SB-674042

OX₁ Receptor ( IC50 = 3.76 nM ); OX₂ Receptor ( IC50 = 531 nM ); OX₁ Receptor ( Ki = 1.1 nM ); OX₂ Receptor ( Ki = 129 nM )
SB-674042 is a selective, nonpeptide antagonist of the human orexin-1 (OX₁) receptor. Its binding affinity (Ki) was not directly provided in competition assays, but saturation and kinetic studies determined its equilibrium dissociation constant (Kd). [1]
The radiolabeled form, [³H]SB-674042, binds to the human OX₁ receptor stably expressed in CHO cells with a Kd of 3.76 ± 0.45 nM in a membrane-based scintillation proximity assay (SPA) format and a Kd of 5.03 ± 0.31 nM in a whole-cell assay format. [1]
In functional calcium mobilisation assays, SB-674042 acts as a competitive antagonist at the OX₁ receptor with an inhibition constant (Kb) of 1.1 ± 0.1 nM. It shows >100-fold selectivity over the human orexin-2 (OX₂) receptor (Kb at OX₂ = 129 ± 15 nM). [1]

SB-674042 ([3H])（0.2-24 nM；2 h）具有高亲和力，可作为放射性配体，适合标记在 CHO 细胞中稳定表达的人 OX1 受体[1]。 SB-674042（5 μM；4 ℃ 30 分钟，37 ℃ 3 小时）可降低 CB1 受体激动剂在共表达 orexin-1 和 CB1 受体的 HEK293 细胞中磷酸化 ERK1/2 的效力[2]。 SB-674042（1 μM；24 小时）可消除 INS-1 细胞中 Orexin-A（1 nM-1 μM；24 小时）引起的 mTOR 磷酸化增加，表明由orexin-A 诱导的 mTOR 通路激活依赖于激活的 OX1 受体[3]。 Western Blot 分析[3] 细胞系：INS-1 细胞 浓度：1 μM 孵育时间：24 小时；与 1 μM Orexin-A 一起作用 24 小时 结果：降低 Orexin-A 诱导的 mTOR 磷酸化水平。

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[³H]SB-674042 对表达于CHO细胞中的人OX₁受体表现出可饱和的高亲和力结合，在全细胞中特异性结合占总结合的70%以上，在膜制剂中占80%以上。在野生型CHO细胞膜中未检测到特异性结合。[1]
在使用FLIPR技术的钙动员实验中，SB-674042 能够有效且竞争性地拮抗食欲素-A（10 nM）在表达OX₁受体的CHO细胞中诱导的细胞内钙升高，Kb为 1.1 ± 0.1 nM。[1]
SB-674042 对一系列其他受体（包括5-羟色胺能、多巴胺能、肾上腺素能和嘌呤能受体）在浓度高达10 µM时均未显示显著亲和力，表明其对OX₁受体具有高选择性。[1]

SB-674042（0.3 nM/0.3 μL；icv；单剂量）可减少小鼠压力替代模型 (SMA) 中动物的情境和提示恐惧冻结反应[4]。动物模型：应激小鼠模型（雄性C57BL/6NHsd小鼠，22-26 g）[4] 剂量：0.3 nM/0.3 μL 给药方式：脑室内注射；让小鼠遭受 4 天的社会攻击（第 1-4 天） 结果：小鼠中 39.4% 的逃避表型和 60.6% 的停留表型。

[3H]SB-674042全细胞结合试验[1]
在96孔Packard培养板中培养过夜后，丢弃培养基，在25°C下将细胞在含有150 mM NaCl、20 mM HEPES和0.5%牛血清白蛋白（pH 7.4）的缓冲液中孵育60分钟。通过用不同浓度的[3H]SB-674042（0.2-24 nM）孵育细胞进行饱和研究；总测定体积为250μl。通过用0.1M NaOH裂解细胞并使用Bradford法（Bradford，1976）以牛血清白蛋白（BSA）为标准来测定蛋白质含量。
通过在加入[3H]SB-674042后1-60分钟测量[3H]SB-674042（3 nM）的特异性结合来进行关联动力学研究。对于解离研究，细胞首先与[3H]SB-674042（3 nM）孵育60分钟。然后在加入3μM SB-408124后2-120分钟测量特异性结合。通过用[3H]SB-674042（3 nM）和不同浓度的测试化合物孵育细胞进行竞争研究。用250μl冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞三次，终止所有测定。向每个孔中加入100μl Microscint 40，将平板在室温下放置2小时。然后使用Packard Topcount测量细胞相关放射性，计数时间为2分钟孔-1。

