SHP2 (IC50 = 70 nM)
Protein Tyrosine Phosphatase, Non-Receptor Type 11 (SHP2/PTPN11) (IC50 = 0.071 μM) [2]
Protein Tyrosine Phosphatase, Non-Receptor Type 11 (SHP2/PTPN11) (specifically targeting SHP2 E69K mutant associated with leukemia) [3]
Protein Tyrosine Phosphatase, Non-Receptor Type 11 (SHP2/PTPN11) (allosteric binding to the interface of N-terminal SH2, C-terminal SH2, and PTP domains) [1]

体外活性：SHP099 与 SHP2 复合物的 X 射线共晶揭示了与受体的碱性胺和 Phe113 主链羰基的新相互作用。 SHP099 在 KYSE-520 模型中显示出对细胞增殖的抑制作用，IC50 为 1.4 μM。 SHP099 在 Caco-2 细胞中表现出高溶解度和高渗透性，没有明显的外排。 SHP099 同时结合 N 端 SH2、C 端 SH2 和蛋白酪氨酸磷酸酶结构域的界面，从而通过变构机制抑制 SHP2 活性。 SHP099 抑制 RAS-ERK 信号传导，从而抑制受体酪氨酸激酶驱动的人类癌细胞的增殖。激酶测定：生化测定。 SHP2 通过双酪氨酰磷酸化肽与其 Src 同源 2 (SH2) 结构域结合而被变构激活。后一个激活步骤导致 SHP2 自抑制界面的释放，从而使 SHP2 PTP 具有活性并可用于底物识别和反应催化。使用替代底物 DiFMUP 以即时荧光测定形式监测 SHP2 的催化活性。更具体地说，磷酸酶反应在室温下在 384 孔黑色聚苯乙烯板、平底、低凸缘、非结合表面（康宁，目录号 3575）中进行，最终反应体积为 25 μL，并采用以下测定缓冲液条件：60 mM HEPES，pH 7.2，75 mM NaCl，75 mM KCl，1 mM EDTA，0.05% P-20，5 mM DTT。使用一种测定法监测测试化合物（浓度范围为 0.003 – 100 μM）对 SHP2 的抑制，其中 0.5 nM 的 SHP2 与 0.5 μM 的肽 IRS1_pY1172(dPEG8)pY1222（序列：H2NLN(pY)IDLDLV( dPEG8)LST(pY)ASINFQK-酰胺)。在 25 oC 下孵育 30-60 分钟后，将替代底物 DiFMUP（Invitrogen，目录号 D6567，200 μM）添加到反应中，并在 25 oC 下孵育 30 分钟（2-593 为 200 μM，1-593 为 100 μM）。 525 构造）。然后通过添加 5 μL 160 μM bpV(Phen) 溶液（Enzo Life Sciences 目录号 ALX-270-204）猝灭反应。使用酶标仪（Envision，Perki-Elmer）监测荧光信号，激发波长和发射波长分别为 340 nm 和 450 nm。使用归一化IC50回归曲线拟合与基于对照的归一化来分析抑制剂剂量反应曲线。细胞测定：使用 AlphaScreen® SureFire™ Phospho-ERK 1/2 试剂盒 (PerkinElmer) 进行 p-ERK 细胞测定：KYSE-520 细胞（30,000 个细胞/孔）在 96 孔板培养物中生长过夜，并在 30 ℃下用 SHP2 抑制剂处理。浓度为 20、6.6、2.2、0.74、0.24、0.08、0.027 μM，37 °C 2 小时。通过添加由 SureFire 磷酸细胞外信号调节激酶 (p-ERK) 测定试剂盒 (PerkinElmer) 提供的 30 μL 裂解缓冲液 (PerkinElmer) 终止孵育。样品根据制造商的指示进行处理。使用 2101 多标记读数器 (Perkin Elmer Envision) 重复测量 p-ERK 的荧光信号。抑制百分比通过总 ERK 信号标准化并与 DMSO 载体对照进行比较。

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1. SHP099作为变构调节剂可稳定SHP2的自抑制构象，其结合于SHP2一个此前未被发现的变构结合口袋（该结合位点通过X射线晶体学确定）；基于结构的药物设计策略被用于优化SHP099对SHP2的抑制活性，并鉴定出若干新的蛋白-配体相互作用[1]
2. SHP099可同时结合于SHP2的N端SH2、C端SH2和蛋白酪氨酸磷酸酶结构域的界面，通过变构机制抑制SHP2的活性；该抑制剂可抑制RAS–ERK信号通路的激活，进而在体外抑制受体酪氨酸激酶驱动的人类癌细胞增殖[2]
3. SHP099对表达白血病相关SHP2 E69K突变体的TF-1细胞系生长具有选择性抑制作用；在无GM-CSF的培养基中，不同浓度的SHP099处理细胞5天后，可降低表达SHP2 E69K突变体的TF-1细胞存活率；处理2天后的免疫印迹分析证实其可调控SHP2相关信号通路[3]

