μ M的Sal a 48小时后，A2058细胞活力显著降低17.7%至38.4%。相反，Sal B对存活率无显著影响。随后的分析显示，与对照组相比，Sal A使A2058细胞的增殖率降低至62.3%-77.6%，如图1B所示。值得注意的是，Sal A不会引发这些细胞的凋亡（图1C）。相反，Sal B对细胞增殖和死亡均无明显影响。这些结果表明，Sal A导致A2058细胞活力下降主要是由于细胞增殖受到抑制。

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Salvianolic acid A诱导A2058细胞G2/M期细胞周期阻滞[1]
鉴于Sal A对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用，我们进一步研究了其对细胞周期进程的影响。图2显示，与对照组相比，48小时的Sal a处理导致A2058细胞G1期群体减少，G2/M期群体增加，这表明在G2/M过渡时诱导细胞周期停滞。在A375细胞中记录了一致的结果，如补充图2所示。

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利用磷酸激酶阵列分析A2058细胞Salvianolic acid A靶蛋白[1]
为了确定Sal A在黑色素瘤细胞中的蛋白靶点，采用人磷酸激酶阵列分析了Sal A暴露后A2058细胞中关键信号蛋白的表达。图3显示，与未治疗的对照组相比，12小时的Sal a治疗上调了磷酸化p53和Chk-2的水平。值得注意的是，在Sal A治疗24小时后，Chk-2的磷酸化仍然明显，而磷酸化的p53水平与对照组没有显著差异。sala似乎选择性地调节p53和Chk-2的磷酸化状态，而不会广泛影响细胞信号网络中的其他磷酸化蛋白。

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Salvianolic acid A诱导黑色素瘤癌细胞Chk-2蛋白磷酸化[1]
为了证实磷酸激酶阵列的发现，Western blot分析了经Sal - a处理的黑色素瘤细胞的细胞裂解物。图4A的结果表明，化疗药物顺铂（CDDP）治疗24 h后显著改善了A2058细胞中Chk-1和Chk-2的磷酸化水平，而Sal A治疗仅轻微增加了磷酸化的Chk-1水平，但显著增加了A2058细胞中磷酸化的Chk-2水平。在A375细胞中检测到类似的磷酸化Chk-2上调（图4B）。此外，我们观察到，用Sal A处理A2058细胞6小时，可诱导细胞中Chk-2的磷酸化，并维持至少24小时（补充图3）。此外，在Sal A处理24小时后，评估磷酸化p53的表达。图4A、B显示p53磷酸化水平无显著改变，提示p53在Sal a调节黑色素瘤细胞周期中不起主要作用。

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丹酚酸A/Salvianolic acid A抑制黑色素瘤癌细胞Cdc25A和Cdc2蛋白的表达[1]
Chk-1和Chk-2被认为是Cdc25C和Cdc25A蛋白的抑制剂，参与下游信号转导事件。考虑到Sal A对磷酸化Chk-2的上调，我们进一步研究了其对Cdc25A和Cdc25C的影响。图5A、B显示，Sal A抑制了A2058和A375细胞系中Cdc25A的表达，而Cdc25C水平不变。考虑到Cyclin A、Cyclin B和Cdc2在G2/M相变中的关键作用，其中Cdc2由Cdc25A和Cdc25C调节。同时也评估了他们在暴露于Sal A后的表情。尽管细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B对Sal A的反应在黑色素瘤细胞类型中有所不同，但在A2058和A375细胞中均观察到Cdc2的一致下调。因此，研究结果表明，Sal A降低了Cdc25A和Cdc2蛋白的产生，暗示了黑色素瘤细胞周期调节的靶向破坏。

