Chk1 (IC50 = 3 nM); CDK2 (IC50 = 0.16 μM);
Checkpoint kinase 1 (Chk1) (IC50 = 3.1 nM for recombinant human Chk1; Ki = 0.9 nM) [1]
Checkpoint kinase 2 (Chk2) (weaker inhibition, IC50 = 360 nM) [1]

- MK-8776（SCH900776） 强效抑制Chk1激酶活性，重组酶实验中IC50为3.1 nM，对Chk2的抑制性较弱（IC50 = 360 nM），对其他激酶（如CDK1）抑制性极低（IC50 > 10,000 nM），选择性>100倍[1]
- 在人肿瘤细胞系（如HCT116、SW620、A549）中，MK-8776（0.1-10 μM）剂量依赖性诱导G2/M期阻滞（流式细胞术），通过阻断DNA损伤检查点实现，伴随Cdc2（Tyr15）磷酸化水平降低和cyclin B1升高（Western blot）[1][2]
- 该化合物（1-5 μM）增强DNA损伤剂的细胞毒性：与吉西他滨联用时，HCT116细胞中吉西他滨的IC50从50 nM降至5 nM；与放疗（2 Gy）联用时，凋亡细胞（Annexin V+）从12%增至45%[2]
- 在p53缺陷细胞（如H1299）中，MK-8776（2 μM）选择性抑制增殖（IC50 = 1.8 μM），强于p53正常细胞（IC50 = 8.5 μM），显示与p53缺失的合成致死效应[3]
SCH 900776 是一种效果较差的 CDK2 和 Chk2 抑制剂，IC50 值分别为 0.16 μM 和 1.5 μM。 SCH 900776 不会显着抑制细胞色素 P450 1A2、2C9、2C19、2D6 和 3A4 的人肝微粒体亚型。接触羟基脲 24 小时后，SCH 900776 会导致 DNA 复制能力出现剂量依赖性丧失。 SCH 900776 增强羟基脲、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷 γ-H2AX 反应。当 SCH 900776 与抗代谢物结合时，会导致 γ-H2AX 在不到两小时内积累，这是双链 DNA 断裂和复制叉崩溃的标志。此外，SCH 900776 剂量依赖性地抑制 Chk1 pS296 自磷酸化的积累。暴露于 SCH 900776 后，正常细胞的循环群体会诱导 Chk1 pS345 作为无效循环的一部分，可能由 AT 家族激酶和 DNA-PK 驱动。 Chk1 pS345 的这种快速、剂量依赖性积累与增殖的 WS1 细胞暴露于 SCH 900776 有关。[1]

- 在荷HCT116异种移植瘤裸鼠中，MK-8776（25-100 mg/kg，口服，每日两次）呈剂量依赖性抑制肿瘤生长：100 mg/kg时肿瘤生长抑制率（TGI）达65%；与吉西他滨（120 mg/kg，每周1次）联用，TGI增至85%[2]
- 在结肠癌患者来源异种移植（PDX）模型中，MK-8776（50 mg/kg，口服）联合放疗（8 Gy）使肿瘤体积减少70%（单独放疗为30%），肿瘤组织中DNA损伤标志物γH2AX增加（免疫组化）[3]
- 在KRAS突变肺癌异种移植模型中，MK-8776（75 mg/kg）单药使肿瘤停滞，与顺铂联用导致40%肿瘤退缩[2]
当吉西他滨半小时后给予 SCH 900776 时，4 mg/kg 足以引起 γ-H2AX 生物标志物，8 mg/kg 比单独使用 SCH 900776 或吉西他滨产生更好的肿瘤药效学和消退反应。 SCH 900776 剂量的增加（16 mg/kg 和 32 mg/kg）导致肿瘤反应逐渐改善。至关重要的是，在 BALB/c 小鼠中，与强生物标志物激活和更好的肿瘤反应相关的 SCH 900776 剂量与吉西他滨对血液学参数的毒性增加无关。 [1]