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[3H]SB-674042基于膜的SPA结合测定[1]
CHO-K1_OX1细胞膜（75μg ml−1）通过与小麦胚芽凝集素-聚乙烯基甲苯（WGA-PVT）闪烁邻近试验（SPA）珠（5 mg ml−l）在含有25 mM HEPES、2.5 mM MgCl2、0.5 mM EDTA和0.025%杆菌肽（pH 7.4）的缓冲液中在4°C下振荡1小时进行预偶联。珠膜悬浮液在300×g下离心，并重新悬浮在相同体积的室温试验缓冲液中。在96孔Packard Optiplate中，将100μl的珠膜悬浮液与[3H]SB-674042（5 nM）一起孵育，总测定体积为200μl，使最终蛋白质浓度为7.5μg孔-1。非特异性结合是在3μM SB-408124存在下剩余的结合。将分析板摇动10分钟，然后在室温下孵育4小时，然后在Packard TopCount闪烁计数器上计数（计数时间2分钟，孔-1）。
通过在[3H]SB-674042（0.1-20 nM）的浓度范围内孵育珠膜（相当于7.5μg蛋白质孔-1和2.5 mg珠ml-1）进行饱和研究。使用Bradford法（Bradford，1976）以牛血清白蛋白为标准测定蛋白质含量。通过在添加珠膜（相当于7.5μg蛋白质孔-1和2.5 mg珠ml-1）后1-30分钟测量[3H]SB-674042（5 nM）的特异性结合来进行关联动力学研究。对于解离研究，首先将珠膜与[3H]SB-674042（5 nM）一起孵育30分钟。然后在加入3μM SB-408124后2-120分钟测量特异性结合。通过用[3H]SB-674042（5 nM）和不同浓度的测试化合物孵育珠膜（相当于7.5μg蛋白质孔-1和2.5 mg珠ml-1）进行竞争研究。

细胞系：INS-1细胞
浓度：1 μM
孵育时间：24小时；与 1 μM Orexin-A 一起作用 24 小时
结果：降低 Orexin-A 诱导的 mTOR 磷酸化水平。

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培养大鼠胰岛素瘤INS-1细胞，并用不同浓度的食欲素-A、有或没有OX1受体选择性拮抗剂SB-674042或磷脂酰肌醇3-激酶/mTOR拮抗剂PF-04691502处理。使用INS-1细胞进行胰岛素释放实验、蛋白质印迹分析和统计分析。
结果：我们的结果表明，用食欲素-A处理细胞会以浓度依赖的方式增加OX1受体的表达和mTOR的磷酸化。用食欲素-A处理的细胞也观察到胰岛素分泌的增加。我们通过使用OX1受体选择性拮抗剂SB-674042或磷脂酰肌醇3-激酶/mTOR拮抗剂PF-04691502进一步证明，胰岛素分泌的减少取决于OX1受体和mTOR信号通路的激活，这消除了食欲素-A治疗的影响。
结论：我们的研究结果表明，食欲素-A/OX1受体通过激活AKT及其下游靶点mTOR来刺激胰岛素分泌。因此，食欲素可能在mTOR的参与下调节细胞存活的能量平衡[3]。