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干扰Cdc25A和Cdc2蛋白表达导致黑色素瘤癌细胞细胞周期阻滞[1]
通过研究Salvianolic acid A通过Chk2途径对Cdc25A和Cdc2降解的影响，探讨了Salvianolic acid A这一抑制化合物对黑色素瘤癌细胞存活和增殖的影响。此外，我们还研究了Cdc25A和Cdc2降解对细胞生长的直接影响。为了实现这一点，用Cdc25A或Cdc2 siRNA转染A2058细胞，导致细胞活力分别下降17.2%和26.1%（图6A）。此外，细胞增殖率分别降低13.9%和21.7%（图6B）。在A375细胞中也观察到类似的趋势（补充图4）。此外，我们还研究了抑制Cdc25A和Cdc2对细胞周期进程的影响。结果表明，尽管对细胞周期阻滞的影响不像Sal A处理那样显著，但抑制Cdc25A或Cdc2的表达均可显著诱导细胞在G2/M期阻滞（图6C）。

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Cdc25A和Cdc2在黑色素瘤癌组织中的表达[1]
上述细胞系研究表明，Salvianolic acid A/Sal A通过Chk-2通路抑制黑色素瘤癌细胞的生长。因此，我们通过分析Cdc25A和Cdc2的表达，进一步研究Chk-2在黑色素瘤癌变过程中的激活状态。购买的黑色素瘤癌组织阵列的分析结果显示，尽管癌组织中细胞内Cdc25A和Cdc2的表达有增加的趋势，但与正常细胞相比，没有显著差异（补充图5）。

在丹酚酸A/salvianolic acid A治疗组中，丹酚酸A（SAA）具有显着的积极作用。丹酚酸 A (20 mg/kg) 可显着延长大鼠在平板上的停留时间。丹酚酸A（10和20 mg/kg）显着降低了脑含水量，而与假手术组相比，模型组的脑含水量显着增加。与模型组相比，丹酚酸A（5、10、20 mg/kg）既能增加神经元数量，又能保持其正常结构。研究还表明，丹酚酸 A (20 mg/kg) 大大降低了 I/R 引起的 MMP-9 过度表达。 MMP-2 表达不受丹酚酸 A 的显着影响。通过以强亲和力将自身附着到 MMP 的催化结构域上，金属蛋白酶组织抑制剂 (TIMP) 可以降低 MMP 的活性 [1]。

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salvianolic acid A (SAA)是中药丹参（Salvia Miltiorrhiza Bge）的一种水溶性成分，数百年来一直用于治疗脑血管疾病。本研究旨在观察SAA对大鼠脑缺血再灌注损伤的脑保护作用，并探讨SAA是否通过抑制基质金属肽酶9 （MMP-9）来保护血脑屏障（BBB）。采用大脑中动脉闭塞（MCAO） 1.5 h后再灌注24 h的方法建立局灶性脑缺血再灌注模型。SAA以5、10和20 mg·kg−1的剂量静脉注射。SAA显著降低梗死面积和神经功能缺损评分。免疫组化分析显示，SAA处理还能改善海马CA1和CA3区神经元形态，增加神经元数量。Western blotting分析显示，SAA可下调MMP-9水平，上调组织金属蛋白酶1 （TIMP-1）水平，减轻血脑屏障损伤。SAA处理显著阻止了mmp -9诱导的ZO-1、claudin-5和occludin蛋白的降解。SAA还能抑制脑NF-κB p65的激活，降低炎症反应。结果表明，SAA可能通过抑制MMP-9和抗炎活性来减轻脑缺血再灌注损伤。[1]

磷酸激酶阵列分析[1]
A2058细胞以1 × 106的密度置于6 cm培养皿中，在全血清中培养过夜。然后将培养基替换为1%含DMEM的fbs，加入50µM Salvianolic acid A/Sal A 12-24 h。使用Proteome Profiler™Human Phospho-Kinase Array Kit提供的裂解缓冲液收集细胞裂解物。每个阵列加载500µg蛋白质，并根据制造商的说明进行后续分析。在Bio-Rad ChemiDoc XRS +系统上进行成像和膜扫描。

为了评估细胞活力，将2 × 104个细胞分三次接种于24孔培养板中，在全血清中培养过夜。后用1% FBS-containing介质代替细胞培养基,细胞治疗的0 - 100µM Salvianolic acid A/ Sal A或B Sal 24小时和48小时。水溶性四唑1 (WST-1)试剂添加到培养基和培养一个额外的4 h。随后,上层清液从每组的细胞被转移到一个96孔板,和吸光度在450 nm和650 nm(作为参考)测量使用EIA reader。