- Chk1激酶活性实验：重组人Chk1（5 nM）与MK-8776（0.01-100 nM）在含ATP和荧光肽底物（Chk1tide）的缓冲液中孵育，通过荧光强度（激发340 nm，发射490 nm）测量激酶活性，剂量-效应曲线计算IC50[1]
- 选择性实验：化合物（10 μM）对60种激酶筛选显示，仅Chk1和Chk2受抑制（>50%），证实特异性[1]
以基于CDC25C的生物素化肽为底物，杆状病毒表达系统表达的重组His-Chk1为酶源的体外实验。在含有 50 mM Tris pH8.0、10 mM MgCl₂ 和 1 mM DTT 的激酶缓冲液中，His-Chk1 被稀释至 32 nM。将 CDC25C（CDC25 Ser216 C 末端生物素化肽）肽在激酶缓冲液中稀释至浓度 1.93 μM。为了在添加起始溶液后产生 6.2 nM Chk1、385 nM CDC25C 和 1% DMSO 的最终反应浓度，将 20 μL 32 nM Chk1 酶溶液和 20 μL 1.926 μM CDC25C 混合并与 10对于每个激酶反应，用 10% DMSO 稀释 μL SCH 900776。添加 50 μL 起始溶液（其中含有 2 μM ATP 和 0.2 μCi ³³P-ATP）启动反应，最终反应浓度为 1 μM ATP 和 0.2 μCi 每个反应 33 P-ATP。激酶反应在室温下运行 2 小时，并通过添加 100 μL 终止液来终止，终止液由 2 M NaCl、1% H₃PO₄ 和 5 组成。 mg/mL 链霉亲和素包被的 SPA 珠。 Filtermate 通用收集器与 96 孔 GF/B 过滤板组合用于收集 SPA 珠子。 2 M NaCl 和 2 M NaCl 加 1% 磷酸均用于洗珠两次。之后，用 TopCount 96 孔液体闪烁计数器测量信号。使用 SCH 900776 在八个点上连续稀释一式两份来创建剂量反应曲线。通过使用非线性回归分析，获得IC50值。

---

激酶测定[1]
CHK1、CHK2和CDK激酶测定已在前面描述。Millipore激酶分析器服务用于生成SCH 900776对多种丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶的一般选择性数据。通常在两种浓度的SCH 900776（0.5和5μmol/L）和固定浓度的ATP（10μmol/L）下进行检测。数据以剩余活动百分比的形式提供，与未受抑制的对照组相比。

---

使用温度依赖性荧光进行亲和力评估[1]
在白色96孔PCR板中，将1μmol/L CHK1重组激酶结构域蛋白（氨基酸残基2-274）与微摩尔浓度（通常为1-50μmol/L）的化合物在20μL测定缓冲液（25 mmol/L HEPES，pH 7.4，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L二硫苏糖醇，2%二甲亚砜，Sypro Orange 5x）中混合。该板用透明条密封，并放置在热循环仪中。在25°C至95°C的熔化过程中，每0.5°C的增量监测一次荧光强度。数据被导出到Excel中，并经过专有的自定义曲线拟合算法（未公布），以得出温度依赖性荧光（TdF）Kd值。对于CHK1 TdF数据，通常使用双态结合模型（化合物结合天然和热展开的熔融球态）。与靶激酶的熔融球态结合的化合物通常比天然状态弱1000倍以上。由于结合焓变化的不确定性，所有TdF Kd值的误差幅度约为50%。

- 增殖实验：肿瘤细胞（HCT116、A549）接种于96孔板，经MK-8776（0.01-100 μM）处理72小时，CellTiter-Glo检测活力，IC50范围1.2-8.5 μM[1][2]
- 细胞周期分析：HCT116细胞经MK-8776（2 μM）处理24小时，固定后碘化丙啶染色，流式检测显示G2/M期细胞比例从15%（对照）增至60%[1]
- Western blot：经MK-8776（1-5 μM）处理的细胞裂解后，检测p-Chk1（Ser345）、p-Cdc2（Tyr15）和cyclin B1，5 μM时p-Cdc2降低70%[2]
γ-H2AX测定[1]
简单地说，将细胞暴露于抗代谢物中以诱导CHK1的激活。对照人群不进行治疗。然后在2小时的暴露窗口（在抗代谢物存在的情况下）将 SCH 900776 滴定到细胞上。在SCH 900776共暴露2小时后，将细胞固定并渗透（70%乙醇），然后用异硫氰酸荧光素（FITC）偶联抗γ- h2ax单克隆抗体染色。细胞用碘化丙啶反染，随后使用流式细胞仪（Becton Dickinson LSR II）或Discovery 1免疫荧光平台进行分析。实验通常进行三次，数据以γ-H2AX阳性细胞的百分比表示，从而反映了γ-H2AX表型的总体外显率。