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全细胞放射性配体结合实验： 将稳定表达人OX₁受体的CHO-K1细胞接种于96孔板。进行饱和实验时，将细胞与一系列浓度（0.2-24 nM）的[³H]SB-674042在测定缓冲液中孵育；进行竞争实验时，使用固定浓度（3 nM）。非特异性结合在3 µM SB-408124存在下定义。孵育后，用冰预冷的缓冲液洗涤细胞，添加闪烁液，并使用微板闪烁计数器定量细胞相关的放射性。[1]
基于膜的SPA结合实验： 将来自CHO-K1_OX₁细胞的膜与小麦胚芽凝集素包被的闪烁亲近测定（SPA）珠预偶联。将珠-膜复合物与[³H]SB-674042（饱和实验0.1-20 nM；竞争实验5 nM）在测定缓冲液中孵育。非特异性结合用3 µM SB-408124确定。振荡孔板，孵育，然后在闪烁计数器上计数。[1]
钙动员实验（FLIPR）： 将稳定表达人OX₁或OX₂受体的CHO-DG44细胞接种于96孔板，并用钙敏感荧光染料Fluo-3 AM加载。洗涤细胞后，与或不与SB-674042（或其他拮抗剂）孵育30分钟。使用荧光成像板读数仪（FLIPR）监测添加10 nM食欲素-A前后的荧光信号。根据对食欲素-A诱导的钙反应的抑制曲线计算拮抗剂的效价（Kb）。[1]

应激诱导小鼠模型（雄性C57BL/6NHsd小鼠，22-26 g）
0.3 nM/0.3 μL
脑室内注射；小鼠接受4天的社交攻击（第1-4天）

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这些实验的主要处理方法是通过拮抗剂SB-674042抑制BLA Orx1R（0.3 nmol/0.3 μL，在第3天互动前1小时双侧BLA内注射），并与Orx1R刺激（通过OrxA + Orx2R拮抗剂实现）或短发夹基因敲低（在SAM互动前30天开始双侧BLA内转染）进行对比。考虑到给药时间的不同，这些处理方法根据预先设定的假设分别进行和分析。所有行为学测量均在动物活跃的暗周期进行，包括逃避行为（使用顶端隧道）、停留行为（在有陌生攻击者的SAM实验区内停留）、对逃生孔的注意力持续时间、逃避潜伏期（针对逃避组小鼠）、恐惧条件性冻结反应（在社交互动非条件刺激[US]出现之前，对音调[CS]和环境刺激的反应，以及在没有US的情况下作为条件反应[第5天的CR]进行测量）和食物摄入量。因此，处理组包括笼养对照组，以及对逃避组和停留组小鼠进行BLA内注射SB-674042（或载体、OrxA、OrxA + MK-1064、MK-1064）。此外，转基因处理组包括笼养对照组、BLA内注射AAV-Orx1R-shRNA组和BLA内注射AAV-scramble-shRNA组。采集脑组织和血液样本，利用RNAscope技术对基底外侧杏仁核（BLA）中HCRTR1、HCRTR2、钙结合蛋白（CALB1）、钙/钙调蛋白激酶2α（CAMKIIα）、谷氨酸脱羧酶（GAD1）和小白蛋白（PVALB）的基因表达进行可视化分析，并采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血浆中应激激素皮质酮的浓度。此外，还采用RT-qPCR技术检测BLA组织中HCRTR1、HCRTR2、PLCB1、MAPK1、MAPK3、BDNF和GAPDH（管家基因）的基因表达。所有实验设计和统计分析均基于预先设定的假设，采用双因素重复测量方差分析、双因素方差分析、单因素方差分析、回归分析和t检验，并在适当情况下进行事后分析。[4]

[1]. Characterisation of the binding of [³H]-SB-674042, a novel nonpeptide antagonist, to the human orexin-1 receptor. Br J Pharmacol. 2004 Jan;141(2):340-6.

[2]. Orexin-1 receptor-cannabinoid CB1 receptor heterodimerization results in both ligand-dependent and -independent coordinated alterations of receptor localization and function. J Biol Chem. 2006 Dec 15;281(50):38812-24.