SHP099 在异种移植模型中表现出剂量依赖性的肿瘤生长抑制作用。单剂量 30 和 100 mg/kg 后，在异种移植物中观察到药效标记物 p-ERK 的剂量依赖性暴露和调节。每日口服剂量 10 或 30 mg/kg 分别可抑制 19% 和 61% 的肿瘤生长。 100 mg/kg 即可实现肿瘤停滞。所有动物研究均根据诺华实验动物护理和使用指南进行。将雌性裸鼠皮下接种（3 x 106 个细胞）于汉克平衡盐溶液中含有 50% 无酚红基质胶（BD Biosciences）的悬浮液中，并与亲本 KYSE-520 细胞一起接种。对于 PK/PD 研究，一旦肿瘤达到大约 500 mm3，小鼠就被给予单剂量的载体对照或通过口服强饲法给予 1 剂。随后在单剂量化合物后的预定时间点对小鼠实施安乐死，此时收集血浆和异种移植物碎片分别用于测定1浓度和p-ERK调节。为了进行功效研究，每周两次对小鼠进行二维测径。一旦肿瘤达到大约 200 mm3，小鼠就被随机分配到治疗组。对于功效研究，小鼠被分配接受媒介物1（10、30或100 mg/kg，每日一次）或厄洛替尼（80 mg/kg，每日一次）口服灌胃。每周两次评估肿瘤体积和小鼠体重。为了评估异种移植蛋白裂解物中的 MAPK 途径调节，使用市售试剂盒（Meso Scale Discovery 目录号 K15107D）评估了总 ERK1/2 和磷酸 ERK1/2。该测定按照 Meso Scale Discovery 的建议进行，不同之处在于蛋白质裂解物需要孵育过夜。

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1. SHP099在小鼠肿瘤异种移植模型中展现出药效，可通过抑制RAS–ERK信号通路，抑制受体酪氨酸激酶驱动的肿瘤生长[2]

双酪氨酰磷酸化肽与 SHP2 的 Src 同源 2 (SH2) 结构域的结合会导致蛋白质的变构激活。在后一个激活步骤中，SHP2 的自抑制界面的释放使 SHP2 PTP 具有活性，并为底物识别和反应催化做好准备。在即时荧光测定形式中，通过使用替代底物 DiFMUP 观察 SHP2 的催化活性。更具体地说，使用 25 μL 的最终反应体积和以下测定缓冲液条件：60 mM HEPES、pH 7.2、75 mM NaCl、75 mM KCl、1 mM EDTA、0.05% P-20 和 5 mM DTT（磷酸酶）反应在室温下在 384 孔黑色聚苯乙烯板、平底、低凸缘、非结合表面（Corning，目录号 3575）中进行。用于测量测试化合物（浓度范围为 0.003 至 100 μM）对 SHP2 的抑制作用的测定涉及将 0.5 nM SHP2 与 0.5 μM 肽 IRS1_pY1172(dPEG8)pY1222（序列：H2NLN(pY)IDLDLV(dPEG8) 一起孵育)LST(pY)ASINFQK-酰胺)。在 25 oC 下孵育 30 至 60 分钟后，向反应中添加替代底物 DiFMUP（Invitrogen，目录号 D6567，200 μM），并在 25 oC 下进一步孵育 30 分钟（2-593 为 200 μM， 1-525 构建体为 100 μM）。随后，添加 5 μL 160 μM bpV(Phen) 溶液（Enzo Life Sciences 目录号 ALX-270-204）以淬灭反应。分别使用 340 nm 和 450 nm 的激发和发射波长，使用酶标仪（Envision，Perki-Elmer）监测荧光信号。使用基于对照的归一化拟合的归一化 IC50 回归曲线来分析抑制剂剂量反应曲线。

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1. 开展高通量筛选以发现可用于优化的SHP2抑制候选化合物；利用X射线晶体学确定SHP099在SHP2变构结合口袋中的结合位点；采用基于结构的药物设计方法，通过鉴定新的蛋白-配体相互作用来优化该抑制剂，以提升其对SHP2的抑制效力和选择性[1]
2. 开展酶活性实验以测定SHP099对SHP2的IC50值（测得为0.071 μM）；实验证实SHP099并非直接结合于SHP2的活性位点，而是通过稳定其自抑制构象，以变构机制抑制SHP2的酶活性[2]
3. 开展酶学实验评估SHP099对野生型及突变型（包括E69K）SHP2蛋白的抑制作用，证实其可选择性抑制与白血病相关的SHP2 E69K突变体；通过共晶结构（PDB: 5EHR）分析SHP099与SHP2的结合模式，鉴定出N-SH2（小麦色）、C-SH2（绿色）和PTP（蓝色）结构域中与相互作用相关的关键残基（D61、E69、A72、E76）[3]