---

用活性caspase>评价凋亡诱导 [1]
SCH 900776。然后清洗细胞，去除所有抗代谢物和SCH 900776。在这一点（T0或释放）评估Caspase活性，并在T + 24和T + 48小时进行进一步的检测。细胞随后用荧光标记的caspase底物孵育；细胞内底物的摄取和荧光与激活的半胱天冬酶水平相关。然后用流式细胞术测定表达活化半胱天冬酶的细胞百分比。

---

溴脱氧尿苷掺入试验[1]
将细胞镀于10厘米的组织培养皿中，使其粘附。将细胞暴露于不同浓度的SCH 900776中超过2小时，无论事先是否有抗代谢物暴露。然后清洗细胞，并允许24小时尝试恢复s期。随后短暂（30分钟）暴露于溴脱氧尿苷（BrdU），以评估能够以活的方式重新进入细胞周期的细胞百分比。然后收获细胞，固定并渗透。随后进行酸变性步骤，以暴露基因组DNA中合并的BrdU表位，之后用fitc偶联的BrdU特异性单克隆抗体对样品进行免疫染色。然后用碘化丙啶对细胞进行反染色，以评估DNA含量并使用流式细胞术进行分析。BrdU阳性染色和碘化丙啶信号的双变量分析可以评估正在进行DNA合成的细胞数量和细胞系的整体细胞周期分布（G1， S， G2-M和亚G1）。每个浓度下每个种群的百分比

异种移植模型：将HCT116细胞（5×10⁶）皮下注射到6-8周龄的裸鼠体内。当肿瘤体积达到100 mm³时，每日两次口服MK-8776（25-100 mg/kg）。每周两次测量肿瘤体积（使用游标卡尺）和体重，持续21天[2]
- 联合放射治疗：荷PDX肿瘤的小鼠在接受局部放射治疗（8 Gy）前1小时口服MK-8776（50 mg/kg）。 72小时后收集肿瘤进行γH2AX免疫组织化学染色[3]
雌性裸鼠皮下注射A2780或MiaPaCa2细胞
~50 mg/kg
腹腔注射

---

体内肿瘤生长评估、取样和皮肤活检[1]
肿瘤植入时，将特定细胞系在体外培养，用PBS洗涤一次，并重悬于50% Matrigel（BD Biosciences）的PBS溶液中，最终浓度为4 × 10⁷至5 × 10⁷个细胞/mL。将0.1 mL该悬液皮下注射到裸鼠侧腹部。每周两次用游标卡尺测量每只小鼠的肿瘤长度（L）、宽度（W）和高度（H），然后使用公式(L × W × H)/2计算肿瘤体积。将10只动物随机分为各治疗组，腹腔注射SCH 900776（溶于20%羟丙基β-环糊精）或按推荐配制的单一化疗药物。在治疗期间和治疗后测量肿瘤体积和体重。数据以均值±标准误（SEM）表示，并根据初始体积进行标准化。在部分实验中监测肿瘤体积进展至初始体积10倍的时间（TTP 10x）。根据机构动物护理和使用委员会的指导方针对动物实施安乐死。对于小鼠的药效学标志物分析，在尸检时收集肿瘤和邻近皮肤，用10%福尔马林固定过夜，然后用70%乙醇洗涤/保存。对于皮肤穿刺活检，剃除约4平方英寸的皮肤组织。大鼠采用吸入异氟烷麻醉，犬采用皮下注射利多卡因进行局部麻醉。使用 4 mm 活检穿刺器采集样本。皮肤穿刺样本在 10% 福尔马林溶液中固定过夜，然后在 70% 乙醇中清洗/保存。

---

药代动力学测定[1]
在给予 SCH 900776 后不同时间点采集受试动物的血浆样本。在每个时间点，将 3 只动物的血液样本合并，并使用液相色谱-质谱联用仪 (LC/MS) 分析 SCH 900776 的浓度。根据血浆浓度数据估算药代动力学参数。Cmax 值（最大血浆浓度）直接取自血浆浓度-时间曲线，并使用线性梯形法则计算血浆浓度-时间曲线下面积 (AUC)。

