SGC-AAK1-1N

AAK1 (AP2 associated kinase 1) (IC50 = 270 nM; Ki = 9 nM)

在 HT1080 细胞中，SGC-AAK1-1 (1.25 μM) 剂量依赖性地激活 WNT 驱动的 BAR 活性，并显着降低 AP2M1 (T156) 磷酸化 [1]。 SGC-AAK1-1 通过抑制 AAK1 激酶活性来增加 β-连环蛋白依赖性转录和 β-连环蛋白稳定性 [1]。

结合位移测定[1]
AAK1、BMP2K、GAK和STK16的trf - fret配体结合置换试验按照前面的描述进行（Asquith等人，2018）。抑制剂的结合是通过结合置换试验来确定的，该试验测量了抑制剂从激酶结构域的ATP结合位点置换荧光示踪化合物的能力。抑制剂溶解在DMSO中，按16点，2倍连续稀释，一式两份分配到黑色多孔板中。每个孔含有0.5 nM或1 nM与链亲和素- tb -cryptate连接的生物素化激酶结构域蛋白，12.5 nM或25 nM激酶示踪剂236,10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.01% BSA, 0.01% Tween-20。每个数据点的最终测定体积为5 μL，最终DMSO浓度为1%。激酶结构域蛋白在大肠杆菌中与c端AVI标签（载体pNIC-Bio3， NCBI参考文献JN792439）融合表达，该标签被共表达的BirA生物素化，并使用与先前相同的方法纯化（Asquith et al., 2018）。在室温下孵育1.5小时，然后使用TR-FRET原型读取。残留范围为：AAK1: 31-396， BMP2K: 38-345, GAK: 12-347, STK16: 13-305col。数据归一化为0%和100%抑制控制值，并在GraphPad软件中拟合四参数剂量-反应结合曲线。使用Cheng-Prusoff方程和示踪剂的浓度和KD值（先前确定）将测定的IC50值转换为Ki值。

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Kinome筛选[1]
如前所述，KINOMEscan检测板由DiscoverX公司测量（Davis等人，2011年）。数据收集见表S2，并已存入Mendeley Data （https://doi.org/10.17632/cz9bx7d52c.1#file-bd678698-6718-4979-8b9e-1b0f7645884e）。激酶要么与T7噬菌体3融合产生，要么在HEK293细胞中与NF-κB融合表达，然后用DNA标记进行PCR检测18。一般来说，全长结构域用于小的单结构域激酶，而催化结构域结构域包括适当的侧翼序列用于多结构域激酶。简单地说，对于结合实验，链霉亲和素包被的磁珠用生物素化亲和配体处理生成亲和树脂。将配体珠阻断以减少非特异性结合，并洗涤以去除未结合的配体。结合反应是通过将激酶、配体亲和珠和测试化合物在DMSO中配制成100 × stock进行组合。将DMSO添加到缺乏测试化合物的对照分析中。在384孔板中进行初级筛选相互作用，而在96孔板中进行KD测定。实验板在25°C下振荡孵育1小时，并广泛洗涤亲和珠以去除未结合的蛋白。结合激酶在非生物素化亲和配体存在下，在25°C下振荡洗脱30分钟。用定量PCR法测定洗脱液中激酶的浓度。用11个连续三倍稀释的试验化合物和DMSO对照测定KD值。

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等温滴定量热法[1]
AAK1和BMP2K蛋白的产生如前所述（Sorrell et al., 2016）。在Microcal VP-ITC仪器上在25°C下进行等温滴定量热测量。为了使AAK1与SGC-AAK1-1相互作用，将该化合物在10 mM的DMSO中用ITC缓冲液稀释至22 μM，并直接加载到细胞中。AAK1在4°C下透析一夜，放入ITC缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP）中，最终浓度为218 μM，装入ITC注射器。热平衡后，连续注射8 μL，将AAK1滴定到细胞中，直到热图中观察到饱和。对BMP2K与SGC-AAK1-1相互作用重复相同的方法，将蛋白以288 μM的浓度加载到注射器中，并注射到32 μM的SGC-AAK1-1溶液中。ITC数据采用NITPIC （Keller et al., 2012）和SEDPHAT （Zhao et al., 2015）分析。最终拟合数据值见表S4。

转录报告基因测定[1]
所有荧光素酶报告基因试验和诱导细胞荧光报告基因试验均按先前描述进行（Walker et al., 2015）。简单地说，为了进行功能丧失实验，我们使用稳定表达BAR-Firefly荧光素酶报告基因和TK-Ren荧光素酶的细胞系，用RNAiMAX转染72小时。为了获得功能研究，将bar报告蛋白（20 ng）、TK-Ren （10 ng）和指示构建体（70 ng）用TansIT2020转染24小时。对于IncuCyte荧光报告细胞试验，使用IncuCyte活细胞分析系统对稳定的BAR-mCherry细胞进行处理和成像。荧光素酶读数用共转染TK-Ren（荧光素酶测定）归一化，诱导细胞分析归一化到内部mCherry对照。条件被镀成三份，标准化值在三份中平均，以产生数据和标准误差。除另有说明外，每次试验均以生物三次重复。采用双荧光素酶报告检测系统（Dual-Luciferase reporting Assay System）检测萤火虫荧光素酶和Renilla （Ren）对照。在EnSpire平板阅读器上读取平板。

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实时定量PCR [1]
按照之前的描述进行定量PCR (qPCR) （Walker et al., 2015）。简单地说，按照指示处理细胞，使用PureLink RNA Mini Kit收集RNA。按照试剂盒说明书，使用iScript cDNA Synthesis Kit从1ug RNA中生成cDNA。使用Fast SYBER Green Master Mix在Applied Biosystems 7400HT上按照制造商的规格进行qPCR。样品在384孔板上进行三份技术复制，在随后的板上进行三份生物复制。引物已发表（Walker et al., 2015），序列列于表S7。