[3]. Orexin-A Stimulates Insulin Secretion Through the Activation of the OX1 Receptor and Mammalian Target of Rapamycin in Rat Insulinoma Cells. Pancreas. 2019 Apr;48(4):568-573.

[4]. Orexin 1 Receptor Antagonism in the Basolateral Amygdala Shifts the Balance From Pro- to Antistress Signaling and Behavior. Biol Psychiatry. 2022 May 1;91(9):841-852.

1. 本研究表征了一种新型非肽类拮抗剂放射性配体[(3)H]SB-674042（1-(5-(2-氟苯基)-2-甲基噻唑-4-基)-1-((S)-2-(5-苯基-(1,3,4)恶二唑-2-基甲基)-吡咯烷-1-基)-甲酮）与稳定表达于中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞中的人食欲素-1 (OX(1)) 受体的结合情况。研究采用了全细胞测定和基于细胞膜的闪烁邻近测定 (SPA) 两种方法。2. [(3)H]SB-674042 的特异性结合在全细胞和细胞膜测定中均呈饱和状态。分析表明存在一个高亲和力结合位点，在全细胞和膜结合状态下，其K_d值分别为3.76±0.45 nM和5.03±0.31 nM，相应的B_max值分别为30.8±1.8 pmol/mg蛋白和34.4±2.0 pmol/mg蛋白。动力学研究也得到了类似的K_d值。3. 全细胞竞争实验表明，天然食欲素肽对OX₁受体的亲和力较低，其中食欲素A的亲和力约为食欲素B的五倍（K_i值分别为318±158 nM和1516±597 nM）。 4. SB-334867、SB-408124（1-(6,8-二氟-2-甲基-喹啉-4-基)-3-(4-二甲氨基苯基)-脲）和SB-410220（1-(5,8-二氟-喹啉-4-基)-3-(4-二甲氨基苯基)-脲）在全细胞（K(i) 值分别为 99±18、57±8.3 和 19±4.5 nm）和膜（K(i) 值分别为 38±3.6、27±4.1 和 4.5±0.2 nm）形式中均对 OX(1) 受体表现出高亲和力。 5. 钙动员研究表明，SB-334867、SB-408124 和 SB-410220 均为 OX(1) 受体的功能性拮抗剂，其效力与其在放射性配体结合试验中测得的亲和力相符，且对食欲素-2 受体的选择性约为 50 倍。6. 这些研究表明，[(3)H]SB-674042 是 OX(1) 受体的特异性高亲和力放射性配体。这种放射性配体的出现将成为研究OX(1)受体生理功能的宝贵工具。[1]在HEK293细胞中诱导表达后，人食欲素-1受体被靶向定位于细胞表面，但在暴露于肽类激动剂食欲素A后发生内吞作用。相比之下，人大麻素CB1受体的组成型表达主要导致其在细胞内呈点状分布，这与自发性、非激动剂依赖性内吞作用一致。在CB1受体存在的情况下表达食欲素-1受体，导致两种受体均表现出自发性内吞表型。单细胞荧光共振能量转移成像显示，这两种受体以异二聚体/寡聚体的形式存在于细胞内囊泡中。向仅表达CB1受体的细胞中添加CB1受体拮抗剂SR-141716A，导致受体重新定位至细胞表面。尽管SR-141716A对食欲素-1受体没有显著的亲和力，但在共表达CB1受体的细胞中，SR-141716A处理也能使食欲素-1受体重新定位到细胞表面。用食欲素-1受体拮抗剂SB-674042处理共表达食欲素-1和CB1受体的细胞，也导致两种受体重新定位到细胞表面。SR-141716A处理仅在共表达这两种受体的细胞中降低了食欲素A激活丝裂原活化蛋白激酶ERK1/2的效力。SB-674042处理也仅在共表达这两种受体时降低了CB1受体激动剂磷酸化ERK1/2的效力。这些研究引入了一种全新的药理学范式，即配体通过调节受体异二聚体，从而调控与其本身没有显著亲和力的受体的功能。[2]