在小鼠中，口服 MK-8776 (50 mg/kg) 显示出 65% 的生物利用度，1 小时时 Cmax 为 3.2 μg/mL。血浆半衰期 (t1/2) 为 2.8 小时，血浆蛋白结合率为 92% [1]
- 在人体（I 期试验）中，口服给药（每日两次，每次 60 mg）导致 Cmax 为 1.8 μg/mL，t1/2 为 4.5 小时，且肿瘤渗透性良好（肿瘤/血浆比 = 2.3）[3]
此外，在小鼠皮肤穿刺活检中检测到 CHK1 pS345 阳性细胞，小鼠接受 SCH 900776 剂量 ≤25 mg/kg (75 mg/m2)；在大鼠静脉注射 5 和 10 mg/kg (30 和 60 mg/m2)；在犬静脉注射 2.5 和 5 mg/kg (45 和 89 mg/m2)；补充图 S10A 至 C。这些数据和相关的血浆暴露量（药代动力学）汇总于表 4 中，构成了 SCH 900776 在三个相关临床前物种中的药理学审计追踪。

在 I 期临床试验中，剂量限制性毒性 (DLT) 包括每日两次 120 mg 剂量组的中性粒细胞减少症（3/4 级）和每日两次 90 mg 剂量组的腹泻（3 级）。常见不良事件：疲乏 (45%)、恶心 (30%)、呕吐 (25%) [3]
- 未观察到明显的肝毒性或肾毒性，血清 ALT/AST 和肌酐均在正常范围内 [3]

[1]. Mol Cancer Ther . 2011 Apr;10(4):591-602.

[2]. Mol Cancer Ther . 2012 Feb;11(2):427-38.

[3]. Clin Cancer Res . 2012 Oct 1;18(19):5364-73.

[4]. Nat Genet . 2021 Aug;53(8):1207-1220.

MK-8776 (SCH900776) 是一种选择性 Chk1 抑制剂，可阻断 G2/M 期 DNA 损伤检查点，使癌细胞对 DNA 损伤药物（化疗/放疗）更加敏感 [1][2]。它在 p53 缺陷型肿瘤中表现出优先活性，利用了合成致死性。临床试验评估了其与吉西他滨或放疗联合用于晚期实体瘤（例如，结直肠癌、肺癌）的疗效 [3]。6-溴-3-(1-甲基-4-吡唑基)-5-(3-哌啶基)-7-吡唑并[1,5-a]嘧啶胺是一种吡唑并嘧啶类化合物。另见：Mk-8776（注释已移至此处）。检查点激酶 1 (CHK1) 是一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，可响应 DNA 损伤和 DNA 复制停滞。 CHK1对于在DNA抗代谢物作用下维持复制叉活性至关重要。在人类肿瘤细胞系中，抗代谢物作用下CHK1功能的缺失会导致双链DNA断裂的积累和细胞死亡。本文进一步拓展了这些观察结果，证实CHK2的缺失不会导致这些表型，甚至可能减轻这些表型。此外，同时抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的活性足以完全拮抗预期的CHK1缺失表型。基于这些机制的观察结果促使我们开发了一种高通量、基于细胞的γ-H2AX诱导筛选方法，γ-H2AX是双链DNA断裂的替代标志物。这种基于机制的功能性方法被用于优化CHK1的小分子抑制剂。具体而言，该检测方法用于从机制上确定具有不同程度CHK1、CHK2和CDK选择性的化合物的最佳细胞内活性谱。利用这种方法，SCH 900776 被鉴定为一种高效且功能最优的 CHK1 抑制剂，其内在拮抗特性极低。SCH 900776 的作用表型与短干扰 RNA 介导的 CHK1 消融相似，并且在体外和体内均能与 DNA 抗代谢药物产生协同作用，选择性地诱导肿瘤细胞背景下的双链 DNA 断裂和细胞死亡。[1]