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LRP5/6 DKO稳定细胞系的产生[1]
用靶向LRP5/6的Cas9和sgrna转染HEK293T细胞。序列如表S7所示。通过免疫印迹法确认缺失，并通过测序进行验证。

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表面生物素化[1]
对于表面生物素化测定，使用Pierce细胞表面蛋白分离试剂盒，并遵循制造商的规范。简单地说，将细胞培养到70%的融合度，用冷PBS洗涤3次，然后用nhs - ss -磺基生物素（0.25mg/mL）在4℃下进行30分钟的生物素化。游离生物素被淬灭，然后样品在裂解和超声前用冷TBS洗涤3次。将裂解物清除，然后与链霉亲和素珠在4°C带章动的条件下孵育1小时。用冷TBS洗涤珠粒4次，然后用添加DTT的LDS蛋白上样缓冲液在95°C下洗脱蛋白10 min。

[1]. WNT Activates the AAK1 Kinase to Promote Clathrin-Mediated Endocytosis of LRP6 and Establish a Negative Feedback Loop. Cell Rep. 2019 Jan 2;26(1):79-93.e8.

β-catenin依赖的WNT信号转导调控发育、组织稳态以及多种人类疾病。信号通过WNT-Frizzled/LRP受体复合物传递需要网格蛋白介导的内吞作用（CME）所需的蛋白质。然而，CME也通过受体复合物的内化和降解来负调控WNT信号传导。本文利用人类激酶组的功能获得性筛选，发现已知的CME增强因子AP2相关激酶1（AAK1）能够抑制WNT信号传导。相反，AAK1基因沉默或使用高效选择性抑制剂进行药理学抑制均可激活WNT信号传导。机制研究表明，AAK1促进LRP6从质膜清除，从而抑制WNT通路。时间进程实验支持转录解偶联的WNT驱动的负反馈环路。长期WNT信号处理可驱动AP2M1的AAK1依赖性磷酸化、网格蛋白包被小窝成熟以及LRP6的内吞作用。我们提出，WNT受体激活后，AAK1功能增强和网格蛋白包被小窝内吞作用（CME）会限制WNT信号的持续时间。[1] AAK1与多种神经系统疾病相关，包括神经性疼痛、阿尔茨海默病、帕金森病、精神分裂症和肌萎缩侧索硬化症（Kostich等，2016；Shi等，2014）。AAK1在树突分支和棘突发育中发挥作用（Ultanir等，2012），并且通过调控Neuregulin1/ErbB4，AAK1与精神分裂症相关（Kuai等，2011）。近期，AAK1抑制剂LX9211已完成治疗神经性疼痛的I期临床试验。本文报道了一种高效且选择性强的AAK1药理抑制剂（SGC-AAK1-1）的研发。SGC-AAK1-1展现出比I期临床试验药物LX9211更高的生化选择性，并证实具有细胞活性。因此，我们报道了目前研究AAK1/BMP2K通路及其相关生物学的最佳化学工具。与先导化合物25A类似，SGC-AAK1-1抑制了AAK1依赖的AP2M1磷酸化，并激活了WNT信号通路。展望未来，需要开展SGC-AAK1-1的体外和体内神经靶向研究，并将其与LX9211进行比较，以评估SGC-AAK1-1的治疗潜力。此外，尽管我们描述了AAK1在负调控WNT信号通路中的作用，但AAK1也抑制Neuregulin1/ErbB4并正向调控NOTCH通路（Gupta-Rossi等，2011；Kuai等，2011）。因此，AAK1抑制剂也可能调控这些信号级联，从而在NOTCH或Neuregulin1/ErbB4信号通路失调的疾病中发挥治疗作用。在癌症中，多个基因的突变和表达改变会促进WNT受体在质膜上的稳定性，导致WNT信号过度激活和肿瘤发生（例如，ZNRF3/RNF43和USP6；Hao等，2012；Koo等，2012；Madan等，2016；Ruffner等，2012；Schmid，2017）。 AAK1 表达或活性在癌症中是否受到抑制，以及这是否会导致 WNT 激活，还有待确定。[1]

C21H25N5O3S

427.519902944565

427.17

C, 59.00; H, 5.89; N, 16.38; O, 11.23; S, 7.50

2247894-32-0

134812845

Light brown to khaki solid powder

2.8

116

3

6

8

30

704

0

O=C(C1CC1)NC2=NNC3=C2C=CC(C4=CC=CC(NS(=O)(N(CC)CC)=O)=C4)=C3

UCBIQZUJJSVQHL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H25N5O3S/c1-3-26(4-2)30(28,29)25-17-7-5-6-15(12-17)16-10-11-18-19(13-16)23-24-20(18)22-21(27)14-8-9-14/h5-7,10-14,25H,3-4,8-9H2,1-2H3,(H2,22,23,24,27)

N-[6-[3-(diethylsulfamoylamino)phenyl]-1H-indazol-3-yl]cyclopropanecarboxamide

SGC-AAK1-1; SGC AAK1-1; SGC-AAK1 1; 2247894-32-0; SGC-AAK1-1; N-(6-(3-((N,N-diethylsulfamoyl)amino)phenyl)-1H-indazol-3-yl)cyclopropanecarboxamide; CHEMBL4452939; N-[6-[3-(diethylsulfamoylamino)phenyl]-1H-indazol-3-yl]cyclopropanecarboxamide; AAK1 inhibitor 1; SCHEMBL26677931; SGC AAK1 1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~116.95 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。