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背景：应激通过对特定神经环路元件进行选择性分子修饰，产生不同的行为反应。食欲素（Orx）系统靶向基底外侧杏仁核（BLA）中该神经环路的关键组成部分。方法：我们评估了BLA内Orx1受体（Orx1Rs）在小鼠应激诱导表型表达中的作用。我们利用应激替代模型（一种可产生两种行为表型的社会应激范式），采用急性药理学抑制（SB-674042）和基因敲低（AAV-U6-Orx1R-shRNA）策略，对基底外侧杏仁核（BLA）内Orx1R的作用进行了表征。结果：在BLA中，我们观察到Orx1R（Hcrtr1）mRNA主要在CamKIIα+谷氨酸能神经元中表达，而在GABA能（γ-氨基丁酸能）细胞中表达较少。虽然BLA中Hcrtr1和Orx2受体（Hcrtr2）mRNA的表达存在轻微重叠，但我们发现这些受体通常在不同的细胞中表达。在表型形成后，拮抗基底外侧杏仁核（BLA）内的Orx1R可使行为表达从应激敏感型（停留）转变为应激耐受型（逃避），这种效应可通过基因敲低模拟。急性抑制BLA中的Orx1R也降低了停留型动物的情境恐惧和线索恐惧冻结反应。这种表型特异性的行为改变伴随着偏向性的分子转录，即Hcrtr2优于Hcrtr1，Mapk3优于Plcb1，以及Bdnf mRNA水平升高。结论：拮抗Orx1R可导致BLA内基因表达的功能重组，从而促进Hcrtr2、Mapk3和Bdnf表达的升高。这些结果共同为基底外侧杏仁核（BLA）内平衡促应激和抗应激反应的受体驱动机制提供了证据。[4]

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SB-674042的结构被鉴定为1-(5-(2-氟苯基)-2-甲基噻唑-4-基)-1-((S)-2-(5-苯基-(1,3,4)恶二唑-2-基甲基)-吡咯烷-1-基)-甲酮。[1]
放射性标记版本[³H]SB-674042（比活度27 Ci mmol⁻¹）被认为是首个选择性非肽类OX₁受体拮抗剂放射性配体。它是一种用于研究OX₁受体定位和功能的宝贵工具化合物。 [1]
结合动力学研究表明，[³H]SB-674042与OX₁受体的结合在30-60分钟内达到平衡，并且过量非竞争剂诱导的解离是单相的。[1]

C24H21FN4O2S

448.51254

448.137

C, 64.27; H, 4.72; F, 4.24; N, 12.49; O, 7.13; S, 7.15

483313-22-0

10204153

White to off-white solid powder

5.092

100.36

0

7

5

32

652

1

FC1=C(C2=C(C(N3[C@H](CC4=NN=C(C5=CC=CC=C5)O4)CCC3)=O)N=C(C)S2)C=CC=C1

HYBZWVLPALMACV-KRWDZBQOSA-N

InChI=1S/C24H21FN4O2S/c1-15-26-21(22(32-15)18-11-5-6-12-19(18)25)24(30)29-13-7-10-17(29)14-20-27-28-23(31-20)16-8-3-2-4-9-16/h2-6,8-9,11-12,17H,7,10,13-14H2,1H3/t17-/m0/s1

[5-(2-fluorophenyl)-2-methyl-1,3-thiazol-4-yl]-[(2S)-2-[(5-phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)methyl]pyrrolidin-1-yl]methanone

SB-674042; SB 674042; SB-674042; 483313-22-0; SB 674042; SB674042; [5-(2-fluorophenyl)-2-methyl-1,3-thiazol-4-yl]-[(2S)-2-[(5-phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)methyl]pyrrolidin-1-yl]methanone; CHEMBL2110363; DTXSID90436738; (S)-(5-(2-Fluorophenyl)-2-methylthiazol-4-yl)(2-((5-phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)methyl)pyrrolidin-1-yl)methanone; SB674042

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~25 mg/mL (~55.7 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (3.19 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 14.3 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (3.19 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 14.3mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (3.19 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 14.3 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。