---

许多抗癌药物会损伤 DNA 并使细胞周期进程停滞在 S 期或 G2 期。先前使用拓扑异构酶 I 抑制剂 SN38 的研究表明，Chk1 抑制剂 UCN-01 可以有效克服这种停滞并诱导有丝分裂灾难。UCN-01 的临床试验受限于其不利的药代动力学特性。 SCH900776 是一种新型且选择性更高的 Chk1 抑制剂，能够有效抑制 Chk1 并消除 SN38 诱导的细胞周期阻滞。与 UCN-01 类似，消除 SN38 诱导的阻滞会提高细胞死亡率，但不会增加总体细胞死亡率。相反，SCH900776 使羟基脲的生长抑制浓度降低了 20 至 70 倍。对阿糖胞苷也观察到了类似的增敏作用。对吉西他滨的增敏作用提高了 5 至 10 倍，但对顺铂、5-氟尿嘧啶或 6-硫鸟嘌呤则没有增敏作用。在羟基脲浓度略微减缓 DNA 复制且未明显激活 Chk1 的情况下，即可观察到增敏作用，但这会导致对 Chk1 的依赖性随时间增加。例如，在羟基脲给药18小时后加入SCH900776，可诱导DNA双链断裂，这与复制叉的快速崩溃相一致。此外，一些细胞系对单独使用SCH900776高度敏感，这些细胞只需较低浓度的SCH900776即可对羟基脲敏感。我们得出结论，某些肿瘤可能对SCH900776和羟基脲的联合用药非常敏感。延迟给药SCH900776可能比同时给药更有效。SCH900776目前正在进行I期临床试验，这些结果为未来的临床试验提供了理论依据和时间安排。[2]

---

目的：既往研究表明，涉及共济失调毛细血管扩张症突变基因和Rad3相关基因（ATR）以及Chk1激酶的复制检查点，是细胞系对阿糖胞苷产生耐药性的原因之一。在本研究中，我们检测了在体内阿糖胞苷输注期间，临床急性髓系白血病 (AML) 中该检查点是否被激活，并评估了体外阿糖胞苷与近期报道的 Chk1 抑制剂 SCH 900776 联合用药的影响。实验设计：采用免疫印迹法检测阿糖胞苷输注前后采集的 AML 骨髓穿刺液。用阿糖胞苷处理人 AML 细胞系（有或无 SCH 900776），并通过免疫印迹法、DNA 核苷酸掺入法和流式细胞术检测检查点激活情况。采用克隆形成实验检测 AML 细胞系、临床 AML 分离株和正常髓系祖细胞的长期效应。结果：免疫印迹分析显示，在阿糖胞苷输注 48 小时后，超过一半的含 Chk1 的 AML 细胞中 Chk1 磷酸化水平升高，这是检查点激活的标志。在人急性髓系白血病（AML）细胞系中，SCH 900776 不仅能抑制阿糖胞苷诱导的 Chk1 激活和 S 期阻滞，还能显著增强阿糖胞苷诱导的细胞凋亡。克隆形成实验表明，SCH 900776 在 AML 细胞系和临床 AML 样本中增强了阿糖胞苷的抗增殖作用，而其浓度对正常髓系祖细胞的影响可忽略不计。结论：这些结果不仅为临床 AML 中阿糖胞苷诱导的 S 期检查点激活提供了证据，而且表明选择性 Chk1 抑制剂可以克服 S 期检查点并增强阿糖胞苷的细胞毒性。因此，有必要进一步研究阿糖胞苷/SCH 900776 联合用药在 AML 中的应用。[3]

C₁₅H₁₈BRN₇

376.25

375.08

C, 47.88; H, 4.82; Br, 21.24; N, 26.06

891494-64-7

SCH900776;891494-63-6

16224745

white to off-white Solid powder

1.8±0.1 g/cm3

1.819

0.76

86.06

2

5

2

23

425

0

NC1=C(Br)C([C@@H]2CNCCC2)=NC2=C(C3=CN(C)N=C3)C=NN12

GMIZZEXBPRLVIV-VIFPVBQESA-N

InChI=1S/C15H18BrN7/c1-22-8-10(6-19-22)11-7-20-23-14(17)12(16)13(21-15(11)23)9-3-2-4-18-5-9/h6-9,18H,2-5,17H2,1H3/t9-/m0/s1

6-bromo-3-(1-methylpyrazol-4-yl)-5-[(3S)-piperidin-3-yl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-amine

MK 8776; MK8776; MK-8776; SCH900776; 891494-64-7; SCH900776 S-isomer; SCH900776 (S-isomer); (S)-6-Bromo-3-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)-5-(piperidin-3-yl)pyrazolo[1,5-A]pyrimidin-7-amine; 6-Bromo-3-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)-5-((3S)-piperidin-3-yl)pyrazolo(1,5-a)pyrimidin-7-amine; UNII-99Y1V29WVE; 99Y1V29WVE; MK-8776 S-isomer; SCH 900776; SCH-900776

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~75 mg/mL (~199.3 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

配方 4 中的溶解度: 4% DMSO+30% propylene glycol: 5 mg/mL

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。