WT TRKA (IC50 = 0.6 nM); TRKA G595R (IC50 = 2 nM); TRKC G623R (IC50 = 2.3 nM); WT TRKC (IC50 = 2.5 nM); TRKC G696A (IC50 = 2.5 nM)
TRKA (wild-type; IC₅₀ = 0.6–0.8 nM), TRKA-G595R (IC₅₀ = 2.0 nM), TRKA-G667C (IC₅₀ = 0.7 nM)
TRKB (wild-type; IC₅₀ = 0.5–1.0 nM), TRKB-G639R (IC₅₀ = 0.9 nM)
TRKC (wild-type; IC₅₀ = 0.3–1.0 nM), TRKC-G623R (IC₅₀ = 1.6 nM), TRKC-G696A (IC₅₀ = 0.8 nM) [1]

体外活性：LOXO-195 是第二代强效选择性 TRK TKI（酪氨酸激酶抑制剂），旨在克服在多个对其他 TRK 产生耐药性的患者中发现的由复发性激酶结构域（溶剂前沿和 xDFG）突变介导的获得性耐药TKI，例如拉罗替尼 (LOXO-101)。 TRKA 和 TRKC 的 IC50 分别为 0.6±0.1 nM，<2.5 nM。针对获得性突变的活性在基于酶和细胞的测定以及体内肿瘤模型中得到证实。作为概念的临床证明，对 larotrectinib 产生获得性耐药突变的前 2 名 TRK 融合阳性癌症患者首次在人体上接受了 LOXO-195 治疗，采用药代动力学评估指导下的快速剂量滴定。这种方法导致了快速的肿瘤反应，并延长了两名患者通过 TRK 抑制实现的疾病控制的总体持续时间。 LOXO-195 消除了获得激酶结构域突变的 TRK 融合阳性癌症的耐药性，这是所有现有 TRK TKI 的共同责任。这通过证明持续的 TRK 依赖性确立了序贯治疗的作用，并验证了针对已验证的致癌靶点加速开发下一代抑制剂的范例。激酶测定：使用 LanthaScreen™ Eu 激酶结合技术 测量每个纯化 TRK 激酶结构域的结合亲和力。简而言之，将每种供体铕抗体标记的重组TRK激酶结构域与Fluor 236探针和每种抑制剂的系列稀释液一起温育，并通过TR-FRET监测添加的抑制剂对探针结合的影响。在每种化合物的系列稀释液存在下，通过监测[γ-33P]-ATP 中的[33P]PO4 掺入聚-EAY 肽底物来测定酶活性。使用 KinaseProfiler™ 进行激酶分析。有关更多详细信息，请参阅补充方法。细胞测定：KM12细胞于2011年从NCI-Frederick Cancer DCTD肿瘤细胞存储库获得。CUTO-3细胞于2015年从科罗拉多大学癌症中心的Robert Doebele博士获得。MO-91细胞从Stephen博士获得Nimer，迈阿密大学西尔维斯特癌症中心，2015年。2015年从Eurofins OncoPanel细胞系集合 中选出84个NTRK基因重排阴性人类癌细胞系。NIH 3T3细胞由Array BioPharma于2007-2016年获得。 Eurofins 细胞系通过短串联重复序列 (STR) 分析进行验证。 KM12、CUTO-3 和 MO-91 细胞通过 Oncomine Focus Assay NGS 测定 确认每种融合体（例如分别为 TPM3-NTRK1、ETV6-NTRK3 或 MPRIP-NTRK1）的存在来进行验证。 ，实验后 12 个月内）。表达 ΔTRKA 和 ETV6-TRKC 变体的 NIH 3T3 细胞按照补充方法中所述进行工程改造。对于细胞磷酸化TRK测量，将细胞接种到96孔板中并在37°C下孵育过夜，与每种抑制剂的稀释系列一起孵育一小时，然后原位裂解每个孔单层并通过以下方法定量磷酸化TRKA水平：按照制造商的说明进行 ELISA 测定。对于细胞磷酸化 ERK 评估，将表达每种 FLAG 标记的 ETV6-TRKC 变体的细胞接种到 96 孔板中，用每种抑制剂处理一小时，然后进行甲醛固定、基于皂苷的悬浮液/透化、与磷酸化 ERK 抗体一起孵育、APC-抗-FLAG 和 PE 抗兔二抗以及流式细胞术分析。

---

• 抗增殖活性： 在表达TRKA-G595R（IC₅₀ = 4.7 nM）和TRKC-G623R（IC₅₀ = 5.6 nM）的Ba/F3细胞中抑制增殖，而一代TRK抑制剂对耐药突变体的IC₅₀ >1,000 nM。
• 作用机制验证： 通过Western blot，10–100 nM浓度下在KM12结直肠癌细胞（对一代抑制剂耐药）中抑制TRKA-G595R及其下游效应因子PLCγ1的磷酸化。
• 细胞活力： 在源自获得性耐药TRKC融合阳性乳腺类似分泌性癌（MASC）患者的PDX细胞中抑制活力（IC₅₀ = 14 nM） [1]