使用 PerkinElmer 的 AlphaScreen® SureFireTM Phospho-ERK 1/2 试剂盒进行 p-ERK 细胞测定：在 96 孔板培养物中生长整夜后，KYSE-520 细胞（30,000 个细胞/孔）用 SHP2 抑制剂处理两小时37 °C，浓度为 20、6.6、2.2、0.74、0.24、0.08 和 0.027 μM。添加 30 微升裂解缓冲液 (PerkinElmer)（随 SureFire 磷酸细胞外信号调节激酶 (p-ERK) 测定试剂盒 (PerkinElmer) 提供）以结束孵育。样品按照制造商的说明进行处理。使用 Perkin Elmer Envision 2101 多标记读数器对 p-ERK 荧光信号进行两次测量。整个 ERK 信号用于标准化抑制百分比，然后与 DMSO 载体对照进行对比。

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1. 开展高通量筛选以发现可用于优化的SHP2抑制候选化合物；利用X射线晶体学确定SHP099在SHP2变构结合口袋中的结合位点；采用基于结构的药物设计方法，通过鉴定新的蛋白-配体相互作用来优化该抑制剂，以提升其对SHP2的抑制效力和选择性[1]
2. 开展酶活性实验以测定SHP099对SHP2的IC50值（测得为0.071 μM）；实验证实SHP099并非直接结合于SHP2的活性位点，而是通过稳定其自抑制构象，以变构机制抑制SHP2的酶活性[2]
3. 开展酶学实验评估SHP099对野生型及突变型（包括E69K）SHP2蛋白的抑制作用，证实其可选择性抑制与白血病相关的SHP2 E69K突变体；通过共晶结构（PDB: 5EHR）分析SHP099与SHP2的结合模式，鉴定出N-SH2（小麦色）、C-SH2（绿色）和PTP（蓝色）结构域中与相互作用相关的关键残基（D61、E69、A72、E76）[3]

10, 30, or 100 mg/kg qd by oral gavage.
Female nude mice were inoculated subcutaneously (3 x 106 cells) in a suspension containing 50% phenol red-free matrigel (BD Biosciences) in Hank’s balanced salt solution with parental KYSE-520 cells.

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1. Mouse tumour xenograft models were established using receptor-tyrosine-kinase-driven human cancer cells; SHP099 was administered orally (specific dosage and frequency not specified in the literature) to nude mice (both male and female were used), and tumour growth was monitored to evaluate the in vivo efficacy of the inhibitor, with the mechanism confirmed as suppression of RAS–ERK signalling in tumour tissues [2]

1. SHP099 is orally bioavailable, with no specific parameters (such as half-life, absorption rate, distribution, metabolism, excretion, or oral bioavailability percentage) provided [1]

[1]. J Med Chem . 2016 Sep 8;59(17):7773-82.

[2]. Nature . 2016 Jul 7;535(7610):148-52.

[3]. Leukemia . 2018 May;32(5):1246-1249.

1. SHP2 (encoded by PTPN11) is a nonreceptor protein tyrosine phosphatase involved in cell growth, differentiation (via MAPK signalling pathway) and programmed cell death pathway (PD-1/PD-L1); it is an oncoprotein associated with multiple cancer-related diseases and a potential immunomodulator, making its inhibition a promising therapeutic strategy [1]
2. SHP2 is the first reported oncogenic tyrosine phosphatase; activating mutations of SHP2 are linked to developmental pathologies (e.g., Noonan syndrome) and multiple cancer types (leukaemia, lung and breast cancer, neuroblastoma); SHP2 is ubiquitously expressed and regulates cell survival and proliferation mainly through activation of the RAS–ERK signalling pathway, and it also mediates PD-1 and BTLA immune checkpoint pathways; reduction of SHP2 activity suppresses tumour cell growth, validating pharmacological inhibition of SHP2 as a therapeutic approach for cancer treatment [2]
3. SHP2 E69K is a leukemia-associated mutant, and SHP099 exhibits selective inhibition of this mutant, highlighting its potential application in the treatment of leukemia driven by SHP2 E69K mutation [3]

C16H19CL2N5

352.26

351.101

C, 54.55; H, 5.44; Cl, 20.13; N, 19.88

1801747-42-1

SHP099 monohydrochloride;2200214-93-1;SHP099 hydrochloride;1801747-11-4

118238298

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

530.4±50.0 °C at 760 mmHg

274.5±30.1 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.626

3.97

81.1Ų

2

5

2

23

402

0

ClC1C(=C([H])C([H])=C([H])C=1C1C(N([H])[H])=NC(=C([H])N=1)N1C([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])C1([H])[H])N([H])[H])Cl

YGUFCDOEKKVKJK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H19Cl2N5/c1-16(20)5-7-23(8-6-16)12-9-21-14(15(19)22-12)10-3-2-4-11(17)13(10)18/h2-4,9H,5-8,20H2,1H3,(H2,19,22)

6-(4-amino-4-methylpiperidin-1-yl)-3-(2,3-dichlorophenyl)pyrazin-2-amine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.2 mg/mL (3.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.2 mg/mL (3.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 12.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1.2 mg/mL (3.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 12.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (1.90 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (1.90 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 6 中的溶解度: ≥ 0.13 mg/mL (0.37 mM) (饱和度未知) in 1% DMSO 99% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 7 中的溶解度: 10 mg/mL (28.39 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。