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细胞增殖和细胞死亡试验[1]
将溴脱氧尿苷（BrdU）掺入DNA分析细胞增殖情况。简单地说，细胞以1 × 104的密度在24孔培养板中接种三次，在全血清中培养过夜。随后，在含有1% FBS的培养基中，用0-100µM Salvianolic acid A/Sal A或Sal B处理细胞24小时。根据制造商的说明测量细胞的增殖情况。通过测定细胞释放的乳酸脱氢酶（LDH）来评估细胞死亡。将细胞以2 × 104的密度接种于24孔培养板中，重复3次，在全血清中培养过夜。用0-100µM的Sal A或Sal B处理细胞24小时后，收集细胞培养上清，按照制造商的说明测量细胞死亡。

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细胞周期分析[1]
细胞以1 × 106的密度置于6 cm培养皿中，在全血清中培养过夜。然后将培养基替换为1%含Dulbecco 's modified eagle medium （DMEM）的fbs，并分别加入50µM Salvianolic acid A/Sal A再放置24 h和48 h。细胞收集后，用80%乙醇固定细胞，并在-20℃下保存至少24 h。随后，细胞用20µg/mL碘化丙啶、0.1% Triton-X 100和0.2 mg/mL RNase A在37℃下染色15 min。采用CytoFLEX S流式细胞仪进行流式细胞术分析，分析细胞周期状态。

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Western Blotting [1]
细胞以1 × 106的密度置于6 cm培养皿中，在全血清中培养过夜。然后将培养基替换为1%含DMEM的fbs，并添加50µM 丹酚酸A/Sal A，再放置24小时。使用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀法（RIPA）缓冲液进行细胞裂解。收集细胞裂解液后，在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离每个细胞提取物中的40-100µg蛋白质。随后，将蛋白质转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，阻断，与各种一抗在4℃下孵育12小时。之后，辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育2小时。最后，使用Amersham增强化学发光（ECL）试剂盒进行酶检测，然后进行成像和膜扫描。

大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型的建立及丹酚酸A（SAA）给药[1]
将大鼠随机分为假手术组（n = 35）、缺血/再灌注（I/R）组（n = 40）、I/R + SAA（5、10 和 20 mg·kg–1）组（n = 40）和依达拉奉（5 mg·kg–1）组（n = 20）。丹酚酸A（SAA）的剂量选择基于我们之前的药代动力学研究。由于SAA在动物体内清除迅速，因此选择相对较高的剂量（5、10 和 20 mg·kg–1）以维持较高的血浆和组织浓度。SAA用生理盐水稀释。局灶性脑缺血/再灌注模型的建立方法如前所述，即先进行1.5 h的MCAO，然后进行24 h的再灌注。首先，将大鼠禁食过夜，但可自由饮用自来水。用10%水合氯醛（380 mg·kg⁻¹，腹腔注射）麻醉后，分离大鼠的右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。将一段长18 mm（直径：0.2 mm）的尼龙缝线插入ECA管腔，并推进至ICA以阻断大脑中动脉的起始部。阻断1.5小时后，拔出尼龙缝线进行再灌注。假手术组大鼠接受所有手术操作，但不插入缝线。再灌注后，立即向I/R + SAA组大鼠静脉注射不同浓度的丹酚酸A/SAA（5、10和20 mg·kg⁻¹）。阳性组接受5 mg·kg⁻¹的依达拉奉。假手术组和缺血/再灌注组接受等体积的生理盐水。再灌注12小时后，再次采用上述给药方法，以维持血浆中SAA和依达拉奉的较高浓度。手术过程中，将大鼠直肠温度维持在36.5～37.5℃之间。术后密切监测大鼠体温。实验结束后，将动物单独饲养，自由摄取食物和自来水。

[1]. Salvianolic acid A attenuates ischemia reperfusion induced rat brain damage by protecting the blood brain barrier through MMP-9 inhibition and anti-inflammation. Chin J Nat Med. 2018 Mar;16(3):184-193.

[2]. Inhibition of Melanoma Cell Growth by Salvianolic Acid A through CHK2-CDC25A Pathway Modulation. Front Biosci (Landmark Ed). 2024 Jun 12;29(6):213.