所有动物研究均按照 1996 年实验动物护理和使用指南 (NRC) 和 AAALAC-International 进行。将每种细胞系（2–5×10e6 个细胞）皮下注射到 7–9 周龄的雌性 nu/nu NCr 小鼠（Taconic，奥尔巴尼，纽约州）中，并使其生长至约 100–200 mm3（功效）或约 500mm3（功效）。 PK-PD）之前根据肿瘤大小进行随机化并通过口服强饲法使用每种抑制剂进行治疗。对于 PK-PD 分析，动物给药 3 天，然后安乐死、切除肿瘤并收集血浆。通过 ELISA 测定测定肿瘤裂解物中的磷酸化-TRK 水平，通过 LC-MS/MS 测定血浆抑制剂水平。为了进行功效分析，通过口服管饲给动物给药，并定期监测体重和肿瘤大小。有关更多详细信息，请参阅补充方法。

---

• 异种移植瘤药效： 口服给药（10 mg/kg，每日两次）使携带KM12（TRKA-G595R）移植瘤的小鼠肿瘤消退；14天后肿瘤缩小>80%且无体重减轻。
• PDX模型： 在源自耐药MASC患者的TRKC-G623R PDX模型中，Selitrectinib（25 mg/kg，每日两次）治疗3周后肿瘤显著消退（缩小89%） [1]

LanthaScreenTM Eu 激酶结合技术 用于测量每个纯化 TRK 激酶结构域的结合亲和力。总之，将每个供体铕抗体标记的重组 TRK 激酶结构域与 Fluor 236 探针和每种抑制剂的系列稀释液一起孵育。 TR-FRET 用于追踪添加的抑制剂对探针结合的影响。将 [γ-33P]-ATP 中的 [33P]PO4 掺入聚 EAY 肽底物中，同时连续稀释每种化合物，从而可以测定酶活性。使用KinaseProfilerTM 进行激酶分析。要了解更多信息，请参阅补充方法。

---

• 使用重组TRK蛋白（野生型及突变体）进行激酶抑制实验，ATP浓度为Km。反应体系与梯度稀释的Selitrectinib孵育后，通过ADP-Glo法检测残留激酶活性，根据剂量反应曲线计算IC₅₀。
• 在1 μM浓度下测试对228种激酶的选择性；仅TRK家族激酶抑制率>90% [1]

根据标准方案收获细胞、计数并以 3×10⁴ 细胞/孔（野生型细胞系）或5×10⁴ 细胞/孔（突变细胞系），100 μL/孔含有 10% FBS 的 DMEM 生长培养基。该过程可以评估细胞抑制效力。之后，将板在室温下孵育 30 分钟，然后在 37°C 和 5% CO₂ 下再孵育一晚。之后，用 TRK 抑制剂物质（例如 selitrectinib (LOXO-195)）在 37°C 和 5% CO₂ 下处理细胞一小时。对照孔中存在 1 微克 larotrectinib 或 LOXO-195，或单独的 0.25% DMSO。化合物孵育后，除去生长培养基，并向每孔中添加 60 μL 含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷裂解缓冲液以裂解细胞[1]。

---

• 细胞增殖： 表达TRK融合/突变的Ba/F3细胞经梯度稀释Selitrectinib处理72小时，采用ATP发光法检测活力，根据剂量反应曲线计算IC₅₀。
• Western blot： 药物处理2小时后裂解细胞（KM12、PDX来源），蛋白经SDS-PAGE分离并转膜，用抗pTRK、抗TRK、抗pPLCγ1及抗β-actin抗体检测，化学发光法量化磷酸化蛋白抑制程度 [1]

小鼠：将KM12细胞（5×10⁶个细胞）和NIH-3T3肿瘤细胞系（约2-3×10⁶个细胞）皮下注射到雌性nu/nu NCr小鼠的右侧腹部。根据肿瘤大小将动物随机分为三个给药组：KM12组5只，NIH-3T3 ΔTRKA变体组7只，PK-PD组3-4只。待肿瘤生长至约100-200 mm³或500 mm³后，分别以口服方式给药，拉罗替尼溶于100% Labrafac亲脂性载体，塞利替尼（LOXO-195）溶于1%羧甲基纤维素/0.5% Tween-80载体。所有动物均在6至8周龄之间购入，每组5只，适应一周后注射癌细胞。在9至12天内，动物接受以下剂量：每日两次注射赋形剂，每日两次分别注射30 mg/kg、100 mg/kg和300 mg/kg的selitrectinib（LOXO-195），以及每日一次注射60 mg/kg的larotrectinib。细胞植入后，并在整个给药过程中定期观察体重和肿瘤大小[1]。

---

• 异种移植疗效：将KM12细胞（TRKA-G595R）皮下植入无胸腺裸鼠体内。当肿瘤体积达到200 mm³时，将小鼠随机分为赋形剂组和selitrectinib组（10 mg/kg，溶于30% PEG-400/0.5% Tween-80/5%丙二醇溶液中），每日两次口服selitrectinib，持续14天。每两周测量一次肿瘤体积。
• PDX 研究：将 TRKC-G623R PDX 碎片植入 NSG 小鼠体内。当肿瘤体积达到 150 mm³ 时，开始使用塞利替尼（25 mg/kg，溶于相同载体）或载体对照，每日两次，持续 21 天 [1]

• 人体药代动力学：在一名儿科患者（3岁）中，每日两次服用50 mg后，血浆谷浓度为280 nM（超过TRKC-G623R的IC₅₀）。在成人中，每日两次服用150 mg时，血浆暴露量（AUC₀–₂₄）与剂量呈正比[1]

• 临床安全性：I期试验中最常见的不良事件（AE）为头晕（24%）、恶心（18%）和疲乏（12%）。在剂量高达150 mg BID时，未观察到剂量限制性毒性（DLT）[1]

[1]. A Next-Generation TRK Kinase Inhibitor Overcomes Acquired Resistance to Prior TRK Kinase Inhibition in Patients with TRK Fusion-Positive Solid Tumors. Cancer Discov. 2017 Sep;7(9):963-972.

Selitrectinib 正在临床试验 NCT03215511（LOXO-195 治疗既往接受过治疗的 NTRK 融合癌患者的 I/II 期研究）中进行研究。
Selitrectinib 是一种口服生物利用度高的选择性原肌球蛋白相关激酶（酪氨酸受体激酶；TRK）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，LOXO-195 可特异性靶向并结合 TRK，包括含有神经营养酪氨酸受体激酶 (NTRK) 1 型 (NTRK1)、2 型 (NTRK2) 和 3 型 (NTRK3) 序列的融合蛋白。这可阻止神经营养因子与 TRK 的相互作用和 TRK 的激活，从而诱导细胞凋亡并抑制过度表达 TRK 和/或表达 NTRK 融合蛋白的肿瘤细胞的生长。 LOXO-195靶向治疗后出现的特定点突变，这些突变会导致对其他TRK抑制剂产生获得性耐药；因此，LOXO-195能够克服对其他TRK抑制剂的获得性耐药。TRK是一类受体酪氨酸激酶（RTK），由神经营养因子激活，由NTRK家族基因编码。NTRK家族成员的突变体或融合蛋白的表达会导致TRK信号不受控制地激活，并在肿瘤细胞的生长和存活中发挥重要作用。

---

塞利替尼是一种新一代TRK抑制剂，旨在克服对第一代抑制剂（例如拉罗替尼）治疗后病情进展的患者中出现的获得性耐药突变（例如溶剂前沿xDFG基序突变）。
• 在3例携带耐药突变的TRK融合阳性癌症患者中证实了临床活性：儿童胶质瘤（TRKC-G623R）、MASC（TRKC-G623R）和结肠癌（TRKA-G595R），均达到RECIST疗效标准[1]

C20H21FN6O

380.43

380.176

C, 63.14; H, 5.56; F, 4.99; N, 22.09; O, 4.21

2097002-61-2

(3aR)-Selitrectinib;1350884-56-8; 2097002-61-2; 2097002-59-8 (RS-isomer)

129103609

White to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.751

2.27

75.4

1

6

0

28

593

2

FC1C([H])=NC2C([H])([H])C([H])([H])[C@@]([H])(C([H])([H])[H])N([H])C(C3C([H])=NN4C([H])=C([H])C(=NC4=3)N3C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@]3([H])C=2C=1[H])=O

OEBIHOVSAMBXIB-SJKOYZFVSA-N

InChI=1S/C20H21FN6O/c1-12-4-5-16-14(9-13(21)10-22-16)17-3-2-7-26(17)18-6-8-27-19(25-18)15(11-23-27)20(28)24-12/h6,8-12,17H,2-5,7H2,1H3,(H,24,28)/t12-,17-/m1/s1

(6R,15R)-9-fluoro-15-methyl-2,11,16,20,21,24-hexazapentacyclo[16.5.2.02,6.07,12.021,25]pentacosa-1(24),7(12),8,10,18(25),19,22-heptaen-17-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。