丹酚酸A是一种芪类化合物。
丹酚酸A正在临床试验NCT03908242（丹酚酸A片剂持续给药的I期研究）中进行研究。
据报道，丹酚酸A存在于丹参、牛至和其他有相关数据的生物体中。

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总之，本研究结果表明，丹酚酸A对缺血/再灌注损伤具有优异的神经保护作用，包括血脑屏障保护和抗炎作用。这些发现表明，丹酚酸A作为治疗缺血性卒中的先导化合物具有良好的治疗潜力。[1]

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背景：本研究探讨了丹参来源的丹酚酸对黑色素瘤细胞生长的影响。具体而言，我们评估了丹酚酸A（Sal A）调节黑色素瘤细胞增殖的能力。方法：我们使用人黑色素瘤A2058和A375细胞系，通过检测溴脱氧尿苷掺入和乳酸脱氢酶释放，研究了丹参酚酸A/Sal A对细胞增殖和死亡的影响。我们使用水溶性四唑盐-1 (WST-1) 线粒体染色和碘化丙啶染色评估了细胞活力和细胞周期进程。此外，我们使用磷酸化激酶芯片研究了细胞内激酶的磷酸化，并通过蛋白质印迹分析检测了Sal A对检查点激酶-2 (Chk-2) 的影响。
Sal A/丹参酚酸A和B是丹参的主要丹参酚酸衍生物，其中Sal A具有独特的抑制黑色素瘤生长的特性。此外，Chk2-Cdc25A-Cdc2信号通路在Sal A诱导的黑色素瘤细胞周期G2检查点调控中发挥作用。本研究结果阐明了丹参抗癌作用的相关通路，并提示Sal A可作为黑色素瘤的治疗药物。[2]

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Sal A的结构与丹参素类似，可通过在丹参素上添加邻香草醛制得。尽管丹参素在黑色素瘤方面的研究有限，但其抗癌特性已被广泛证实。丹参素不抑制B16F10黑色素瘤细胞的增殖，但可抑制VEGF、MMP-2和MMP-9的分泌，从而减弱细胞侵袭性。这些结果表明，丹参素对黑色素瘤的影响可能与细胞增殖无关，提示其作用机制与Sal A调控细胞周期G2检查点的机制不同。 Sal A 与丹参素在抑制黑色素瘤细胞侵袭方面的潜在相似性值得进一步研究。[2]

C26H22O10

494.4469

494.121

96574-01-5

5281793

Light yellow to yellow solid powder

1.6±0.1 g/cm3

858.7±65.0 °C at 760 mmHg

164-167ºC

292.9±27.8 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.790

4.23

184.98

7

10

9

36

798

1

C1=CC(=C(C=C1C[C@H](C(=O)O)OC(=O)/C=C/C2=C(C(=C(C=C2)O)O)/C=C/C3=CC(=C(C=C3)O)O)O)O

YMGFTDKNIWPMGF-UCPJVGPRSA-N

InChI=1S/C26H22O10/c27-18-7-2-14(11-21(18)30)1-6-17-16(4-9-20(29)25(17)33)5-10-24(32)36-23(26(34)35)13-15-3-8-19(28)22(31)12-15/h1-12,23,27-31,33H,13H2,(H,34,35)/b6-1+,10-5+/t23-/m1/s1

(2R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-[(E)-3-[2-[(E)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethenyl]-3,4-dihydroxyphenyl]prop-2-enoyl]oxypropanoic acid

Salvianolic acid A; 96574-01-5; SALVIANOLIC ACID; (R)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-(((E)-3-(2-((E)-3,4-dihydroxystyryl)-3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl)oxy)propanoic acid; Dan Phenolic Acid A; (+)-Salvianolic acid A; (2R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-[(E)-3-[2-[(E)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethenyl]-3,4-dihydroxyphenyl]prop-2-enoyl]oxypropanoic acid; Salvianolic-acid-A;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~83.33 mg/mL (~168.53 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.17 mg/mL (4.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 21.7 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.17 mg/mL (4.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 21.7 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。